3 Этапа идентификации микобактерий:

1. Родовая идентификация микобактерий.

2. ДифференциацияТМБ ( микобактерий туберкулёзного комплекса) и НТМБ

3. Идентификация вида микобактерий.

4. Бактериоскопический метод. Основным методом является бактериоскопия. Мазки окрашиваются по Цилю-Нильсену и микроскопируют, просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобактерии окрашиваются в ярко-красный цвет, располагаются поодиночке или небольшими скоплениями. Недостаток этого метода заключается в том, что позволяет выявить микобактерии при наличии 100-500 тысяч микроорганизмов в 1мл исследуемого материала. Преимущество - быстрота получения результата и невысокая стоимость исследований.

В целях повышения чувствительности метода применяют разнообразные способы обогащения материала (для мокроты метод гомогенизации и осаждения, флотации, обогащение мочи достигают центрифугированием, обогащение спинномозговой жидкости заключается в отстаивании в холодильнике 18-24 часа до образования фибриновой пленки, к которой прикрепляются микобактерии).

Обогащение мокроты. Гомогенизация. К суточной порции мокроты добавляют равный объем 1% раствора едкого натра (или антиформина), флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10-15 минут. После центрифугирования и нейтрализации кислотой из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Метод флотации: мокроту гомогенизируют и прогревают при 55°С 30 минут на водяной бане. Затем добавляют 1-2 мл ксилола, дистиллированной воды, встряхивают 10 минут и отстаивают 20 минут при комнатной температуре. На поверхности жидкости появляется сливкообразный слой - флотационное кольцо, содержащее микобактерии туберкулёза. Кольцо отсасывается пастеровской пипеткой на 2 предметных стекла, нагретых до 60°С. На стёкла материал наносят 5-6 раз и окрашивают, после фиксации, по Цилю-Нильсену.

В настоящее время наиболее результативным методом бактериоскопической диагностики является метод люминесцентной микроскопии, преимущество которого заключается в его высокой чувствительности, особенно при микроскопии материала, содержащего малое количество микобактерии, в возможности выявлять микобактерии с измененными культуральными и тинкториальными свойствами.

Бактериологический метод. Посев патологического материала на искусственные питательные среды является обязательным в тех случаях, когда микроскопическое исследование дает отрицательный результат. Культуральные методы отличаются большей чувствительностью, чем бактериоскопия. Они позволяют выделить микобактерии при наличии в исследуемом материале нескольких десятков жизнеспособных микобактерий, однако методика предварительной обработки материала довольно сложна, для выделения требуются специальные питательные среды ( Среда Левенштейна-Йенсена - яично-картофельноглицериновая; среда Петраньяни - цельное молоко, картофельный крахмал, пептон, мелко нарезанный клубень картофеля, куриные яйца, глицерин, малахитовый зеленый; среда Гельберга - яично-молочно-картофельная среда; Финна II ( подобна среде Левенштейна-Йенсена, но вместо аспарагина в ней используют глутамин натрия). На яичных питательных средах растут все виды микобактерий, а также культуры родственных микроорганизмов - родококки, коринебактерии. Наибольшее распространение получила среда Левенштейна-Йенсена, которая рекомендована ВОЗ в качестве стандартной среды для выращивания бактерий туберкулёза.

Недостатком метода является длительный период культивирования 1,5 до 12 недель. Основным преимуществом культурального метода является возможность получения чистой культуры микобактерий, что позволяет провести её идентификацию, изучение вирулентности.

Посевы просматриваются каждую неделю, отмечая время появления микробного роста. Наиболее часто признаки роста микобактерий туберкулёза появляются на 20-40й день, в виде сухого бугристого налета, белого или слегка желтоватого цвета, напоминающего цветную капусту. Микобактерии встречаются в R и S-форме, более вирулентной является R-форма. При идентификации выделенной культуры и дифференциации её от других микобактерий учитывают морфологические, тинкториальные особенности, характер и скорость роста на питательных средах, биохимические свойства и вирулентность для лабораторных животных. Из биохимических свойств чаще всего определяют способность синтезировать никотиновую кислоту (проба Конно), что характерно для М.tuberculosis (к культуре в жидкой питательной среде +1мл раствора KCN и 1мл хлорамина, через несколько минут появляется ярко-желтая окраска).

Для ускоренной диагностики используют метод Прайса и метод Школьниковой.

Метод Прайса: на предметных стеклах (ближе к одному концу) делают толстые мазки из исследуемого материала. Высушенные мазки обрабатывают 2-6% Н₂SO₄ и нейтрализуют, опускают во флаконы с гемолизированной кровью, на 48-72 часа помещают в термостат, через 7-14 дней вирулентные штаммы образуют микрокультуры имеющие вид жгутов или кос (за счет корд-фактора).

Метод Школьниковой: глубинный посев в гемолизированную кровь: обработанный серной кислотой материал сеют в пробирки с цитратной гемолизированной кровью. Через 6-8 дней пребывания в термостате материал центрифугируют, из осадка формируют толстый мазок, окрашивают по Циль-Нильсену.

Биологическая проба: наиболее чувствительным методом выявления микобактерий туберкулёза в патологическом материале является заражение морских свинок - биологическая проба. Туберкулёзные изменения в органах морской свинки могут быть обнаружены при содержании в 1мл материала даже единичных (1-5) микобактерий. Исследуемый материал обрабатывают Н₂SO₄, нейтрализуют её и вводят 2-1,5мл двум морским свинкам с отрицательной туберкулиновой пробой подкожно в область паха. В месте введения на 6-10 день появляется уплотнение, увеличивающееся со временем, на месте которого образуется незаживающая язва, наблюдается увеличение регионарных лимфатических узлов. Если животное не гибнет, то через 3 месяца животное забивают, проводят макро- и микроскопические исследования органов, делают посевы.

Кожная проба. Доступным, но имеющим ограниченное диагностическое значение, является метод кожных проб. Наиболее чувствительной является внутрикожная проба Манту. В России при массовой туберкулино-диагностике всё чаще стали использовать безигольный метод внутрикожного введения туберкулина с помощью механического инъектора БИ-1М, заряжённого определённой дозой туберкулина.

Туберкулин - общее название препаратов, получаемых из культур микобактерий туберкулёза разных видов. (Впервые получен в 1870 году Р. Кохом.) Старый туберкулин Коха - АТК (Alt-tuberculinum Koch) - недостаток в большом количестве балластов. В 1934 году Сейберт и сотрудники получили PPD (Purificol Protein Derivative), представляющий собой дериват протеина микобактерии туберкулёза, обладающих стабильной биологической активностью, лишённый сенсибилизирующих свойств. Отечественный (ППД-Л) был приготовлен в 1939 году. М.А. Линниковой, который является препаратом массового применения. В практике туберкулин применяют в целях диагностики, для определения инфицированности населения, отбора лиц, подлежащих противо-туберкулёзной вакцинации, изучения её эффективности. Реакция считается отрицательной при отсутствии инфильтрата через 48-72 часа, уколочной при папуле в 1мм, сомнительной при папуле D 2-4мм, положительной - 5-10мм (нормэргическая), гиперэргической при папуле 17мм у детей и 21 мм у взрослых.

Иммунологические методы. Используют РНГА, ИФА.

Для выявления микобактерий рекомендуется высокочувствительная и высокоспецифическая ПЦР (метод генодиагностики).