48 000 До 143 000 Да) и по разному относятся к температуре и рН, действию ингибиторов и активаторов.

Инулаза (Н.Ф. 3.2.1.7). Фермент осуществляет гидродиз инулина и других полифруктозанов по |3-1,2-фруктозидной связи, начиная с р-фрук-тозидного конца полимера. В результате образуется фруктоза и единствен­ная молекула глюкозы на одну молекулу инулина. При полном гидроли­зе инулина получается 95% фруктозы и 5% глюкозы.

Фермент гидролизует главным образом инулин; сахароза, рафиноза также гидролизуются, но с незначительной скоростью. Инулаза содер­жится в тех же растениях (топинамбур, цикорий), в которых присутству­ет инулин. Активная инулаза продуцируется А5рег§Ши5 а^атоп ВКМ-808 при глубинном культивировании. Препарат обладает высокой ста­бильностью к Н⁺-ионам и температуре. Оптимум рН действия 4,5; опти­мум температуры — 65°С.

Полученные из инулина фруктозные сиропы могут быть широко ис­пользованы в кондитерской промышленности и диетическом питании. $-Фруктофуранозидаза (Н.Ф.3.2.1.26). Другие названия этого фермен­та — инвертаза или сахараза.

Для промышленного производства имеют значения только фермен­ты из 5. сегеуЫае и 8. саг18Ьег§еп51з. р-Фруктофуранозидазу выделяют из дрожжей путем автолиза. Этот фермент гидролизует сахарозу па р~фрук~

В результате действия фермента на сахарозу получается смесь экви-молярных количеств сс-глюкозы и р-фруктозы, получившая название «ин-вертного сахара». Термин «инверсия» обозначает изменения, происхо­дящие в способности сахара вращать плоскость поляризованного света. Это можно выразить следующей схемой:

Сахароза + Н₂О ——» О (+)-глюкоза + О (—)-фруктоза

[а] „= +66,5° [а] ₀ = +52,5° [а] _в = -92,4^е

Оптимум рН дрожжевой инвертазы находится в достаточно широ­кой зоне от 4,0 до 5,5. Фермент ингибируется ионами металлов. Полное ингибирование происходит под действием ртути и свинца; частичное ингибирование вызывают ионы серебра, цинка, меди. |3-Фруктофура-нозидаза гидролизует также рафинозу и метил-|3-В-фруктофуранозид, причем, если относительную скорость гидролиза сахарозы принять за 100, то соответствующие скорости расщепления этих субстратов будут равны 47 и 77.

Инвертаза находит широкое применение в пищевой промышлен­ности. Гидролиз концентрированных растворов сахарозы приводит к образованию более сладких сиропов. Точка кипения инвертированных сиропов выше, а точка замерзания ниже, т. к. при инверсии повыша­ется осмотическое давление. Образовавшиеся при действии инверта­зы моносахариды более растворимы, не так легко выкристаллизовы­ваются из высококонцентрированных сиропов. Практическое исполь­зование инвертазы в кондитерской промышленности будет рассмот­рено в разделе 8.3.

(3~Галактозидаза (Н.Ф.3.2.1.23). Фермент, который часто называют лактазой, катализирует реакцию гидролитического отщепления нереду­цирующих остатков |3-В-галактозы в |3-галактозидах, в частности, в мо­лочном сахаре — дисахариде лактозы:

Ферментные препараты лактазы, применяемые в пищевой промыш­ленности, получают с помощью различных продуцентов: микроскопи­ческих грибов (А. огугае, А, ш§ег), бактерий (Е. со1], ЬасЮЪаеШиз), дрож­жей (5. гга&Шз, 3. рзейогторгсаНз), Все они имеют различные температур­ные оптимумы, которые, однако, лежат в пределах 37—50"С. Оптимумы рН этих ферментов также заметно отличаются: для бактериальных — око­ло 7,0; для грибных — около 5,0; для дрожжевой лактазы — около 6,0.

При гидролизе лактозы в цельном молоке, обезжиренном молоке или в концентратах молока оптимальную активность (при нейтральном рН этих субстратов) проявляет дрожжевой фермент; для сыворотки и ее концентратов — грибной. Причем в обезжиренном молоке или сыворот­ке лактоза гидролизуется легче, чем в цельном, а пастеризованные суб­страты гидролизуются легче, чем непастеризованные.

(З-Галактозидаза из Е.соН была получена в кристаллическом состоя­нии, ее молекулярная масса 850 000 Да. Она ингибируется некоторыми металлами (Си, 2п). Восстанавливающие агенты (цистеин, сульфид N3, сульфит На и др.) активируют фермент и способны преодолевать влия­ние ингибиторов-металл ов.

У некоторых групп населения (исключение составляют жители Се­верной Европы и некоторых районов Африки) ярко выражена непе­реносимость (интолерантность) лактозы, связанная с полным или частичным исчезновением у взрослых людей лактазной активности в клетках кишечного эпителия. У грудных младенцев активность этого фермента очень высока.

Эндополигалактуроназа (Н.Ф.3.2.1.15) и экзополигалактуроназа (Н.Ф.3.2.1.67). Эти два фермента участвуют в превращениях пектиновых лсщсств наряду с другими пектолитическими ферментами растительно­го и микробного происхождения (см. также гл. 3).

Эндополигалактуроназа — фермент, который гидролизует а-1,4-свя-зи в молекуле растворимого пектина (метоксилированной полигалакту-роновой кислоты), неупорядоченным, произвольным образом. С возрас­танием степени этерификации полигалактуроновой кислоты степень и скорость гидролиза падают, т. к. для проявления каталитической актив-] юсти фермента требуются свободные карбоксильные группы. Большин­ство изученных эндополигалактуроназ микроскопических грибов име­ют молекулярную массу от 30 000 до 40 000 Да. Оптимальные значения рН колеблются в диапозоне 3,8—5,5.

В гидролизе этого типа связи принимает участие и другой фермент — экзополигалактуроназа, который последовательно отщепляет молекулу галактуроновой кислоты, начиная с нередуцирующего конца. Эндопо­лигалактуроназа синтезируется как грибами, так и некоторыми видами бактерий. Они отличаются по своей специфичности к пектинам из раз­личных источников, конечными продуктами реакции, оптимуму рН и другим свойствам.

Для промышленного производства ферментных препаратов пек-толитических ферментов, которые являются комплексными, в каче­стве продуцентов используют в основном микроскопические (плес­невые) грибы, в частности, грибы рода АврегёШш: А. пщег, А. \уепШ, Л. огугае. Бактериальные ферменты в промышленных масштабах не производятся.

Растительные полигалактуроназы, по-видимому, похожи на гриб­ные полигалактуроназы. Они обнаружены в широком спектре плодов и овощей: помидорах, авокадо, редисе, огурцах, яблоках, грушах, цит­русовых и др. Все они проявляют активность при естественных рН плодов.

промышлен­ности достаточно обширно. Они используются при производстве фрук­товых соковых концентратов и экстрактов, при осветлении соков и вин, при производстве фруктовых и овощных пюре и нектаров.

Целлюлолитические ферменты. Ферментативное разруше­ние целлюлозы и родственных ей полисахаридов (гемицеллюлозы, лиг­нина) — сложный процесс, требующий участия комплекса ферментов. Продуцентами такого комплекса целлюлолитических ферментов явля­ются грибы рода Тпспойеппа, РЬапсгосЪаеге (5рого1пспит) и Ризагшт, а также бактерии рода С1о51пс1шт, СеНЫотопаз и некоторые другие.

Три основных типа целлюлолитических ферментов, продуцируемых микроскопическими грибами, образуют комплекс ферментов, способ­ных осуществить полный гидролиз целлюлозы:

• Эндо-1,4-/3-глюконаза или целлюлаза (Н.Ф.3.2.1.4) беспорядочно гид- ролизует р-1,4-гликозидныс связи. Она не расщепляет целлобиозу, но гидролизует целлодекстрины и производные целлюлозы с высокой сте­ пенью замещения, т. к. специфичность этого фермента не высока.

• Экзо-1,4-$-глюконаза или целлобиогидролаза (Н.Ф.3.2.1.91) действует на целлюлозу, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего кон­ ца цепи. Этот фермент не действует на замещенные производные цел­ люлозы , что указывает на более высокую субстратную специфичность, чем у эндоглюконазы, Целлобиогидролаза гидролизует целлодекстри­ ны, но не действует на целлобиозу.

• р-Глюкозидаза(И.Ф.3.2.\.2\) расщепляет целлобиозу и целлоолигоса- хариды до глюкозы. Фермент не действует на целлюлозу и высшие оли- госахариды.

Целлюлазная система бактерий существенно проще, чем у грибов, т. к. бактерии образуют только эндоглкжоназу и |3-глюкозидазу.

Все ферменты целлюлолитического комплекса достаточно хорошо изучены: практически все они являются гл и ко протеидам и, определены их молекулярные массы, изоэлектрические точки, для многих показано наличие множественных форм.

Доказано, что различные ферменты, гидролизующие высокоупоря­доченную целлюлозу, действуют в синергизме (рис. 8.10).

Эндоглюконаза атакует аморфные участки целлюлозных фибрилл. В результате образуются новые целлюлозные цепочки, на которые дей­ствует целлобиогидролаза, отщепляя целлобиозные звенья с нередуци­рующего конца. Синергизм между двумя этими ферментами проявляет­ся в том, что в результате действия эндоглюконазы появляется новый субстрат (более короткие цепочки), на который действует уже целлобио­гидролаза. р-Глкжозидаза усиливает гидролиз, расщепляя целлобиозу — конечный продукт и ингибитор этих ферментов.

Рис. 8.10. Схема ферментативного гидролиза целлюлозы

Применение целлюлолитических ферментов представляет большой интерес, т. к. ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих матери­алов (древесина, торф, сельскохозяйственные и городские отходы) мо­жет обеспечить получение различных биотехнологичсских продуктов (глюкозы, этанола, ацетона, микробной биомассы). В настоящее время исследования ферментативного расщепления целлюлозы достигли такого уровня, когда имеются все необходимые условия для разработки промыш­ленного процесса и лишь по экономическим причинам он не реализует­ся на практике.

Протеолитнческие ферменты (Н.Ф.3.4). Основной реакцией, катали­зируемой протеолитическими ферментами, является гидролиз пептид­ной связи в молекулах белков и пептидов.

-МН-СН-СО-КН-СН-СО- + Н₂О ->

I I

К, К₂

-* -МН-СН-СООН + МН₂-СН-СО-

я, *₂

Согласно первоначальной классификации протеолитических фер­ментов их делили на две группы: протеиназы и пептидазы. При этом считали, что протеиназы действуют на белки, расщепляя их до поли­пептидов; полипептиды же гидролизуются пептидазами до аминокис­лот. Более поздняя классификация, до сих пор сохранившая свое зна­чение, основана на схеме, предложенной М. Бергманом и Д. Фрутоном (1937). Согласно этой схеме протеазы разделяются на эндо- и экзопеп­тидазы. Ферменты первой группы (эндопептидазьг) могут гидролизо-вать глубинные пептидные связи и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты; ферменты второй группы (экзопептидазы) не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи, и дей­ствуют либо с карбоксильного, либо с аминного конца цепи, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты. В связи с этим экзопептидазы подразделяют на аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы.

Аминопептидазы (Н.Ф.3.4.11) катализируют отщепление М-концевых аминокислот.

Карбоксипептидазы (Н. Ф. 3.4.12) катализируют отщепление С-кон-цевых аминокислот.

...-Г4Н-СН-С-Г-НН-СН--СООН

Дипептидазы (Н.Ф.3.4. 13) проявляют специфичность к дипептидным субстратам.

Вместе с тем эндопептидазы (протеиназы) разделены на подгруппы, начиная с подподкласса 3.4,21, в первую очередь на основании катали-

316

тического механизма (строения активного центра); особенности специ­фичности используются при этом только для идентификации индивиду­альных ферментов в пределах подподкласса:

— сериновые протеиназы (Н.Ф.3.4.21), в активном центре которых функ­ ционирует остаток серина и гистидина;

• тиоловые (цистеиновые) протеиназы (Н.Ф.3.4.22), содержат в актив­ ном центре 5Н-группу остатка цистеина;

• кислые (карбоксильные) протеиназы (Н.Ф.3.4.23), в активном центре содержат СООН-группу остатка аспарагиновой кислоты;

— металлопротеиназы (Н.Ф.3.4.24), содержат в активном центре металл, необходимый для проявления их каталитической активности.

Группа протеиназ, о механизме действия которых ничего неизвестно, отнесена к подподклассу 3.4.99.

Субстратная специфичность протеиназ будет определяться следую­щими факторами: природой аминокислоты, образующей гидролизуемую пептидную связь; радикалами аминокислот, удаленными от гидролизуе-мой пептидной связи; общей пространственной конформацией молеку­лы белка, делающей определенные пептидные связи доступными для дей­ствия фермента.

Исследование протеолитических ферментов ведется весьма интенсив­но. Это происходит вследствие того, что они являются чрезвычайно удоб­ным объектом для изучения структуры белков, активных центров фер­ментов, механизмов регуляции ферментативной активности и других важ­ных вопросов энзимологии; кроме того, протеазы широко применяются в различных отраслях промышленности: пищевой, сельском хозяйстве,

медицине.

Промышленное применение препаратов протеаз будет описано в раз­деле 8.3. Здесь же мы остановимся на рассмотрении отдельных свойств протеаз, имеющих технологическое значение, предварительно разделив их по типу происхождения на растительные, животные и микробные.

Растительные протеазы. Споры о приоритетности тех или иных ферментных препаратов, полученных из названных источников, ведутся уже достаточно долго. Однако, в связи с ограниченностью жи­вотного сырья (внутренние органы крупного рогатого скота и свиней), а также возможной токсичностью микробных препаратов (все они требу­ют высокой степени очистки, хотя и это не может служить абсолютной гарантией их безопасности), большой интерес представляют раститель­ные протеазы, лишенные указанных недостатков.

Паггаин (Н.Ф.3.4.22.2) нхимопапаин (Н.Ф.3.4.22.6). Папаин является наиболее применяемым в производстве протеолитическим ферментом. Ферменты папайи и химопапаин — истинные ферменты латекса плодов дынного дерева (Сапса рарауа).

Дипептидазы (Н.Ф.3.4. 13) проявляют специфичность к дипептидным субстратам.

Вместе с тем эндопептидазы (протеиназы) разделены на подгруппы, начиная с подподкласса 3.4,21, в первую очередь на основании катали-

316