Некоторые характеристики различных серологических методов

Таблица 8.

Свойство реакции	Название реакции
	Микрореакция	РПГА	ИФА	РИФ
Применимость	скрининг	Подтверждение и/или скрининг	Подтверждение и/или скрининг	Подтверждение
Оценка результатов	визуальная	визуальная	инструменталь- ная	визуальная
Необходимое оборудование	Орбитальный ротатор	не требуется	спектрофотометр плашечный	люминис- центный микроскоп
Время получения результата	8-15 минут	45-60 минут	1.5-2.5 часа	Более 2 часов

Микробиологическая диагностика гонореи

Материал для исследования: гнойное отделяемое и мазки со слизистых оболочек мочеполовых органов и прямой кишки, отделяемое конъюнктивы глаза при бленнорее.

Методы диагностики:

1. бактериоскопический

2. бактериологический

3. серологический

4. экспресс-методы: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования.

Для качественного проведения лабораторной диагностики гонореи важное значение имеет правильное взятие от больного патологического материала, правильное приготовление мазков и производство посева. Материал для исследования должен быть максимально быстро доставлен в лабораторию в избежания аутолиза гонококков, которые очень чувствительны к изменению температуры и охлаждению.

Бактериоскопическое исследование

Методика: взятый материал наносят тонким равномерным слоем обязательно на два предметных стекла, фиксируют спиртом, высушивают и окрашивают - одно метиленовым синим или бриллиантовым зелёным, другое - по Граму. Оба окрашенных мазка исследуют под микроскопом. Мазки, окрашенные метиленовым синим, нужно использовать для изучения морфологии и расположения диплококков, в то время как окончательный лабораторный диагноз гонореи ставится на основании мазков, окрашенных по Граму.

Оценка результата: при положительном результате в мазках обнаруживаются грамотрицательные диплококки бобовидной формы, которые могут располагаться как внутри лейкоцитов, так и внеклеточно. При правильной окраске по методу Грама ядра клеточных элементов (лейкоцитов, эпителиальных клеток) должны частично удерживать основную фиолетовую окраску (критерий правильности окраски), т.е. в центре они должны быть окрашены в фиолетовый цвет, а по периферии - в оранжево-красный. Гонококки, расположенные в лейкоцитах и на эпителиальных клетках, будут оранжево-красные. Внутри лейкоцитов диплококки располагаются парами или группами так, что одни диплококки лежат по отношению к другим под различными углами. Внеклеточное расположение гонококков также имеет свои характерные особенности. Часто гонококки лежат на клетках плоского эпителия в большом количестве рядами с расположением диплококков под углом или перпендикулярно друг к другу внутри ряда. Частота внутри- и внеклеточного расположения гонококков зависит как от периода заболевания, так и от методики взятия материала.

Положительный бактериоскопический диагноз ставится в основном при острой форме гонореи до применения антибиотиков. При хронической гонорее бактериоскопическое исследование часто даёт отрицательный результат, т.к. в этих случаях возбудители могут иметь атипичную форму в виде шаров или, наоборот, очень мелких образований. Кроме того, в препарате обнаруживают разнообразную постороннюю микрофлору, лейкоциты, эпителиальные и другие клеточные элементы.

При хроническом или торпидно протекающем воспалительном процессе, если после первого исследования мазков гонококки в отделяемом не обнаружены, производят комбинированную провокацию с 3-х дневным (через 24-48-72 часа) бактериоскопическим исследованием отделяемого слизистых оболочек тех же очагов.

Виды провокации

1. Биологическая. Взрослым гоновакцина вводится однократно внутримышечно в количестве 500 млн. микробных тел. Детям до 3-х лет гоновакцину не вводят. Детям старше 3-х лет вводят 100-200 млн. микробных тел. Если гоновакцина уже применялась во время лечения, то для провокации назначают двойную последнюю терапевтическую дозу, но не более 2 млрд. микробных тел. Или, при отсутствии гоновакцины вводят пирогенал в дозе 250 МИД.

2. Химическая. Женщинам производится смазывание уретры 1% раствором, цервикального канала - 5% раствором азотнокислого серебра. Прямую кишку смазывают раствором Люголя на глицерине. Мужчинам вводят на 2-3 минуты в мочеиспускательный канал 0,5% раствор азотнокислого серебра, прямую кишку обрабатывают раствором Люголя на глицерине. При отсутствии азотнокислого серебра используют раствор Люголя на глицерине для обработки всех очагов у мужчин, женщин и детей.

3. Термическая. Женщинам назначают диатермию с абдоминально-вагинально-сакральным расположением электродов в течение 3-х дней (30,40,50 минут). Через 1 час после каждого прогревания производят забор материала для исследования.

4. Механическая. Мужчинам проводят провокационное введение бужа в уретру на 10 минут и массаж её на буже, а женщинам - наложение металлического колпачка на шейку матки, через 24 часа материал из колпачка исследуют в окрашенных мазках или переносят на питательные среды для культурального исследования.

5. Физиологическая. На 2-3 день после начала менструации, когда в результате усиленного притока крови к тазовым органам создаются благоприятные условия для активизации воспалительного процесса, производится забор отделяемого на мазки и посев. Другие виды провокации во время менструации производить нельзя.

6. Алиментарная. Рекомендуют употребление солёной или острой пищи за 24 часа до лабораторного исследования.

Лучшим методом провокации является одновременное комбинированное применение указанных её видов с учетом противопоказаний.

Бактериологическое исследование

Показания к бактериологическому исследованию:

• воспалительные заболевания мочеполовых органов

• подтверждение гонорейного заболевания

• окончание лечения гонореи и снятие с учета

• окончание лечения трихомониаза и других негонококковых заболеваний

• обнаружение при бактериоскопическом исследовании измененных микроорганизмов, похожих на гонококки

• определение чувствительности гонококков к антибиотикам

• требование следственных органов и судебной экспертизы

Питательные среды: наиболее широко используются два вида сред – асцит-агар и безасцитные питательные среды с добавлением казеина, дрожжевого экстракта и сыворотки крови. Основой обеих сред является МПА из мяса кроликов или свежих бычьих сердец. Асцитическая жидкость должна быть получена от больных с асцитом, причиной которого является сердечная недостаточность, и не должна содержать желчных пигментов.

Методика: выращивание гонококков можно производить в пробирках или на чашках Петри. Посевы инкубируют при 37°С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (не менее 3%) в течение 24-72 часов. Гонококки образуют круглые прозрачные колонии, напоминающие капли росы в отличие от более мутных колоний стрептококков или пигментированных колоний стафилококков, которые также могут расти на этих средах. При снятии колоний с поверхности среды петлей или при получении суспензии гонококков в изотоническом растворе хлорида натрия или водопроводной воде с целью получения мазков из культур на предметном стекле определяется их слизистая консистенция. Подозрительные колонии пересевают в пробирки на соответствующие среды для получения чистых культур, которые идентифицируют по сахаролитическим свойствам на средах «пестрого ряда» или с помощью микротестсистем. Гонококки ферментируют только глюкозу с образованием кислоты.

Дифференциальная диагностика: важное эпидемиологическое значение имеет выявление экстрагенитальных очагов гонореи. В связи с тем, что бактериоскопия при гонорее миндалин и глотки дает обычно отрицательный результат, первостепенное значение приобретает бактериологическое исследование.

Ввиду наличия на слизистой оболочке миндалин и глотки большого числа различных нейссерий решающее значение приобретает выделение чистых культур грамотрицательных кокков и их тщательная идентификация путем изучения морфологических свойств, особенностей роста на питательных средах, пигментообразования и определения сахаролитических свойств. Наиболее трудным является дифференцирование гонококка от менингококка. Следует учитывать возможность получения смешанных культур гонококка с другими нейссериями. В мазках из культур гонококк отличается от других нейссерий меньшей интенсивностью окраски и четкостью контуров, более выраженным лизисом и типичным расположением в виде скоплений с густым центром и рассыпанными по периферии кокками. Это расположение обусловлено большей слизистостью колоний гонококка. Колонии большинства непатогенных нейссерий непрозрачны, гонококка и менингококка - прозрачны. Колонии гонококка мельче колоний менингококка, последние - более плоские. При изучении роста микроорганизмов через слой питательной среды с боковым электрическим освещением отмечается голубой оттенок колоний менингококка, в то время как колонии гонококка имеют цвет среды или являются беловатыми.

Серологический метод (реакция Борде – Жангу )

Принцип. Реакция связывания комплимента (РСК). Специфические антигонококковые антитела вступают в соединение со специфическим антигеном (убитая культура гонококка, содержащая 3 млрд. микробных тел в 1 мл). Образовавшиеся комплексы сорбируют вводимый в реакцию комплимент. Индикация образовавшихся комплексов достигается введением гемолитической системы (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка). РСК применяется для выявления больных гонореей, в основном при хронических и осложненных формах заболевания.

Оценка результатов: для обозначения позитивности реакции пользуются системой четырех плюсов. Полная задержка гемолиза в опытных пробирках расценивается как резко положительный результат (++++), значительная задержка гемолиза - положительный (+++), частичная задержка гемолиза слабоположительный (++ и +), незначительная задержка гемолиза - сомнительный (+/-). Полный гемолиз в опытных пробирках расценивается как отрицательный результат реакции. С положительными сыворотками крови (++++) ставят количественный метод реакции Борде-Жангу. Этим методом определяют титр антител в положительных сыворотках крови путем исследования в РСК уменьшающихся количеств сыворотки крови, разведенных изотоническим раствором хлорида натрия. Титром антител исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, давшее положительный результат (задержка гемолиза).

Экспресс-методы диагностики

• Иммунохимические исследования: антигены возбудителя могут быть обнаружены в исследуемом материале с помощью чувствительных иммунологических методов (иммуноблотинг и др.).

• Биохимические и молекулярно-биологические исследования: исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.