1. Приготовить препарат из чистой культуры ложнодифтерийных бактерий, окрасить по Граму, Леффлеру, Нейссеру, промикроскопировать.

2. Изучить характер роста дифтерийных бактерий на средах с теллуритом калия, отдифференцировать биовары.

3. Отдифференцировать коринебактерии по ферментативным свойствам, гемолитической активности в демонстрационном наборе.

4. Определить токсигенность бактерий в реакциях преципитации в готовых посевах.

5. Изучить препараты, используемые с диагностической, профилактической и лечебной целью.

6. Составить алгоритм микробиологической диагностики дифтерии.

7. Решить предложенные ситуационные задачи. Микробиологическая диагностика дифтерии

Дифтерийная палочка (Corynebacterim diphtheriae) является грамположительной палочковидной бактерией, неподвижной, не образующей спор и капсул. Отличительной морфологической особенностью этого микроба является наличие в его цитоплазме зерен волютина. Дифтерийная палочка хорошо растет на простых питательных средах, но для выделения микробов рекомендуется использовать элективные питательные среды: Клауберга, хинозольную среду Бучина, модифицированную среду Тинсдаля (цистин-теллурит-сывороточная среда), кровяной теллуритовый агар.

Дифтерийная палочка при росте на питательных средах и в организме больного продуцирует сильный экзотоксин, который обладает избирательным действием на мышцу сердца, надпочечники и периферические нервы.

Забор материала

Материал берет врач или опытная медсестра сухим стерильным тампоном. При необходимости пересылки материала тампоны смачивают 5% раствором глицерина в физиологическом растворе. Можно использовать среды обогащения: Пергола или полужидкую среду.

Материал из зева следует брать до еды, язык фиксировать шпателем, затем тампоном, не касаясь языка, зубов и слизистой щек, извлечь материл на границе пораженной и здоровой тканей (материал целесообразно забирать до начала антибиотикотерапии или через 3 дня после отмены антибиотиков). Тампоны в пробирках этикетируются следующим образом: на каждый анализ заполняют бланк-направление, в котором указывают ФИО исследуемого, вид материала, цель направления, время забора материала, ФИО отправителя, адрес получателя заключения.

Бактериоскопическое исследование

Бактериоскопия малоинформативна, поэтому мазки с тампона делают только по требованию врача, направляющего материал на анализ. В этом случае материал должен быть забран двумя тампонами (для мазка и для посева).

Фиксированные мазки окрашивают по Леффлеру, уксусной толуидиновой синей или по Нейссеру. Для люминесцентной микроскопии окрашивают корифосфином. Целесообразно один мазок окрасить по Граму. Наличие грамположительных палочковидных микроорганизмов, обнаружение волютиновых зерен, расположенных на концах клеток, а также расположение микроорганизмов в виде растопыренных пальцев или “V” позволяет предположить наличие в материале дифтерийных бактерий. Предварительный результат оформляется на отдельном бланке.

Бактериологическое исследование

Инфицированным тампоном проводят посев на одну из рекомендуемых сред: кровяной теллуритовый агар, среда Клауберга–II, хинозольная среда Бучина, среда Тинсдаля (цистеин-теллурит-сывороточная среда). Посевы со сред обогащения производят петлей. Предварительно материал в среде обогащения инкубируют.

Чашки с засеянным материалом инкубируют в термостате и изучают через 24-48 часов. На средах с теллуритом калия хорошо различимы биовары. Биовар гравис - крупные серые шероховатые с радиальной исчерченностью колонии; биовар митис - мелкие черные блестящие выпуклые гемолитические колонии; биовар интермедиус имеет промежуточные признаки. На хинозольной среде колонии возбудителя дифтерии окрашиваются в синий цвет, а среда на месте образования колоний приобретает фиолетовый оттенок (следствие восстановления индикатора). На среде Тинсдаля формируются круглые, выпуклые, блестящие черные или темно-коричневые колонии, окруженные темно-коричневым ореолом, являющимся специфическим признаком роста и размножения дифтерийного микроба.

Изучив колонии микроорганизмов по внешним признакам и особенностям роста, отбирают из них 2-3 типичных. Для накопления чистой культуры из отобранных колоний микроорганизмы пересевают на скошенный сывороточный агар, а также готовят мазки, окрашивают их по методам Нейссера и по Леффлера. Оставшуюся часть колоний засевают на среду для определения токсигенности и среду для выявления цистиназной активности (проба Пизу). Поскольку на чашке первичного посева могут одновременно вырастать колонии токсигенных и нетоксигенных вариантов C.diphtheriae, рекомендуется в тесте на токсигенность испытывать максимальное число колоний (10-20), смешивая материал нескольких колоний в одну бляшку.

Через 24 часа инкубации при появлении специфических линий преципитации изучаемую культуру идентифицируют как токсигенную и выдают документированный ответ. В случае отсутствия токсигенности чашки инкубируют еще 24 часа. Накопленную на сывороточном агаре чистую культуру используют для определения ферментативной активности на средах Гисса с глюкозой, сахарозой, крахмалом и мочевиной (проба Закса).

На 4 день исследования учитывают сахаролитические свойства, уреазную активность (проба Закса), а также повторно (через 48 часов) изучают результат пробы на токсигенность. Проба Закса может быть положительной уже через 30 минут пребывания материала в термостате (при усвоении мочевины среда ощелачивается и за счет фенолового красного окрашивается в красный цвет).

При отсутствии специфических линий преципитации, но при положительном результате на цистиназу, глюкозу, отрицательном результате на уреазу и сахарозу культуру идентифицируют как нетоксигенные коринебактерии. Положительный тест с крахмалом свидетельствует о выделенном биоваре гравис.

Определение токсигенности.

In vitro: В основу метода положен принцип взаимодействия дифтерийного токсина и антитоксической противодифтерийной сыворотки, диффундирующих в толщу агара и образующих в нем зоны преципитации. Пропитанную антитоксической сывороткой (500МЕ в 1мл) фильтровальную полоску 1,5 ∙ 8 см накладывают на середину чашки с мартеновским агаром. Открытую чашку подсушивают в термостате 15 минут. Испытуемую культуру петлей наносят на питательную среду в форме бляшек или перпендикулярных к полоске линий. Между двумя исследуемыми культурами засевают штамм заведомо известных токсигенных дифтерийных бактерий. Чашки помещают в термостат при температуре 37°С и через 24-48 часа учитывают результат. Просматривают питательную среду в проходящем свете или с помощью лупы. Обнаружение линий преципитации, идущих от заведомо токсигеных штаммов и от исследуемых культур в виде четких «усов», свидетельствует о токсигенности выделенных культур. Обнаружение дифтерийного токсина в сыворотке возможно в реакции агглютинации с латексом.

In vivo: Токсигенность возбудителя дифтерии может быть определена в опыте на морских свинках путем внутрикожного или подкожного заражения. Токсигенные культуры приводят к гибели животных в течение 3-5 суток, при вскрытии можно обнаружить гиперемированные надпочечники, а при внутрикожном заражении - некроз кожи.

Серологическая диагностика направлена на определение антитоксического иммунитета. Титр антитоксинов в сыворотке определяют в РА, РНГА, ИФА.