57. Оценка системы фагоцитов

Методы идентификации.

I. Количественные тесты.

Общий анализ крови.

Число CD 14+ клеток (число моноцитов и косвенные данные о нейтрофилах).

II. Функциональные тесты.

Определение фагоцитарного числа – процент клеток вступивших в фагоцитоз. В качестве объектов фагоцитоза используют частицы латекса или не патогенные штаммы возбудителей (часто стафилококки).

Оценку производят через 30, 60, 90, 120 минут; чаще через 30, 60, 120 минут.

Позволяет оценивать степень завершённости фагоцитоза и фагоцитарный индекс (среднее число бактерий поглощенных клеткой).

Индекс завершённости фагоцитоза (ИЗФ) в норме около 1.

Помогает в диагностике ряда вторичных иммунодефицитов, при длительно заживающих ранах, гнойно-септических осложнениях (хронических).

Тесты оценки бактерицидности.

НСТ – тест – тест восстановления нитросинего тетразолия – отражает направленность кислород зависимой бактерицидности в клетке.

Суть: нейтрофил поглощает НСТ и восстанавливает его в фармозан, выявляющийся в виде гранул темно-синего цвета.

Интенсивность кислородного взрыва можно оценить с помощью хемолюминесценции, позволяя регистрировать кислород зависимую бактерицидность в виде электрических импульсов.

Тесты по определению продукции миелопероксидазы и лизосомальных катионных белков.

НСТ – тест – в норме составляет 8 – 10% (спонтанный), т.к. бывает спонтанный и стимулированный. Стимулируют зимогеном, результаты должны превышать спонтанный, в среднем составляя 70%.

Резкое снижение свидетельствует о низкой бактерицидности.

Показания: миелопероксидазы и ЛКБ –70 – 95%

Фагоцитарное число – 45 – 79%

58. Методы оценки т-лимфоцитов

Методы идентификации Т-лимфоцитов.

Функциональные и количественные тесты.

Для определения количества Т-лимфоцитов используются несколько методов:

1. метод розеткообразования с эритроцитами барана – устарел.

2. с применением моноклональных АТ.

3. иммунофлюоресценция в т.ч. проточная.

4. цитофлюоресценция.

5. ИФА.

Функциональные тесты.

Важны т.к. не всегда снижение количества свидетельствует об их функциональной недостаточности и наоборот.

РЕАКЦИЯ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ (РБТЛ).

В асептических условиях из вены берется 5 – 10 мл крови в пробирку, содержащую 100 – 200 ЕД. гепарина. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при t 37°С для осаждения эритроцитов, которое может быть ускорено добавлением декстрана, желатина и др. После инкубации в термостате надосадочный спой плазмы, обогащен­ный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную про­бирку. Определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоцитов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД. пенициллина и 100 ЕД. стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 1.000.000 – 2.000.000 лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды.

Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стериль­ные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного аллергена и пропускают газовую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и помещают в термостат при t 37°С на 5 – 7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобож­дается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие ЛФ, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги.

Интенсивность РБТЛ оценивается различными методами.

Морфологический метод заключается в подсчете в окрашен­ном мазке активированных клеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического аллергена может достигать 35%.

Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета, включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченного ^ЗН-тимидина, добавляемого в культуральную среду.

Достоверность РБТЛ проверяется контрольными исследова­ниями с культурой исследуемых ЛФ без добавления аллергена (для выявления спонтанной Б.л.) и с культурой ЛФ здоровых доноров, инкубируемой с соответствующим аллергеном.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ (РТМЛ)

Реакция ставится с целью выявления лимфоцитов, сенси­билизированных к предполагаемому антигену. Если антиген является специфичным в данной ситуации, то диффузия лимфоцитов будет минимальной. Такая положительная проба свидетельствует о наличии фактора ингибиции.

Методика исследования.

Необходимые материалы и оборудование: среда 199, 10% раствор желатина, 5% инактивированная сыворотка человека, 0.35% раствор NaOH, тирс-буфер (рН 7,65), 0,4% раствор ЭДТА, центрифужные пробирки, центрифуга, термостат, пласт­массовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0,7 мм.

Венозную кровь смешивают с антикоагулянтом ЭДТА (рН 7.4). Эритроциты осаждают 10% раствором желатина, добав­ленным к крови из расчета 1:9. После отстаивания и осаждения эритроцитов при комнатной температуре в течение 40мии плазму, обогащенную лейкоцитами, осаждают центрифуги­рованием при 1000 об/мин в течение 7 мин. Осадок лейкоцитов ресуспензируют в 0,5 мл среды 199 с 5% инактивированной сывороткой человека, добавив 4,5 мл смеси, состоящей из 9частей 0,35% раствора NaOH и 1 части тирс-буфера (рН 7,65), для растворения эритроцитов. Лейкоциты отмывают и снова ресуспензируют в среде 199, содержащей 5% челове­ческой инактивированной сыворотки и 0,4% ЭДТА, затем готовят густую лейкоцитарную взвесь, которой заполняют пластмас­совые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6-0.7 мм

Капилляр, заполненный лейкоцитарной взвесью, прикрепляют на дно лунки глубиной 20 мм, диаметром 15 мм, которая затем заполняется средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин со стрептомицином по 10 000 ЕД на 1 мл среды и 5% инактивированной прогреванием при 56°С в течение часа человеческой сыворотки 1; можно также использовать сыворотку лошади, кролика, оспа и др.

Лунки диаметром 1,5 мм расположены в пластинке из ор­ганического стекла (4 ряда по 4 лунки). Заполненные средой и капиллярами с исследуемыми лимфоцитами лунки закрывают крышкой, края которой смазывают вазелином для герметизации. Всю систему помещают в термостат при 37°С, Учет реакции производят под лупой с малым увеличением. Микрометром, размеченным в окуляре, измеряют ширину и длину площади миграции лимфоцитов, которая вырисовывается под увеличением в еще своего рода "дерева", стволом которого является капил­ляр, а кроной - лимфоциты, располагающиеся вокруг капилляра

Регистрацию можно проводить с помощью планиметра и рисовального аппарата. Показатель торможения миграции выра­жают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свиде­тельствует о наличии фактора, ингибирующего ее.

РТМЛ – позволяет косвенно судить о эфекторной функции лимфоцитов и отражает ГЗТ. Кроме того, функциональное состояние CD 4+ клеток. Тестируют по цитокиновому профилю, по функциональной способности синтезировать γ – ИФН, а Тх2 – синтезировать ИЛ – 4.

Для CD 8 ЦТЛ – тест цитотоксичности – клетки мишени в т.ч. различные линии опухолевых клеток меченных радиоактивным изотопом, а по количеству высвобождаемого изотопа судят о величине цитотоксической активности лимфоцитов.