2.2.1.3. Визначення осмотичної резистентності еритроцитів

Принцип методу. Осмотична резистентність еритроцитів – це здатність еритроцитів протистояти дії гіпотонічних розчинів натрій хлориду. В гіпертонічних сольових розчинах еритроцити зморщуються, а в гіпотонічних – набухають (рис. 2.21). При значному набуханні гемоглобін виходить з еритроцитів в оточуючу рідину і виникає гемоліз.

Рис. 2.21. Вплив сольових розчинів на перерозподіл води в еритроцитах

Ізотонічним сольовим розчином для еритроцитів є 0,85 % розчин натрій хлориду. Гемоліз починається в концентрації, близькій до ізотонічного розчину; інколи вже при концентрації натрій хлориду 0,75 % гемолізується 7−10 % еритроцитів. При концентрації 0,3 % в нормі гемолізують всі еритроцити, а при мікросфероцитозі – лише 80−90 %. Гемоліз завершується при концентрації розчину натрій хлориду 0,36−0,56 %, тобто підвищується як верхня (мінімальна резистентність), так і нижня (максимальна резистентність) межі резистентності. Амплітуда резистентності звужується.

Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, пробірки типу Еппендорф, центифуга, центрифужні пробірки, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, рукавички, фотоелектроколориметр, кювети.

Реактиви

1. Натрій цитрат − 5 % розчин.

2. Основний розчин − 27,31 г двозаміщеного натрій фосфату Na₂HPO₄; 4,86 г однозаміщеного натрій фосфату NaH₂PO₄ ×2Н₂О; 20,0 г натрій хлориду в 2 л дистильованої води, рН 7,4.

3. Робочий розчин − основний розчин розводять у 10 разів, і він відповідає за своєю осмотичною концентрацією 1 % розчину натрій хлориду, з якого готують такі розведення (%): 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,25; 0,20; 0,15; 0,10.

Хід роботи

У дві стерильні пробірки типу Еппендорф з трьома краплями 5 % натрій цитрату наливають по 400 мкл крові в кожну. Одну пробірку ставлять на добу в термостат при температурі 37 ºС, другу – використовують в день взяття крові. В 15 центрифужних пробірок розливають по 5,0 мл розчину натрій хлориду з концентрацією від 0,85 % до 0,10 %. В кожну пробірку додають по 20 мкл цитратної крові, ще раз перемішують і дають відстоятися протягом 30 хв при кімнатній температурі (20 ºС), центрифугують при 2 000 об/хв протягом 5 хв. Надосадову рідину з кожної пробірки зливають і вимірюють на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 500−560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною 1,0 см проти 1 % розчину натрій хлориду.

Приклад розрахунку. За 100 % приймають гемоліз у пробірці, яка містить 0,1 % розчин натрій хлориду. Порівнюють величини екстинції надосадової рідини останніх пробірок з екстинцією, прийнятою за 100 %, і вираховують процент гемолізу в кожній пробірці за формулою:

де Е1 – екстинція надосадової рідини в пробірці з 0,1 % розчином натрій хлориду; Ех – екстинція досліджуваної проби; 100 – процент гемолізу в пробірці з 0,1 % розчином натрій хлориду.

Наступного дня повторюють дослідження з кров’ю, яку інкубували протягом 24 год в термостаті при температурі 37 ºС для виявлення прихованого гемолізу.

Нормальні значення. В нормі при концентрації натрій хлориду менше 0,45−0,50 % починається вихід гемоглобіну з еритроцитів – це мінімальна резистентність (гемолізуються найменш стійкі еритроцити), при подальшому зменшенні концентрації – гемолізуються і більш стійкі еритроцити, а при 0,35−0,30 % − найбільш стійкі, що визначається як максимальна резистентність. Нормальні величини осмотичної резистентності наведені в таблиці.

Концентрація розчину натрій хлориду, %	Гемоліз, %
	У свіжій крові	У крові, інкубованій протягом доби
0,20 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,85	98−100 97−100 90−100 50−100 5−45 0−6 0 0 0 0 0 0	95−100 85−100 75−100 65−100 55−100 40−85 15−70 0−40 0−10 0−5 0 0

Примітка. Осмотичну резистентність еритроцитів необхідно досліджувати не тільки у свіжій крові, а і в інкубованій протягом 24 год при температурі 37 ºС, тому що в окремих випадках при мікросфероцитарній гемолітичній анемії зниження осмотичної резистентності можна виявити тільки в інкубованій крові.

Зростання проценту гемолізованих еритроцитів, починаючи з 0,85 % розчину натрій хлориду до 0,20 %, відображає почерговість залучення до гемолізу еритроцитів зі зниженою стійкістю. Це дає змогу розрізняти еритроцити за їхньою індивідуальною стійкістю.

Нормальні величини осмотичної резистентності у практично здорових дорослих людей характеризується спаданням кривої осмотичної резистентності у разі використання 0,50 % розчину натрій хлориду з мінімальним гемолізом у 0,70 % розчині натрій хлориду та досягненням нульової позначки у 0,75-0,85 % розчині натрій хлориду. Криву осмотичної резистентності можна розділити на три відрізки.

1. Відрізок при концентрації натрій хлориду 0,55−0,50 % – гемолізуються найменш стійкі еритроцити віком понад 90 днів.

2. Відрізок при концентрації натрій хлориду 0,45−0,40 % відповідає середньостійким еритроцитам у віці 30–90 днів.

3. Відрізок при концентрації натрій хлориду 0,35−0,30 % відповідає еритроцитам з максимальною резистентністю. Це молоді еритроцити віком до 25–30 днів.

Клініко-діагностичне значення. Зміни в осмотичній резистентності еритроцитів спостерігаються при гемолітичній хворобі новонароджених (несумісність груп і за резус-фактором). У таких випадках верхня межа резистентності становить 0,48−0,60 %, а нижня 0,34−0,44 %.

Такі ж зміни можна спостерігати і при отруєнні свинцем. Невеликі зміни резистентності еритроцитів спостерігаються при гестозах, бронхопневмонії, малярії, лейкозах, цирозі печінки та ін.