Аналіз рестрикційних фрагментів

Комп'ютерні програми, автоматичну визначають відмінності в розмірах фрагментів

Можливі помилки:

• Фрагменти такого ж розміру можуть бути в різних послідовностях

• Рестрикцій ні елементи дають такі ж самі розміри, але в різних локусах

Для автоматизації порівняння фрагментів рестрикції, були написані комп'ютерні програми що які використовують для безлічі фрагментів однакової довжини, а потім розраховують перекриття двох вставок. Навіть з гелем-електрофорезом з високою пропускною здантістю, інколи виникають помилки в цьому виді фізичного картування. Одна така помилка може надходити з двох фрагментів рестрикції, які мають однакову довжину, насправді знаходяться в різних послідовностях. Іншою проблемою є повторюючи елементи, які можна знайти в більшості геномів. Тому що послідовність цих елементів високо консервативна, вони, як правило, мають ті ж сайти рестрикції в них і таким чином утворюють той же розмір фрагмента при розрізанні ферментами рестрикції. Це може привести до помилкового висновку, що є дві вставки з перекриваючих частин хромосоми, коли насправді вони просто містять ті ж повторюючі елементи.

Гель для обробки зображень

На цьому слайді показаний приклад зчитування інформації програмою, яка визначає перекриття рестрикційних фрагментів.

FPC: аналіз фінгерпрінгів

На цьому слайді показаний приклад програми зчитування, яка виробляє контінги на основі відбитків пальців ( фінгерпрінгів) . Фактично рестрикційні фрагменти показані для трьох підкреслених клонів в правій панелі.

Побудова контінгів шляхом зонтування з кінців фрагментів

Ізолювання ДНК з обох кінців вставки

Ярлик і зонт геномної бібліотеки

Ідентифікація гібридних клонів

Повтори з кінців перекриваючих клонів

Інший підхід до побудови контігів, щоб ізолювати ДНК з обох кінців вставки. Кожен з кінців потім помічений і використовуються для дослідження геномної бібліотеки у векторі (BAC, PAC, і т.д.). Вставки, які гібридизують кінці зонда - ізольовані. Кінці нових ізольованих клонів потім використовують в якості зондів, і процес повторюється. Зображення на цьому слайді показані результати гібридизації з сумішшю кінців зондів в бібліотеці BACs в мікрочіпах.

Хромосомне переміщення ( ходьба)

Об'єднує зондування вставки кінців з рестрикційним картуванням

Спочатку знаходження гібридизованих колоній

• Потім створюють рестрикційні карти

Визначити клон з найкоротшим перекриттям

Зондувати його кінець

Повторити процес

При зондуванні кінців фрагментів вони поєднуються з перекриваючими рестрикційними фрагментами, в результаті процедуру часто називають "хромосомна ходьба.« Цей процес зазвичай починається з генетичного картування, яке ідентифікує фізичний маркер, як він пов'язаний з локусом інтереса (наприклад, локус для хвороби риса). Клон, що містить фізичний маркер потім виділяють, а його кінці використовуються для дослідження геномних бібліотек. Гібридизовані клони очищають і потім розрізають рестриктазами. Порівняння розмірів фрагментів рестрикції використовується для ідентифікації вставки з найменшим перекриттям (перекриття, яка знаходиться далі всього від вставка з фізичним маркером). Зонд з кінця цього клону, який поширює його в потрібному напрямку. Цей зонд гибрідизують геномною бібліотекою, і процес повторюється.