Лабораторная диагностика бруцеллеза

Материал - кровь (микробы размножаются в фагоцитах крови), моча больных, абортированные плоды животных, околоплодные воды, некротизированные участки плаценты, биопсийный материал печени, молоко, иногда СМЖ, костный мозг, воздух, вода.

Микроскопия

• Люминесцентная микроскопия (ИФМ –иммунофлюоресцентный метод)

• Световая микроскопия

Способ окраски: карболовый фуксин разводят водой: 1:5 и наносят на фиксированный мазок на 3 минуты. Препарат промывают водой и дополнительно окрашивают 2% раствором метиленовой синьки в течение 5 минут. Мазок промывают водой, просушивают и микроскопируют. Бруцеллы хорошо окрашиваются в ярко-красный цвет, все другие микробы - в сине-голубой. В мазках из типичных колоний обнаруживаются мелкие бактерии шаровидной, овоидной или палочковидной формы.

Бактериологическая диагностика

Условия культивирования

Бруцеллы требовательны к питательным средам. Для их культивирования используют специальные среды с добавлением сыворотки, крови (кровяной агар), глюкозы, витаминов, аминокислот. Температурный оптимум - 37°С. Оптимальный рН 6,6-7,4. Рост продолжительный (до 1месяца). Многократный пересев в лабораторных условиях делает культуры способными расти быстрее (в течении 1-2 дней). Бруцеллы можно выращивать в курином эмбрионе. В.abortus в первых генерациях нуждаются в повышенном содержании в окружающей среде (5-10%) углекислого газа.

Среды обогащения: обогатительная среда для бруцелл, печеночный бульон, среда Хоттингера, МПБ с 1% глюкозой и 1% глицерином (образцы материала можно культивировать в МПБ)

Выделение гемокультуры наиболее вероятно в начальном периоде заболевания. Кровь помещают в жидкую питательную среду, через 4-5 дней производят высев на плотные среды. Посевы выдерживают до 30 дней.

Этап выделения чистой культуры

Среды для получения чистой культуры: эритрит-агар, печеночный агар Хеддльсона. На плотных питательных средах бруцеллы образуют S-колонии 1-5 мм в диаметре, выпуклые, с янтарным оттенком серовато-белые в отраженном свете и блестящие прозрачные в проходящем свете. R-колонии сухие, с темным центром, неровными краями. S-колонии легко диссоциируют в мукоидную (М-форму) или шероховатую R-форму (под действием ряда факторов), образуют нежный грубеющий мутноватый налет.

В жидких средах наблюдается диффузный рост (равномерное помутнение) со слизистым гомогенным осадком.

Идентификация бактерий рода бруцелл включает:

1. Ферментацию D-глюкозы, L-аланина, D-рибозы, D-ксилозы

1. Чувствительность к фагу Т 6

2. Образование H₂S

3. Рост на средах, содержащих анилиновые красители (фуксин, тионин, пиронин)

Биологический метод диагностики

Биологический метод необходим для изучения вирулентности бруцелл, испытания вакцин, антибиотиков и других экспериментальных работ.

1) Кожные пробы. Внутрикожная проба Бюрне (с различными антигенами) является хорошим индикатором бруцеллеза. В/к вводят 0,1 мл бруцеллина в область предплечья. Через 6-24 часа образуется болезненный инфильтрат размером 4 x 6 см, развивается гиперемия. Реакция положительная к концу 1-го месяца заболевания и у вакцинированных лиц.

2) Пробы на животных. Материал (кровь) вводят подкожно (1-2 мл) или внутрибрюшинно. Через 30 дней животных обследуют на наличие антител или антигена (забор сыворотки на 10-15 день); бактериологически (посев биопсийного материала; фагодиагностика); патологоанатомически.

- ПЦР

Серологическая и иммунологическая диагностика

1) РА (развернутая реакция агглютинации Райта, реакция агглютинации на стекле Хеддльсона) используется только для диагностики острой формы заболевания. Серологическую диагностику проводят с 10 - 12 дня, когда появляются антитела. Наиболее высокий титр антител обнаруживается в стадии бактериемии. Через 2-3 месяца РА отрицательные в 20 % случаев, а через полгода - в 50 - 60 %.

Ориентировочная реакция агглютинации Хеддльсона. Является предварительной пробой обнаружения антител в сыворотке больного. Реакцию ставят на обычном сухом стекле, хорошо обезжиренном и расчерченном на 6 квадратов размером 4 х 4 каждый. В квадраты последовательно наносят (0,04, 0,02, 0,01 мл) сыворотки больного и контроль 0,02 мл. К первым трем объемам добавляют 0,03 мл неразведенного бруцеллезного единого диагностикума. В контроль сыворотки добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Компоненты осторожно размешивают стеклянной палочкой. Последовательность смешивания: от минимальной дозы сыворотки к максимальной. Контроль антигена – один для всех сывороток данного опыта (0,03 антигена + 0,03 физиологического раствора). Стекло прогревают 2 минуты над пламенем горелки до 37ºС. В положительных случаях агглютинация антигена происходит немедленно. За счет подкрашивания диагностикума (антигена) генцианвиолетом или другим анилиновым красителем образуются ясно видимые хлопья агглютината. Максимальный срок наблюдения - 8 минут.

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительная реакция в 3-х дозах в сочетании с положительной аллергической пробой.

Развернутая РА Райта. Реакцию Райта ставят методом «равных объемов». Результаты считывают через сутки после инкубации при 37°С. Диагностический титр - 1/200.Сыворотку больного и диагностикум разводят физиологическим раствором, в который предварительно добавляют 0,5% раствор фенола (так называемый карболизированный физиологический раствор).

Постановка реакции: сыворотку больного раститровывают по карболизированному физиологическому раствору (0,5 + 0,5 мл) добавляют

бруцеллезный единый диагностикум в разведении 1:10 (0,5 мл).

При титре антител 1:50 - результат «сомнительный», при титре антител 1:100-1:200 - результат «положительный», 1:800 и выше - результат «резко положительный»

2) Кольцевая проба Банга на бруцеллез используется для выявления антител в молоке. В пробирку с молоком вносят убитую культуру бруцелл, окрашенных гематоксилином.

При отсутствии антител молоко гомогенно окрашивается в синий цвет. При наличии в молоке антител происходит преципитация бактерий и образование (сверху) темно-синего кольца.

3) Неполные антитела выявляют реакцией Кумбса и Винера. Неполные антитела определяются во все фазы инфекционного процесса, но наибольшее диагностическое значение реакция Кумбса приобретает при хроническом бруцеллезе и в отдаленные сроки обследования.

4) Реакция латекс-агглютинации (РАЛ)

5) ИФА