За і проти велико-вставочних векторів

Лямбда фаги і косміди

-Стабільні вставки

-Але розмір вставок надто малий для проектів великомасштабних секвенувань

YACs

-Найбільші розміри вставок

-Але важко з ними працювати

Вставка розмірів фага лямбда і косміди векторів (показано на схемі на слайді) занадто малі для масштабних проектів секвенування, навіть якщо їх вставки, як правило, дуже стабільні при розмноженні бактерій. Хоча можна було б собі уявити, що YACs, мають вставки великих розмірів , цей вектор можна обрати для секвенування геному, але з ними досить важко працювати.Проблеми полягають у виділенні штучних хромосом від нормальних хромосом дріжджів і проблеми зі стабільністю великих вставок.

Слайд 20

BACs ii PACs

Вектори, що найчастіше використовуються для великомасштабних секвенувань

Гарний компроміс між розміром вставки і легкістю використання

Ріст і ізоляція аналогічні до плазмід

Таким чином, хоч BACs і PACs не утримують великих вставок, але вони найбільш часто використовувальні вектори для великомасштабного секвенування. Вони являють собою гарний компроміс між розміром вставки і простоти використання. Зокрема, зростання та ізоляції цих векторів для клонування аналогічна для бактеріальних плазмід. Діаграма на цьому слайді - типовий вектор клонування BAC, показані різні сайти рестрикції для клонування і початку реплікації

Слайд 21

Контіг (от англ. contiguous) — набор перекрывающихся фрагментов ДНК, которые в совокупности представляют собой консенсусную область ДНК)

- це групи частин хромосомної ДНК, що перекриваються

-Утворюють суміжні клони

Для секвенування хочуть створити "мінімальний шлях доріжки" “minimum tiling path”

Контінг є найменшими вставками, які охоплюють області хромосоми

Перекриваються фрагменти ДНК, які охоплюють області хромосоми відомі як "контінги", термін, походить від "суміжних" “contiguous,”, продукуючи безперервну послідовність фрагментів ДНК. Для ефективної послідовності, метою є почати з найменшою кількістю фрагментів ДНК, які утворюють контіг, що охоплюють області хромосоми, потрібної послідовності. Цей набір фрагментів відомих як "мінімальний шлях доріжки".

Контінги перективаються рестриеційними фрагментами

• Вирізають вставки рестриктазами

• Шукають подібні рестрикційні фрагменти – відомі як фінгерпрінги

• Рівняються перекриттям фрагментів

• Подовжуються коли контінг збудований

Є кілька способів отримання контігів. Один з них, щоб скоротити всі доступні вставками (від косміди, BACs, PACs, абр YACs) з різними ферментами і порівняти структуру групп що генеруються. Коли кілька смуг по всій довжині, такого ж розміру в двох різних вставках, це означає, що два фрагменти перекриваються. Цей процес відомий як «відбитки пальців» фінгерпрінги. Послідовність цього процеса може бути повторена до контіга потрібна довжина, що генерується.???

Рестрикційне картування велико-вставочних клонів

Генерує велику кількість фрагментів

Вимагає високої роздільної здатністі відокремлення фрагментів

-- Можна зробити за допомогою геля-електрофорезу

Коли ферменти рестрикції використовуються для побудови контігівз велико-вставочних клонів (наприклад, BACs, PACs, чи YACs), велика кількість фрагментів зазвичай генеруються, в зв'язку з розміром вставки. Потенційна проблема в тому, що два фрагменти які трохи відрізняються розміром будуть сприйматися як однакового розміру. Щоб вирішити цю проблему, використовують гель-електрофорезу з високою роздільною здатністю (часто використовують гелі схожі на ті, які використовуються для секвенування) можуть бути використані для розділення фрагментів, так що невеликі відмінності в розмірах можуть бути виявлені.