2.2.3.3. Забарвлення тотальних препаратів на гемоглобін солянокислим бензидином

Принцип методу. Гемоглобінвмісні клітини крові чи культури тканин при взаємодії із бензидином у присутності пероксиду водню та натрій ацетату утворюють продукт, що має синє забарвлення.

Обладнання. Вата, скарифікатори, предметні скельця, шліфоване скло, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, кювета для забарвлення препаратів, секундомір, мікроскоп, рукавички.

Реактиви

1. Бензидин – 1 % спиртовий розчин солянокислого бензидину (1 г солянокислого бензидину розчиняють у 100 мл 96 % спирту).

2. Пероксид водню – 3 % розчин (готують безпосередньо перед використанням).

3. Натрій ацетат – 10 % водний розчин.

Матеріал. Препарати тканинних культур, суспензія клітин, мазки-відбитки тощо.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Виготовляють мазки крові (див. п. 2.1.2.8), висушують. До нативної нефіксованої культури тканини чи нефіксованого мазка крові додають 3−5 мл 1 % розчину солянокислого бензидину, через 30−40 с – 0,5 мл розчину пероксиду водню, потім (через 1−2 хв) ще 0,5 мл 10 % розчину натрій ацетату.

Оцінка результатів. В еритроїдних, гемоглобіновмісних колоніях, кластерах і окремих клітинах, які містять гемоглобін, відбувається кольорова реакція з утворенням продукту, забарвленого у синій колір. Оцінку гемоглобіновмісних елементів на мазках проводять у режимі світлової мікроскопії за збільшення ×1 200 під імерсійною олією за шкалою +++, ++, +, 0. Для визначення клітин з позитивною реакцією на гемоглобін підраховують кількість клітин з різною інтенсивністю реакції (+++, ++, +, 0); всього рахують 1 000 клітин на мазку. За пропорцією визначають розподіл.

2.2.3.4. Визначення вмісту лужностійкого гемоглобіну

Принцип методу. Гемоглобін F відрізняється від гемоглобіну А значною стійкістю до дії лугів. За допомогою лугу проводять денатурацію гемоглобіну А, а гемоглобін F визначають спектрофотометрично.

Існують такі методи визначення вмісту лужностійкого гемоглобіну:

• Метод к. Зінгера

Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, піпетки, груші, дозатори, годинник, центрифуга, центрифужні пробірки, пробірки типу Еппендорф, знезолений фільтр, лійка, рукавички.

Реактиви

1. Етиловий спирт – 70 º розчин.

2. Фізіологічний розчин – 0,9 % розчин натрій хлориду.

3. Натрій цитрат – 5 % розчин.

4. Натрій гідроксид – 0,1 н розчин (рН 12,7), зберігають у запарафінованій пляшці в холодильнику.

5. Амоній сульфат – 50 % розчин: до 100 мл розчину (NН₄)₂S0₄ додають 0,85 мл концентрованої хлоридної кислоти.

6. Аміак – 0,04 % розчин: 0,40 мл 25 % аміаку доводять до 25 мл дистильованою водою.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Готують цитратну кров: до 500 мкл крові додають 50 мкл 5 % розчину натрій цитрату (правильне співвідношення крові і антикоагулянту (в даному випадку натрій цитрату) 10:1. Кров з антикоагулянтом переносять у центрифужні пробірки. Якщо об’єм крові невеликий (від 0,2 до 0,5 мл), то можна проводити центрифугування в пробірках типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар (плазма) відсмоктують пастерівською піпеткою або за допомогою шприца з довгою голкою і виливають. Еритроцити тричі промивають охолодженим фізіологічним розчином (0,9 % розчин натрій хлористого) при 3 000 об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою у співвідношенні 1:2 (еритроцитарна маса : дистильована вода). Суміш перемішують протягом 10 хв і центрифугують 10 хв при 8 000 об/хв для відділення стром еритроцитів. За допомогою шприца з довгою голкою відбирають супернатант (гемолізат) і переносять в чисту пробірку Еппендорф.

До 0,2 мл водного розчину гемолізату додають 1,8 мл 0,1 н NаОН і секундоміром фіксують час 1 хв. Через 1 хв проводять осадження, додаючи 4,0 мл 50 % розчину амоній сульфату. Відразу після цього суміш добре перемішують і фільтрують через подвійний знезолений фільтр. На фільтрі залишається гемоглобін А, а фільтрат містить гемоглобін F, який визначають спектрофотометрично при довжині хвилі 541 нм.

Контрольну пробу, за якою обчислюють загальний вміст гемоглобінів (А + F), готують так: до 0,1 мл гемолізату додають 5,9 мл 0,04 % розчину NН₄ОН і міряють екстинкцію при довжині хвилі 541 нм. Процент гемоглобіну F розраховують за формулою:

де Е₁ – екстинкція досліджуваного розчину після осадження гемоглобіну А; Е₂ – екстинкція контрольної проби; 2 – коефіцієнт для порівняння концентрацій.

• Метод К. Зінгера у модифікації Н. О. Сибірної

Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, піпетки, груші, дозатори, годинник, центрифуга, центрифужні пробірки, пробірки типу Еппендорф, знезолений фільтр, лійка, рукавички.

Реактиви

1. Етиловий спирт – 70 º розчин.

2. Фізіологічний розчин – 0,9 % розчин натрій хлориду.

3. Натрій цитрат – 5 % розчин.

4. Натрій гідроксид – 1,2 н розчин.

5. Розчин Драбкіна: NаНСО₃ – 1 г; КСN – 0,05 г; К₃[Fe(CN)₆] – 0,2 г; дистильованої води – до 1,0 л.

6. Амоній сульфат – насичений розчин: однакові об’єми (NН₄)₂S0₄ і дистильованої води нагрівають протягом 10 хв до +70 ºС, гарячий розчин фільтрують; при охолодженні амоній сульфат викристалізовується.

Хід роботи

Отримують кров шляхом скарифікації шкіри пальця. Готують цитратну кров: до 0,1–0,2 мл крові додають 0,01–0,02 мл 5,0 % розчину натрій цитрату (правильне співвідношення крові і антикоагулянту (в даному випадку натрій цитрату) 10:1). Кров з антикоагулянтом переносять у пробірки типу Еппендорф. Еритроцити відділяють від плазми крові шляхом центрифугування цитратної крові в пробірках Еппендорф при 3 000 об/хв протягом 5 хв. Верхній шар плазми відсмоктують за допомогою шприца з довгою голкою і виливають. Еритроцити тричі промивають охолодженим фізіологічним розчином (0,9 % розчин натрій хлористого) при 3 000 об/хв по 5 хв. Відмиті еритроцити гемолізують дистильованою водою, додаючи до 0,05 мл еритроцитарної маси 0,10 мл дистильованої води. Суміш перемішують протягом 10 хв і центрифугують 10 хв при 8 000 об/хв для відділення стром еритроцитів. За допомогою шприца з довгою голкою відбирають супернатант (гемолізат) і переносять в чисту пробірку Еппендорф.

Для визначення концентрації гемоглобіну з отриманого гемолізату відбирають 0,02 мл, додають 5 мл розчину Драбкіна і через 20 хв вимірюють екстинкцію розчину при довжині хвилі 540 нм (зелений світлофільтр) у кюветі шириною 10 мм проти контролю – розчину Драбкіна на фотоелектроколориметрі.

Концентрацію гемоглобіну обчислюють за формулою:

С_Нв = Е₅₄₀ × 251 × 1,45,

де С_Нв – концентрація гемоглобіну в гемолізаті, г/л, або мг/мл; 251 – розведення; 1,45 – коефіцієнт перерахунку.

Отже, гемоглобін, який містився в отриманому гемолізаті перевели у ціанметформу і визначити його концентрацію. Якщо в гемолізаті міститься приблизно 10 г% гемоглобіну, то до отриманого розчину ціанметгемоглобіну додають реактив Драбкіна до кінцевої концентрації 0,5 г%.

Приклад розрахунку. Розведення ціанметгемоглобіну = 10 г% / 0,5 г% = 20 раз. Таким чином, з 5 мл розчину ціанметгемоглобіну, який фотометрували, відбираємо 0,5 мл і доводимо до 10 мл реактивом Драбкіна.

Відбирають 2,8 мл розведеного розчину ціанметгемоглобіну і ретельно змішують з 0,2 мл 1,2 н NаОН. Рівно через 2 хв додають 2,0 мл насиченого розчину амоній сульфату. Старанно перемішують вміст пробірки. Гемоглобін А випадає в осад, а гемоглобін F залишається у розчині. Осад відфільтровують через подвійний фільтр. Отриманий фільтрат фотометрують Е₁ проти холостої проби при довжині хвилі 540 нм.

Холосту пробу готують так: 0,4 мл 0,5 г% розчину ціанметгемоглобіну змішують з 6,75 мл дистильованої води. Ця проба дає екстинкцію вихідної кількості гемоглобіну Е₂ (у співвідношенні 1:10).

Розрахунки проводять за формулою: