18, X, 6, 11,12 Реже – 1, 9, 16, хромосомы группы d (13, 14, 15)

преждевременное расхождение хромосом -ПРХ – это закономерная реакция генома в ответ на экзогенное либо эндогенное повреждение днк и вероятный элемент генетических программ тканевой дифференцировки, онкогенной трансформации и клеточной гибели.

• ЧАСТИЧНОЕ ПРХ – вероятное следствие генотоксических воздействий и манифестирует последовательно с индукцией хромосомных аберраций.

• ЧАСТИЧНОЕ ПРХ угрожает клетке потерей хромосом, формированием анеуплоидии и связано с риском онкогенной трансформации.

• ПОЛНОЕ ПРХ – вероятное свидетельство повышенной индукции апоптоза в популяции пролиферирующих клеток с нестабильным геномом.

• ПОЛНОЕ ПРХ угрожает полиплоидизацией генома в отсутствии экспрессии p53 дикого типа.

Лекция 3(б)

Все наследственные болезни- результат мутаций, т.е. изменений в структуре ДНК, исключение –

эпигенетические болезни – устойчивые, зависящие от пола функциональные изменения ДНК.

Мутации могут быть:

• спонтанные

• индуцированные

• эпигенетические

• передаваться с гаметами

• возникать в соматических клетках эмбриона

I. ГЕНОМНЫЕ

• Диплоидный набор 2n=46

• Гаплоидный 1n=23

• Полиплоидия (триплоидия 3n=69; тетраплоидия 4n=92)

• Анеуплоидия (трисомия 2n=47; моносомия 2n=45

II. ХРОМОСОМНЫЕ (делеции, дупликации, инсерции инверсии, транслокации)

III ГЕННЫЕ

• Точечные (сайтовые) мутации (нейтральные –SNP,нонсенс, миссенс

• Внутригенные перестройки (делеции, дупликации, инверсии, инсерции)

• Динамические мутации

• Перемещение мобильных элементов(Alu -300-500по х100 000 Line( 6 500по х 50 000

Патогенез Насл. Бол-ней

I.Хромосомные болезни – дисбаланс 1000 генов одной хромосомы или её фрагментов

• Избыток генетического материала (трисомия) менее драматичен, чем его отсутствие (моносомия)

• Нарушения функции генома на уровне ДНК (дисбаланс структурных и регуляторных генов, микро - РНК), на уровне ядра (нарушения микроархитектоники ядра, локализации гетерохроматина, хромосомных территорий, пр.) - «клеточный синдром», неспецифические и специфические фенотипические проявления

II,Генные болезни- дефекты одного гена: природа гена (гены –господа/ гены –рабы) функция гена (место в генной сети), тип мутации ( плюс /минус -эффекты; доминантные/ рецессивные), первичный биохимический дефект

Уровни патогенеза НБ:

I. Молекулярный: первичный биохимический дефект

• Отсутствие, недостаток или избыток генопродукта

• Неправильный по структуре генопродукт,

• Нарушения регуляторных взаимодействий между генами и целыми генными сетями

II. Клеточный уровень:

• Нарушения метаболизма клетки, функций мембранных рецепторов, энергетики клетки:

(Болезни накопления - лизосомные болезни, мукополисахаридозы)

III. Тканевой и органный уровни

• Первичная и вторичная гетерогенность (плейотропия) наследственных болезней

Диагностика хромосомных болезней:

Цитогенетическая диагностика. Этапы : :

Приготовление метафазных пластинок

Окраска препаратов

Кариотипирование хромосомных препаратов

Специальные методы:

Гибридизация in situ: варианты FISH, ДНК-зонды,

Метод CGH (Comparative Genome Hybridization)

Молекулярная диагностика хромосомных болезней

Диагностика генных болезней:

• Объектом исследования является молекула ДНК

• ДНК-диагностика возможна на любой стадии онтогенеза

• Два варианта ДНК-диагностики:

- прямая – детекция мутаций

- непрямая – идентификация ДНК-маркера, сцепленного с мутацией или с мутантным геном

ПРИНЦИПЫ ДНК-ДИАГНОСТИКИ

• Комплементарность пар оснований

• Разделение цепей ДНК при нагревании - денатурация

• Объединение комплементарных цепей при охлаждении – ренатурация

• Наличие специфических эндонуклеаз

• Разделение ДНК-фрагментов электрофорезом в гелях

• Полимеразная цепная реакция - ПЦР

Для каждой НБ характерен свой тип мутаций,

свой алгоритм ДНК-диагностики

Методы детекции мутаций:

I. Поиск неизвестных мутаций

• конформационный полиморфизм одноцепочечных фрагментов -SSCP

• электрофорез в денатурирующем гралиентом геле DGGE

• химическое расщепление некомлементарных сайтов-CMC

• анализ гетеродуплексов -HA

• прямое секвенирование -DS

II. Идентификация известных мутаций

• Блот - гибридизация по Саузерну (1975)

• Полимеразная цепная реакция -ПЦР (1985)

• Диагностика с помощью биочипов ( 2 000)

Типы молекулярной диагностики:

• Прямая диагностика - детекция мутаций в гене

Преимущества - 100% точность

Недостатки - необходимость точных данных о мажорных мутациях или «горячих» точках гена

• Косвенная диагностика - детекция молекулярных маркеров внутри или рядом с геном

Преимущества - универсальность

Недостатки -обязательное наличие больного ребенка

П Ц Р. блот-гибридизация - основные методы

Лекция 4(а)

Хромосомные мутации - нарушения кариотипа, сопровождающиеся (или не сопровождающиеся) дисбалансом генетического материала в пределах одной или нескольких хромосом (внутрихромосомные и межхромосомные перестройки , соответственно).

К межхромосомным перестройкам относятся транслокации (t) — перемещения генетического материала между хромосомами.

Типы транслокаций:

• Реципрокные транслокации

• Нереципрокные транслокации

• Робертсоновские транслокации

• Инсерции

Реципрокные транслокации (rcp) — взаимный обмен, т.е. обмен фрагментами между двумя (реже — тремя или более) негомологичными хромосомами — не сопровождаются изменением числа хромосом и дисбалансом генетического материала

• Нереципрокные транслокации — обмен хромосомными фрагментами, обычно приводящие к несбалансированному кариотипу

• Инсерции (ins) —

перемещение фрагмента одной хромосомы внутрь другой.

Робертсоновские транслокации (rob), или центрические слияния хромосом — воссоединение плеч двух акроцетрических хромосом в околоцентромерных районах.

При этом число хромосом в кариотипе уменьшается на одну, так как обычно одна из центромер и короткие плечи двух акроцентриков с локализованными в них ядрышкообразующими районами утрачиваются.

Внутрихромосомные перестройки:

представлены несколькими типами:

• Пробелы (g) (ахроматические, то есть неокрашенные области) и разрывы — могут быть хроматидными и хромосомными.

• Делеции (del) — утрата части хромосомы (концевые и интерстициальные)

• Дупликации (dup) — удвоение части хромосомы.

• Инверсии (inv) — переворот фрагмента хромосомы на 180⁰ :

- парацентрические – фрагмент не содержит область центромеры

- перицентрическая – фрагмент затрагивает область центромеры

• Изохромосома (i) — метацентрическая (моно- или дицентричекая, idic) хромосома с генетически идентичными плечами (то есть удвоенными только длинными или только короткими).

• Кольцевые хромосомы (r) представляют собой одиночные (реже — двойные) замкнутые кольца с одной или двумя центромерами (моно- или дицентрические, соответственно).

• Хромосомные фрагменты (fr) и маркерные хромосомы (mar) –сверхчисленные производные хромосом: мелкие ацентрические (ace) (т.е. не содержашие центромеру) или содержащие 1–2 центромеры.

Маркерные хромосомы могут быть результатом как внутри-, так и межхромосомных перестроек.

Механизмы возникновения хромосомных мутаций

• Основным механизмом возникновения структурной перестройки любого типа является наличие разрывов (в одной или нескольких хромосомах) с последующим воссоединением образовавшихся фрагментов.

• Разрывы могут возникать в интерфазном ядре как до, так и после репликации ДНК.

• В результате разрыва, возникшего в фазе G1, поврежденными оказываются обе хроматиды метафазной хромосомы. В итоге (после репликации) - хромосомный, или изохроматидный разрыв.

• В результате разрыва, возникшего в фазе S или после репликации  поврежденной оказывается только одна хроматида. В итоге - хроматидный разрыв.

• Единичный хромосомный разрыв, не затрагивающий центромеры, приводит к появлению делетированной хромосомы и фрагмента, который, будучи ацентрическим (лишенным центромеры), обычно утрачивается в следующем делении клетки.

• При наличии двух точек разрыва происходит либо восстановление (репарация) целостности хромосомы, либо образование различных типов перестроек - внутрихромосомных (если разрывы локализованы в одной хромосоме) и межхромосомных (при наличии разрывов в разных, гомологичных и негомологичных хромосомах).

Делеция— утрата участка хромосомы при воссоединении точек разрыва, локализованных в одной хромосоме.

• Для образования концевой или терминальной делеции (утраты дистального участка хромосомы) достаточно одного разрыва.

• При образовании интерстициальной делеции (утраты внутреннего сегмента) необходимо наличие двух точек разрыва.

Del(5p) - Синдром "крика кошки"

Микроделеционные синдромы – комплексные нарушения развития, связанные с небольшими хромосомными делециями, затрагивающими один или несколько генов.

- В большинстве случаев микроделеции нельзя выявить с помощью традиционной цитогенетики.

- Для диагностики микроделеций можно использовать FISH на метафазных и интерфазных ядрах клеток.

Микроделеция 22q11 (синдром Ди Джорджи)

Инверсии - воссоединение двух точек разрыва в одной хромосоме с разворотом «вырезанного» участка на 180

парацентрическая, перицентрическая

Для образования (встраивание между точками разрыва участка другой хромосомы) необходимо наличие трех разрывов — один разрыв на хромосоме-«реципиенте» и два других — для образования участка-«донора».

Инсерция может осложняться инверсией «донорского» участка

Дупликация - Воссоединение точек разрыва сопровождается удвоением какого-либо участка хромосомы.

Если удвоенные участки располагаются последовательно, то такая дупликация называется тандемной, если с разворотом на 180 — инвертированной.

Если утрачиваются оба теломерных участка одной хромосомы, то воссоединение открытых концов

сопровождается образованием кольца.

Судьба кольцевой хромосомы может быть различна.

а) При нормальной репликации образуется 2 моноцентрических кольца (r)

б) При одном обмене (или нечетном числе обменов) между сестринскими хроматидами – большое дицентрическое (dicr) кольцо,

в) При двух обменах (или их четном числе) – 2 "сцепленных" моноцентрических кольца.

Моноцентрические хромосомы сегрегируют в дочерние клетки без затруднений.

Дицентрические и сцепленные моноцентрические кольца в анафазе обычно разрушаются и либо утрачиваются, либо видоизменяются в зависимости от вариантов воссоединения новых точек разрыва и репликации в следующем клеточном цикле

изохромосомы - механизм образования

Первый механизм — удвоение плеча хромосомы (длинного или короткого) вследствие аномального (поперечного) разделения центромеры.

Второй механизм – удвоение плеча после образования изохроматидного разрыва в прицентромерном районе.

Если разрыв происходит в плече около центромеры - возникают 2 фрагмента (ацентрический и центрический). В последнем случае образуется изодицентрик.

Большинство изохромосом оказываются дицентрическими, однако функции кинетохора выполняет лишь одна центромера, тогда как вторая оказывается репрессированной.

• В определенном смысле изохромосома представляет собой гигантскую инвертированную дупликацию размером с целое плечо и делецию другого плеча.

• Возникающие вследствие этих внутрихромосомных перестроек изохромосомы являются истинными, так как оба плеча генетически идентичны.

• В случае межхромосомной перестройки, то есть обмена между идентичными плечами гомологичных хромосом в центромерном районе (или разрыва в центромерах двух гомологичных хромосом с воссоединением двух одинаковых плеч по типу центрического слияния) возникает хромосома, которая морфологически не отличается от изохромосомы, однако ее плечи не являются генетически идентичными.

Лекция 4(б)

Профилактика НБ - «Совокупность всех методов диагностики состояния плода, которая направлена на выявление врожденных дефектов и любых аномалий, диагностируемых при рождении»

• Первичная профилактика - предупреждение рождения больного ребенка:

- планирование деторождения

- улучшение среды обитания

• Вторичная профилактика - пренатальная диагностика

• Третичная профилактика - коррекция проявления патологических генотипов (нормокопирование)

- лечебные мероприятия

- создание условий для непроявления наследственной патологии (предиктивная медицина)

1.Медико-генетическое консультирование

2.УЗ-скрининг

3.Биохимический скрининг

4.Получение плодного материала

5.Лабораторная диагностика

цитогенетическая

молекулярная

биохимическая

6.Рекомендации по результатам ПД

Скринирование беременных

• Биохимический скрининг – «маркерные» белки крови α-Фетопротеин, хориальный гонадотропин, эстрадиол, РАРР-1

• Ультразвуковой скрининг (3-х кратный для

каждой беременной,

• Цитогенетический скрининг,

• Иммунологический (Rh) , Бактериологический,

• ДНК-скрининг

Скринирование новорожденных (врожденный гипотиреоз, фенилкетонурия, муковисцидоз, галактоземия, адрено-генитальный синдром)

1 триместр

УЗ маркеры

- воротниковое пространство

- носовые косточки

Маркерные Сывороточные Белки

 ХГЧ; РАРР-А;

Выявляемость хромосомной патологии- 94%

Лекция 5

ТЕРАТОЛОГИЯ - наука о возникновении, диагностике и профилактике врожденных уродств. ВРОЖДЕННОЕ УРОДСТВО (АНОМАЛИЯ) - стойкое морфологическое, биохимическое и функциональное нарушение у плода, обусловленное экзогенным или эндогенным повреждающим действием во время беременности

Бластопатии - до 15 дня беременности

Эмбриопатии - до 12 недель беременности

Фетопатии - от 12 нед.

до родов

Критические периоды эмбриогенеза

Механизм действия тератогена

1.Метаболизма нуклеиновых кислот, энергетического обмена, дыхания и пр.

2.Структуры и функции клеточных мембран (высокомолекулярные тератогены, антисыворотки)

3.Внеклеточного матрикса (мукополисахариды, сиаловые кислоты- вит.А, кортизон)

4.Микроокружения плода - состояние децидуальной ткани, фетоплацентарная недостаточность, амниотические тяжи и пр.

Лекция 6

Фармакокинетика – абсорбция, распределение,

метаболизм и выведение лекарства

Фармакодинамика – взаимоотношение между

концентрацией, местом действия и эффектом

Фенотипирование лекарства- прямой метод

определения активности лекарства по

фармакокинетике субстрата

Генотипирование - анализ полиморфизмов генов, определяющих метаболизм лекарства

Генетическая гетерогенность - генный полиморфизм

Фармакогенетика – индивидуальная реакция на лекарства

Фармакогеномика – союз функциональной геномики и

молекулярной фармакологии

Лекарства с высоким печеночным клиренсом:

аминазин, аспирин,кортизон, ,морфин, резерпин, метопролол, метилтестостерон, и др.

Лекарства с низким печеночным клиренсом:

теофеллин, парацетомол

По скорости метаболизма лекарств различают:

«Экстенсивные » метаболизаторы- норма

«Медленные» метаболизаторы – сниженная

«Быстрые или сверхактивные» метаболизаторы

Фазы детоксикации

Фаза 1

Несинтетические реакции

(пролекарство – лекарство)

Оксидазы со смешанной функцией

Реакции восстановления и гидролиза

Фаза II

Синтетические реакции

Коньюгация ЛС через метаболически активные радикалы (фазы I)

Возможен метаболизм ЛС только за счет ферментов Фазы I или Фазы II

Индукция ферментов метаболизма:

1.Фенобарбиталовый путь – активация промотора в регуляторной области гена

Аутоиндукция – сам ксенобиотик активатор фермента

2.Рифампицин-дексаметазоновый тип – взаимодействие индуктора с рецепторами-регуляторами транскрипции

3. Этаноловый тип –стабилизация молекулы фермента метаболизма путем образования комплекса с некоторыми ксенобиотиками

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ:

изменение абсорбции - инотиазид – NAT2

превращение в активную форму кодеин –морфин –CYP 2D6

системные особенности метаболизма

конкуренция препаратов за фермент

индукция ферментов метаболизма

индукция/ингибирование пищевыми продуктами

ФРАМАКОДИНАМИЧЕСКИЕ:

поступление /выведение препарата из клетки

изменения в белках рецепторах

Биочип - упорядоченная матрица ячеек, каждая из которых

содержит молекулярный зонд (ДНК, РНК, белки, клетки)

• Каждая ячейка биочипа – индивидуальная реакционная пробирка

Ячейки биочипа содержат ДНК-зонды, способные выявлять наличие определенной ДНК в образце, находить в ней фенотипически значимые мутации (наследственные заболевания, генетическую предрасположенность у человека, лекарственную устойчивость у бактерий и т.д.)

На биочипе размещается несколько тысяч ячеек.

Каждая гелевая ячейка содержит уникальную пробу.

Диагностические биочипы содержат набор всех проб.

Преимущества биочипов:

- возможность проведения множественного параллельного анализа биологических объектов (тысячи ячеек на 1 кв. см.)

- миниатюрность (удобство эксплуатации, экономия реактивов и т.д.)

- универсальность и дешевизна производства (одна производственная схема для различных микрочипов)

- возможность использования в качестве иммобилизованных зондов фрагментов ДНК, РНК, белков (с сохранением ферментативных или антигенных свойств), а также живых клеток-биосенсоров

Выводы:

1. Чувствительность человека к экзогенным факторам в т.ч.

к лекарственным препаратам определяется состоянием и

функциональной активностью генов метаболизма

2. Основу индивидуальной чувствительности к

лекарственным препаратам составляют особенности

генетического полиморфизма

3. Выбор оптимальной индивидуальной дозировки

лекарства должен производиться с учетом результатов

тестирования соответствующих генов метаболизма

4. Технология биочипов существенно повышает

эффективность популяционных и скринирующих программ по фармакогенетике и предиктивной медицине.

Лекция 7

Гены «предрасположенности» - мутантные гены (аллели), совместимые с анте- и постнатальным развитием человека, приводящие в неблагоприятных условиях к различным заболеваниям. 1.Гены системы детоксикации 2.Гены рецепторы 3.Гены «триггеры» ( метаболические шунты) 4.Гены «старения» 5.Гены иммунной защиты 6.Генные сети мультифакториальных заболеваний

ГЕННАЯ СЕТЬ- группа координированно экспрессирующихся генов, контролирующих тот или иной процесс морфогенеза или определенные функции организма в норме и в патологии

Требования к генетическому паспорту:

1.Хорошо продуманная генная сеть каждого МФ заболевания

2. Достоверные клинические и популяционные данные, подтверждающие вклад соответствующих генетических полиморфизмов в патогенез МФ заболевания

3. Адекватные математические методы оценки роли индивидуальных генов и межгенных взаимодействий в МФ заболевание

4.Взвешенная интерпретация результатов генетического тестирования наследственной предрасположенности

5.Рекомендации по результатам индивидуального генетического паспорта

6.Мониторинг отдаленных результатов состояния пациента после генетического тестирования

7. Конфиденциальность, доступность, юридическая и правовая защищенность.

Генетический паспорт - индивидуальная база ДНК-данных, отражающая уникальные генетические особенности каждого человека, его предрасположенность к тем или иным наследственным, мультифакториальным и другим заболеваниям

Лекция 8

“ЭПИГЕНЕТИКА”-

ветвь биологии, изучающая причинные

взаимодействия между генами и

продуктами, образующими фенотип”

ЭПИГЕНЕТИКА – раздел

функциональной геномики

Эпигеном –функционирующая часть

генома

2 вида информации в геноме

Генетическая (двухмерная) – закодированная в ДНК общая программа создания живого организма

Эпигенетическая (Динамическая, трехмерная) –

как, где и когда должна быть реализована генетическая информация.

Каждый вид информации обеспечен

своими системами:

Кодирования

Хранения

Передачи

• Эпиген- единица динамической памяти, имеющая не менее двух режимов работы составляющих её генов и сохраняющихся в ряду поколений

• Эпигенетическая изменчивость – изменения генной активности на клеточном уровне

• Эпигенотип – часть функционально активного генома в данном типе дифференцированных клеток

• Эпигенетические траектории- потенциально возможные пути реализации генотипа

• Эпигенетическая регуляция - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии конкретного гена без каких-либо изменений в его нуклеотидной последовательности.

Инактивация метилированием:

1. Метилирование цитозина нарушает ДНК-белковые взаимодействия , препятствует связыванию транскрипционных факторов.

2. Метилированные районы ДНК специфически связывают транскрипционные репрессоры.

3. Метилирование ДНК влияет на структуру хроматина.

Методы анализа метилирования:

1. Метилчувствительная ПЦР

аналитическая чувствительность - 1: 2000

2. Метилспецифическая ПЦР

Трансформация цитозина в урацил бисульфитом Na

аналитическая чувствительность - 1: 1000

3. MethylLight – метилспецифическая ПЦР в реальном времени аналитическая чувствительность - 1: 10000

4. Биологические микрочипы

5.Специфические антиметилцитозиновые антитела

Биологические функции метилированной ДНК:

• геномный импринтинг

• инактивация Х-хромосомы

• регуляция структуры хроматина

• регуляция генной экспрессии

• репликация ДНК

• канцерогенез

• клеточная дифференцировка

• выключение трансгенов ( “silencing”)

Геномный импринтинг (ГИ) – различная экспрессия гомологичных генов , хромосом или геномов в зависимости от их родительского происхождения .

Импринт – совокупность модификаций , по-разному маркирующих родительские аллели и обеспечивающих моноаллельный характер экспрессии импринтированных генов на хромосомах отцовского или материнского происхождения

Фенотипические проявления геномного импритинга

• Комплементарность родительских геномов

McGrath, Solter,1986; Surani,1984

• Комплементарность гомологичных хромосом

• Baranov 1970; Cattanach,Searle,1975

• Комплементарность гомологичных локусов

Феномен Джонсона ген Thp

• Комплементарность гомологичных генов –

феномен «аллельного исключения»

Общие свойства импритированных генов:

• Располагаются кластерами (11р15; 15q11-13)

• Асинхронность репликации

• Временная и пространственная регуляция

экспрессии (IGF2, KvLQT1)

• Консерватизм ортологичных

импринтированных генов

• Кодируют нетранслируемые РНК

Геномный импритинг - ГИ – дифференциальная модификация отцовского и материнского генетического материала в процессе созревания гамет, следствием чего являются различия в экспрессии родительских аллелей как в процессе раннего эмбриогенеза, так и взрослых особей

Инактивация посредством гиперметилирования ключевых генов-супрессоров сопровождается гипометилированием и активацией целого ряда онкогенов (raf, c-fos, c-myc, c-Ha-ras, c-K-ras) и факторов роста (IGF2, TGF).

Метилирование метаффазных хромосом:

Изохоры – протяженные участки ДНК ( > 300 тпн)

с различным содержанием CpG динуклеотидов

H1,H2,H3 –богатые C G ; L1,L2- бедные СG

R сегменты - много CG динуклеотидов, 80% всех CpG

островков, высокая плотность генов

G сегменты - обогащены АТ динуклеотидами,

низкая плотность генов

Структурный сателлитная ДНК- I,-II, -III.

гетерохроматин- хромосомы 1, 9,16