Слайд 1

Глава 3

Основи складання генетичних карт і секвенування

основні принципи і етапи складання генетичних карт і секвенування( впорядкування) ДНК

Слайд 2

Зміст

● генетичне картування

● фізичне картування

● хромосомні аберації

● впорядкування детермінантних ДНК

● нові технології для картування і секвенування

Теми, що будуть висвітлені, включають генетичне, фізичне картування, хромосомні аберації, впорядкування детермінантних ДНК, нові технології для картування і секвенування.

Слайд 3

Навіщо картувати перед секвенуванням?

● найбільшою проблемою є великомасштабне секвенування

потокові технології можуть впорядкувати лише 600-800 одиниць* одночасно

● одне вирішення зробити фізичне картування, що перекриває ДНК-фрагменти

●(детермінувати) виділити послідовності з кожного фрагмента

●потім зібрати щоб сформувати суміжні послідовності

Для того щоб впорядкувати навіть малий геном необхідно визначити основну масу послідовної інформації. Якби був метод, що починає впорядкування на одному кінці хромосоми і рухається до іншого кінця хромосоми, то впорядкування генома було б набагато легшим, ніж в реальності є. Фактично, найдовший період, що може зчитати автоматизований секвенсер складає близько 800 основ. Одне вирішення проблеми, представляється можливим здатністю зчитати у порівнянні короткі періоди впорядкувань це зробити фізичне картування геному. Фізичне картування – це комплекс ДНК-фрагментів, що перекриваються. Тоді можна визначити послідовність кожного фрагменту і впорядкувати цю інформацію у довгу суміжну впорядкованість.

Слайд 4

Маплес секвенування

● Альтернативне вирішення: фрагментарний цілий геном

● Секвенування кожного фрагменту

● Збирання секвенсів, що перекриваються для формування суміжної впорядковуваності ( послідовності)

● Сфокусуватися на основах і техніках картування і секвенування

Альтернативним вирішення є розділити цілий геном на малі частини ДНК. Тоді кожен фрагмент ДНК секвенується і, основуючись на перекритті між малими фрагментами, може бути зібрана суміжна послідовність. Ці два методи – секвенування клон за клоном і збирання фрагментів у цілий геном - були використані конкуруючими групами для порівняння впорядкування людського геному. Вони детально описані у главі секвенування геному, яка включає велику шкалу стратегій і процедур секвенування.У кожній главі ми зупинимося на основних принципах картування і секвенування.

Слайд 5

Картування І

● Картування це визначення зв’язків між генами у хромосомах

● Так як дорога показує взаємозв’язок між містами на шосе

● Два типи картування: генетичне і фізичне

Термін « картування» використовується для визначення взаємозв’язку між генами і хромосомами. Воно аналогічне дорозі, що показує зв’язок між містами на шосе. Існує два види картування: генетичне та фізичне.

Слайд 6

Картування ІІ

Генетичне картування

● Основане на відмінностях частоти рекомбінацій між генетичними локусами

Фізичне картування

● Основане на відстані у основних парах між специфічними секвенсами, знайденими на хромосомі

● Найкраще, коли генетичне і фізичне картування поєднуються

Генетичне картування основане на відмінностях частоти рекомбінацій між генетичними локусами у хромосомі. Фізичне картування, з іншого боку основане на фізичній відстані ( зазвичай вимірюється у парах основ) між специфічними секвенсами ДНК на хромосомі. Кожен тип картування має специфічне використання, але коли комбінуються обидва, ми спостерігаємо високоінформативне зображення структури хромосоми.

Слайд 7

Генетичне картування І

● Основане на частоті рекомбінацій

● Чим далі дві точки знаходяться на хромосомі, тим більше рекомбінацій є між ними

● Через те, що частота рекомбінацій змінюється впродовж хромосоми, ми можемо спостерігати відповідну позицію в локусі.

Генетичне картування походить від частоти рекомбінацій між двома генами. Основний принцип є таким, що чим далі два гени один від одного на хромосомі, тим більше рекомбінацій може виникнути між ними. Через те, що частота рекомбінацій може, і власне, відрізняється впродовж певної хромосоми, генетичне картування дає порівняльну ( умовну) позицію між генами ( або локусами).

Слайд 8

Генетичне картування ІІ

● Генетичне картування вимагає те, що обмін може бути виконаним між двома спорідненими організмами.

● Організми можуть мати фенотипові відмінності, що походять від алель них відмінностях у двох чи більше локусах.

● Частота рекомбінацій визначається обчисленням F2прогенії у кожному фенотипі.

Виконання генетичного картування вимагає щоб обмін відбувся між двома спорідненими організмами, щ о відрізняються щонайменше двома локусами. Різні алелі у кожному з двох локусів маж нести різний фенотип. Частота рекомбінацій визначається аналізом F2 генерації. Чатота прогенії у кожному фенотипі може бути використана щоб порахувати ступінь зчеплення хромосом. Декілька прикладів подано у подальших слайдах.

Слайд 9

Генетичне картування приклад1

● Гени на двох різних хромосомах

● Незалежне розходження у мейозі

● Немає зчеплення

Якщо два гена або локуса на різних хромосомах, тоді протягом мейозу, очікується незалежне розходження генів. Цей стан відноситься до ситуації, коли немає зчеплення між двома локусами.

Слайд 10

Генетичне картування приклад 2

● Гени близько один до одного на одній хромосомі

● Зазвичай end-up разом після мейозу

● Тісно зчеплені

У випадку, коли два локуса прилягають на хромосомі, тодф частота виникнення рекомбінацій між ними буде надзвичайно малою. Таким чином, дві алелі з кожної батьківської будуть майже завжди залишатися на тій самій хромосомі протягом мейозу. Ця ситуація відноситься до дуже тісного зчеплення.

Слайд 11

Генетичне картування приклад 3

● Гени на одній хромосомі, але не дуже близько

● Виникне рекомбінація

● Частота рекомбінацій пропорційна відстані між генами

● Вимірюється у сантиМорганах

У перших двох прикладах, частота рекомбінацій була або в обох випадках, або в жодному. Більш інформативна ситуація, коли два гена локалізовані на одній хромосомі, але не настільки близько щоб виникло тісне зчеплення. У такому випадку рекомбінація виникне між двома локусами. Чим більша відстань буде між локусами, тим більша ймовірність виникнення рекомбінації між ними. Можна вимірювати частоту рекомбінації, рахуючи прогенію у поколінні F2, що мають фенотип асоційований з алелем першого гена одного з батьків, так само як і фенотип асоційований з алелем другого гена другого з батьків. Частота рекомбінацій, а отже і генетична відстань, між двома локусами вимірюється в санти Морганах.

Слайд 12

Генетичні маркери

● Генетичне картування між позиціями на хромосомах

● Позиції можуть бути генами

● Відповідальні за фенотип

● Наприклад: колір очей чи ознаки хвороби

● Позиції можуть бути фізичними маркерами

● Варіабельність ДНК послідовності

Коли почали визначати ДНК послідовність у 1980-х , було зрозуміло, що генетичне картування може бути виконане, використовуючи відмінності у ДНК послідовності у двох тісно споріднених організмів, у додаток до використання фенотипових відмінностей таких як колір чи ознаки хвороби.

Слайд 13

Фізичні маркери

Фізичні маркери – це ДНК послідовності, що відрізняються у двох споріднених геномах.

● Визначається як ДНК поліморфізм

● Зазвичай не у гені

● Приклади

• RFLP

• SSLP

• SNP

Існування відмінностей у ДНК послідовності між двома спорідненими організмами відомо як ДНК поліморфізм. Однією такою зміною може бути мутація у гені, що викликає ознаку таку, як зміна однієї пари основ відповідає за серпоподібну анемію. Однак, більшість ДНК поліморфізму не спостерігаємо протягом кодуючої ділянки гена. Замість того, їх знаходять у міжгенному просторі або впродовж інтронів. Причина в тому, що ці частини хромосоми мають тенденцію до швидшої зміни через те, що менше селективних ознак експресується. Прикладами фізичних маркерів є RFLPs, SSLPs, і SNPs. Кожен описаний у подальших слайдах.

Слайд 14

поліморфізм довжини обмеження фрагменту (RFLP)

Вирізання геномної ДНК від 2*х індивудуумів рестриктивним ферментом

Бігаюча південна пляма

Проби з різними частинами ДНК

Відмінності в послідовності створюють різні приклади групи

RFLP відповідає рестрикційному-фрагменту поліморфізму довжини. RFLP визначений шляхом розрізання геномної ДНК двох організмів з різними ферментами рестрикції. Розрізане ДНК потім розділяють за допомогою геля-електрофорезу і переносять в твердій в підставці в процесі, відомому як Саузерн-блот (що названий на ім'я його винахідника, Є. М.Саузерна). Зонти виготовлені з випадкових фрагментів ДНК, які потім гібридизували з плямою. Інформаційні зонти є ті проби, які показують іншу картину між двома геномами при розрізанні з особливим ферментом рестрикції. Ця різниця в рестрикційних ферментах породжені тим, що фермент є результатом мутації, які змінюють сайт розщеплення рестрикційного ферменту в одному з двох геномів.

Слайд 15

поліморфізм довжини одиночних послідовностей

Більшість геномів включає повторення 3 чи 4 нуклеотидів

Довжина повторюваних варіантів

Використання ПЛР з зовнішніми праймерами для повтору ділянок

На гелі видно різницю в довжині посилених фрагментів

SSLP виступає як проста послідовність довжини поліморфізму, також відомий як мікросателіт. Більшість геномів містять в своїх регіонах міжгенні повтори з трьох або чотирьох нуклеотидів, таких як CGACGACGACGA. Через прослизання під час реплікації, ці повтори часто розрізняються по однаковій довжині між родинними організмами. Щоб виявити різницю в довжині, праймери мають комплементарні послідовності в безпосередній близькості від повторів. Потім ПЛР використовується для ампліфікації цього регіону від з різних організмів, а відмінність в довжині виявляють за допомогою геля-електрофорезу.

Слайд 16

SNP

Однонуклеотидний поліморфізм

Однонуклеотидні відмінності у послідовності двох організмів

Виявлені секвенуванням

Наприклад, Між будь-якими двома людьми в середньому один однонуклеотичний поліморфізм на кожні 1000 пар основ

SNP виступає як одно-нуклеотидних поліморфізм. Цей термін відноситься до одно-нуклеотидних відмінностей між двома організмами, які зазвичай знаходять через високу пропускну здатність послідовності. Наприклад, між юудь якими двома людьми, тобто в середньому один SNP на 1000 пар основ. SNPs може бути в генах або в міжгенних регіонів. Їх використання у картування зазвичай вимагає секвенування області інтересу в перехресному потомстві.( in the progeny of the cross.)

Слайд 17

Фізичне картування

Визначення фізичної відстані між двома точками на хромосомі

Відстань у парах основ

Наприклад, між двома фізичними маркерами і геном

Необхідно фрагменти ДНК, що перекриваються

Необхідно вектори, що пристосовують великі вставки

Приклади: косміди, YACs i BACs

Фізичне картування, яке включає в себе визначення фізичної відстані в парах нуклеотидів між двома точками на хромосомі, має безліч застосувань, у тому числі виділення генів хромосомного переміщення і забезпечення основи для великомасштабного секвенування. У першому випадку метою є знайти ген, починаючи з фізично зв’язаного маркера. Це завдання вимагає знайти безліч фрагментів ДНК, що перекриваються, які охоплює відстань між маркером і геном. Щоб зробити цей процес більш ефективним, вчені розробили вектори, які можуть вмістити великі фрагменти ДНК. Приклади таких векторів для клонування: косміди, YAC, і BACs. Ці вектори описані на наступних слайдах

Слайд 18.

Вектори з великою вставкою

Лямбда-фаг

Розмір пластини: 20-30 кб

Косміди Розмір пластини: 35-45 кб

BACs і PACs (бактеріальні та P1 штучні хромосоми відповідно)

Розмір пластини: 100-300 кб

YACs (штучні хромосоми дріжджів)

Розмір пластини: 200-1000 кб

Серед перших велико-вставочних векторів був вектор фага лямбди, який може зайняти максимальний розмір вставки між 20 і 30 тисяч пар нуклеотидів. Косміди поєднують здатність вектора фага упаковувати ДНК і очистні властивості плазмід. Їх максимальний розмір вставки між 35 і 45 тисяч пар нуклеотидів. Бактеріальні та P1 штучні хромосоми (BACs and PACs) можуть бути використаний для вставки в 100-300 діапазоні кілобаз , в той час як штучні хромосоми дріжджів (YAC) може містити до мегабаз ДНК.

Слайд 19