Микробиологическая диагностика хламидиоза

Хламидии относятся к возбудителям, наиболее часто передающимся половым путем. Хламидийная инфекция среди пациентов дерматовенерологических учреждений встречается в 2-3 раза чаще гонореи. Вследствие малочисленности симптомов и несвоевременности выявления, заболевание нередко приобретает хроническое течение. Проявляющаяся патология распространяется от генитальных и брюшных поражений до конъюнктивита, пневмонии и артрита. По причине специфического внутриклеточного размножения хламидий, лечение антибиотиками не всегда может полностью уничтожить инфекцию.

В обследовании на хламидиоз прежде всего нуждаются женщины (беременные и небеременные):

• с наличием воспалительных заболеваний гениталий;

• с бесплодием в течение 2-3-х лет;

• с отягощенным акушерским анамнезом и с осложненным течением настоящей беременности.

Исследование на хламидий у вышеуказанных женщин надо проводить независимо от картины влагалищного мазка и от наличия сопутствующей условно-патогенной микрофлоры в половых путях, так как доказано, что генитальный хламидиоз протекает преимущественно (почти у 80% больных) при нормальной картине влагалищного мазка.

Диагноз хламидиоза ставится на основании анамнеза, оценки клинических признаков заболевания и лабораторных методов исследования в связи с тем, что для генитального хламидиоза более характерно малосимптомное и латентное течение. Микробиологическая диагностика имеет основное значение.

Материал для исследования: соскобы (не мазки!) эпителия и секреты с пораженных слизистых оболочек урогенитального тракта; отделяемое и соскобы конъюнктивы глаз; соскобы прямой кишки; реже мокрота, кровь, пунктаты лимфоузлов. При болезни Рейтера хламидии выделяются из уретры, пораженных суставов и конъюнктивального мешка.

Очень важным для диагностики хламидиоза является правильный забор материала. Перед взятием материала больные не должны принимать в течение месяца антибиотики тетрациклинового ряда, не должны мочиться в течение 1-1,5 часов. Оптимальными для персистенции и размножения C.trachomatis являются определенные участки цилиндрического эпителия мочеполовых путей (передняя уретра на глубине 2,5-4 см у мужчин и слизистая оболочка цервикального канала матки на глубине 1,5 см у женщин).

Методы исследования:

1. цитологический;

2. бактериологический;

3. серологический;

1. экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.

Цитологическое исследование позволяет выявить хламидий не более чем в 40% случаев. Взятый соскобный материал помещают на предметное стекло, равномерно распределяют тонким слоем и высушивают на воздухе. Фиксация материала осуществляется безводным ацетоном, метанолом или этанолом посредством нанесения их на препарат в количестве 2-3 капель или путем погружения препарата в раствор фиксатора на 30 секунд. Хранить и транспортировать препараты рекомендуется при комнатной температуре. Обрабатывать следует в течение 7 дней. Окрашиваются соскобные препараты по Романовскому-Гимзе. Окраска меняется на разных стадиях развития: ядра клеток (клеток, в которых находятся включения) имеют вишневый оттенок; цитоплазма окрашивается в нежно-голубой цвет; элементарное тельце - в розовый, пурпурный или фиолетово-розовый цвет; ретикулярные тельца - в голубой или синий.

Окраска раствором Люголя позволяет дифференцировать C.trachomatis и C.psittaci. Первые содержат гликоген и поэтому окрашиваются йодом; вторые гликоген не содержат и поэтому йодом не окрашиваются.

Результат исследования считается достоверным только при наличии характерных включений в эпителиальных клетках. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживают не менее 10 не вызывающих сомнения телец хламидий.

Окрашенные по Романовскому-Гимзе препараты просматривают в темнопольном микроскопе на присутствие включений при увеличении в 400 или 600 раз. В темном поле включения хламидий дают желто-зеленую флюоресценцию.

Бактериологическое исследование

Хламидий не растут на искусственных питательных средах. Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким, является метод диагностики хламидийной инфекции посредством изоляции возбудителя на культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами (Золотой стандарт). Для этой цели обычно используют культуру клеток McCoy, обработанных циклогексамидином.

Используемые питательные среды:

-ростовая среда: среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 4% от общего объема, гентамицин 40 мкг/мл.

-изолирующая среда (среда с антибиотиками для заражения клеток клиническим материалом): среда Игла без глютамина - 400 мл, 3% глютамин 5 мл, эмбриональная сыворотка теленка 8% от общего объема, гентамицин 40 мкг/мл, 10% глюкоза 5 мл.

-транспортная среда (для забора и хранения клинического материала): фосфатный буфер с сахарозой.

Методика: готовят раствор циклогексимидина на изолирующей среде. В стерильные плоскодонные пробирки с помещенными в них покровными стеклами добавляют клеточную суспензию и ставят их на 16-24 часа в термостат при температуре 37°С. Во флаконы с транспортной средой, содержащей клинический материал, при интенсивном встряхивании добавляют свежеприготовленную изолирующую среду. В это время из пробирок с монослоем удаляют ростовую среду, не разрушая монослоя. Затем распределяют изолирующую среду из флаконов с инфекционным материалом в плоскодонные пробирки с монослоем и центрифугируют, затем инкубируют в термостате при 37°С в течение 2-х часов, удаляют изолирующую среду и добавляют новую порцию изолирующей среды с циклогексамидином. Материал инкубируют в термостате при 37°С 48-72 часа. После инкубации приготовленные препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе и определяют включения возбудителя ИФМ.

Выделение хламидий в культуре клеток позволяет выявить жизнеспособные хламидий и определить их чувствительность к антимикробным препаратам.

Исключить артефакты, возникающие при диагностике хламидиоза люминесцентными методами, позволяет дополнительный тест. Предложенный проф. В.В. Делекторским тест основан на том, что элементарное тельце хламидий представляет собой кристаллоид, что является следствием макромолекулярной упаковки ДНК. Перефокусировка люминесцентного микроскопа приводит к возникновению по периферии элементарного тельца четкого дифракционного кольца (кольцо Френеля).

Другие микроорганизмы, а также ретикулярное тельце хламидий, дифракционное кольцо не образуют. Достоверность метода не требует находки 10 элементарных телец в микроскопе. Диагноз считается положительным, если в препарате обнаруживается 2-3 элементарных тельца, образующих при фокусировке дифракционные кольца. Наличие дифракционного кольца у исследуемых структур является дополнительным диагностическим тестом, позволяющим исключить ошибки диагностики.

Следует особенно отметить, что при наличии смешанного процесса, в частности гонорейно-хламидийного, диагностика хламидиоза ИФМ затруднена. Это связано с тем, что при гонорее за счет большого количества лейкоцитов слизистые покрыты слоем белка, следствием чего является большое количество ложноотрицательных результатов. Инкубационный период при гонорейной и хламидийной инфекциях различен, поэтому при одновременном инфицировании этими двумя микроорганизмами, хламидии могут выявляться значительно позже.

Серологическое исследование используется как дополнительный метод для обоснования диагноза.

Серодиагностика основана на определении антител к хламидиям в сыворотке крови методами ИФА, РСК, РНГА. В качестве антигенов используются родоспецифические антигены (ЛПС), полученные из хламидий, диагностический титр 1:64. ИФА применяют так же как дополнительный серологический метод при дифференциальной диагностике инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами.

Молекулярно-биологические исследования

Метод гибридизации ДНК. Из исследуемых образцов выделяют суммарную ДНК. Образцы исследуемой ДНК и контрольные образцы денатурируют кипячением, фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и гибридизируют с предварительно денатурированным биотированным ДНК-зондом. Несвязавшийся зонд удаляют путем отмывки фильтра. На следующем этапе фильтр обрабатывают конъюгатом стрептовидина с щелочной фосфатазой. На заключительном этапе вносят субстратный раствор. Окрашивание соответствующих точек свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом материале.

Рабочие растворы готовят согласно инструкции предприятия изготовителя тест-системы. Гинекологические мазки переводят в физиологический раствор и центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а оставшуюся суспензию клеток хранят в замороженном виде до проведения анализа.

Результаты гибридизации оцениваются визуально путем сравнения с интенсивностью окраски пятен контрольных проб. Положительными считаются образцы, имеющие окраску пятна, отчетливо отличающуюся вследствие большей интенсивности от фоновой окраски.

ПЦР: в настоящее время ПЦР является наиболее распространенной и объективной методикой - диагностики хламидийной инфекции. Клинический материал для ПЦР собирают в пробирки с буферным раствором и хранят в морозильных камерах (повторное замораживание-оттаивание не допускается). Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Критерии излеченности при хламиднозе:

Все пациенты после окончания лечения проходят клинико-лабораторный контроль. Первый контроль - сразу после завершения лечения. Если обнаруживаются единичные элементарные тельца, то курс лечения можно продолжить не более, чем на 10 дней. У женщин контрольное исследование проводится во время 1-2 ближайших менструальных циклов. Мужчины клинико-лабораторный контроль проходят в течение 1-2 месяцев.

При наличии поражения глаз и суставов схема лечения удлиняется до 21 дня.