- •Розділ 2. Дослідження системи крові
- •2.1. Загальний аналіз крові
- •2.1.1. Гематологічні дослідження
- •2.1.2. Загальний клінічний аналіз крові
- •2.2. Система еритрону
- •2.2.1. Дослідження морфології та функції еритроцитів
- •2.2.2. Морфологічна ідентифікація та кількісний аналіз ретикулоцитів периферичної крові
- •2.2.3. Гетерогенна система гемоглобіну
- •2.2.3.1. Визначення концентрації гемоглобіну
- •Метод к. Зінгера
- •2.2.4. Серологічні дослідження крові
- •2.2.4.3. Визначення групи крові та резус-фактора людини за допомогою тест-реагентів «Цоліклон»
- •2.2.5. Диференціальна діагностика анемій та гемоглобінопатій
- •2.3. Лейкоцити – гетерогенна група клітин периферичної крові
- •2.3.1. Виділення та дослідження функціонального стану лейкоцитів
- •2.3.2. Дослідження апоптозу лейкоцитів периферичної крові
- •2.4. Дослідження системи гемостазу
- •2.4.1. Дослідження ролі тромбоцитів у процесі гемостазу
- •2.5. Дослідження клітин кісткового мозку
- •2.5.1. Виділення та дослідження морфології клітин кісткового мозку
- •2.5.2. Цитохімічні дослідження клітин кісткового мозку
- •2.6. Визначення імунологічних показників крові
- •Розділ 2. Дослідження системи крові Організація роботи на практикумі “Дослідження системи крові”
- •2.1. Загальний аналіз крові
- •3. Гомеостатична функція.
- •2.1.1. Гематологічні дослідження
- •2.1.1.1. Техніка проколу шкіри пальця та взяття крові для клініко-біохімічних аналізів
- •2.1.1.2. Визначення гематокритної величини
- •Уніфікований мікрометод визначення гематокриту (загального об’єму еритроцитів, модифікація і. Тодорова)
- •2.1.1.3. Визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом
- •Визначення концентрації глюкози в сироватці крові
- •2.1.1.4. Глюкозотолерантний тест
- •2.1.1.5. Визначення загального вмісту білків сироватки крові
- •Алгоритм побудови калібрувального графіка для визначення загального білка сироватки крові
- •Алгоритм побудови калібрувального графіка для визначення загального білка сироватки крові
- •2.1.1.6. Електрофорез білків сироватки крові на папері
- •2.1.1.7. Електрофорез білків сироватки крові в агаровому гелі
- •2.1.2. Загальний клінічний аналіз крові
- •Лейкоцитарний росток. Лейкоцити периферичної крові поділяються на гранулоцити (нейтрофіли, еозинофіли, базофіли) і агранулоцити (лімфоцити, моноцити) (рис. 2.13).
- •2.1.2.1. Визначення швидкості осідання еритроцитів (шое)
- •2.1.2.2. Визначення концентрації гемоглобіну
- •Хід роботи
- •Різні розмірності вираження концентрації гемоглобіну
- •2.1.2.3. Визначення кількості еритроцитів в 1 л крові
- •2.1.2.4. Розрахунок середнього вмісту гемоглобіну в еритроциті
- •2.1.2.5. Розрахунок кольорового показника крові
- •2.1.2.6. Визначення кількості лейкоцитів в 1 л крові
- •2.1.2.7. Визначення кількості тромбоцитів в 1 л крові
- •2.1.2.8. Техніка виготовлення мазків крові
- •2.1.2.9. Підрахунок лейкоцитарної формули периферичної крові
- •2.2. Система еритрону
- •2.2.1. Дослідження морфології та функції еритроцитів
- •2.2.1.1. Підрахунок кількості еритроцитів меланжерним методом
- •2.2.1.2. Визначення глікогену еритроцитів цитохімічним методом
- •2.2.1.3. Визначення осмотичної резистентності еритроцитів
- •2.2.1.4. Визначення резистентності еритроцитів до кислотного гемолітика
- •Кінетика гемолізу еритроцитів
- •2.2.1.5. Виявлення базофільної зернистості еритроцитів
- •2.2.1.6. Безапаратне фракціонування еритроцитів крові у градієнті густини сахарози
- •2.2.2. Морфологічна ідентифікація та кількісний аналіз ретикулоцитів периферичної крові
- •2.2.2.1. Визначення кількості ретикулоцитів
- •1. Фарбування ретикулоцитів блискучим крезиловим синім безпосередньо на предметному склі.
- •2. Фарбування ретикулоцитів у пробірках.
- •2.2.2.2. Визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів
- •2.2.3. Гетерогенна система гемоглобіну
- •2.2.3.1. Визначення концентрації гемоглобіну
- •Хід роботи
- •Хід роботи
- •2.2.3.2. Визначення гемоглобіну у фіксованих препаратах
- •2.2.3.3. Забарвлення тотальних препаратів на гемоглобін солянокислим бензидином
- •2.2.3.4. Визначення вмісту лужностійкого гемоглобіну
- •Метод к. Зінгера
- •2.2.3.5. Кількісне визначення термолабільного гемоглобіну
- •2.2.3.6. Визначення вмісту глікозильованого гемоглобіну
- •2.2.3.7. Визначення фетального гемоглобіну на мазках крові
- •2.2.4. Серологічні дослідження крові
- •2.2.4.3. Визначення групи крові та резус-фактора людини за допомогою тест-реагентів «Цоліклон»
2.2.1.1. Підрахунок кількості еритроцитів меланжерним методом
Принцип методу. У визначеному об’ємі камери Горяєва під мікроскопом підраховують еритроцити, а потім перераховують отриманий результат на 1 мкл чи 1 л крові. Кров розводять у меланжері, аби зменшити кількість клітин, що перебуватимуть в одному полі зору під мікроскопом.
Обладнання. Вата, скарифікатори, еритроцитарний меланжер, камера Горяєва, гумова трубка з грушею, покривні скельця, мікроскоп, рукавички.
Реактиви
1. Спирт – 70 º розчин.
2. Натрій хлорид – 0,9 % розчин.
3. Дезрозчин.
Хід роботи
Кров, отриману шляхом скарифікації шкіри (з пальця, з крайової вени вуха кролика, з кінчика хвоста у мишей і щурів тощо), набирають в еритроцитарний меланжер до позначки 0,5; потім фізіологічним розчином доводять об’єм до позначки 101. Протягом 3–5 хв добре перемішують одержану рідину збовтуванням. Видаляють перші три краплі та переносять зразок у камеру Горяєва. Через 1–2 хв після осідання еритроцитів на дно камери рахують їхню кількість під мікроскопом. Підрахунок проводять у п’яти великих квадратах, що містять по 16 маленьких квадратів, розташованих по діагоналі.
Загальну кількість еритроцитів визначають за формулою:
Х = (А × 400 × 200) ∕ 80,
де Х – загальна кількість еритроцитів у 1 мкл крові; А – підрахована загальна кількість еритроцитів у п’яти великих квадратах; 200 – коефіцієнт розведення; 80 – кількість підрахованих малих квадратів.
Нормальні значення та клініко-діагностичне значення див. п. 2.1.2.3.
2.2.1.2. Визначення глікогену еритроцитів цитохімічним методом
Принцип методу. Цито- і гістохімічні методи дослідження гемопоетичних клітин спрямовані на виявлення певних хімічних речовин (наприклад, Феруму, Кальцію, білків, ліпідів, нуклеїнових кислот, глікогену, ферментів) чи функціональних груп (наприклад, аміногруп, альдегідних, сульфгідрильних). Вони базуються на специфічному зв’язуванні барвників із певними хімічними сполуками (наприклад, ДНК і РНК) чи утворенні забарвлених продуктів у місці розташування цієї речовини (наприклад, ферменту) у результаті гістохімічної реакції. Матеріал, що використовується для вивчення гісто- і цитохімічними методами, слід фіксувати способом, що максимально зберігає речовину, яку виявляють; з цією метою бажано використовувати заморожений нефіксований матеріал. Методами цито- і гістохімії визначають розподіл і оцінюють вміст у клітинах і неклітинних компонентах тканин речовини, що належать до різних груп, − ДНК і РНК, білків, амінокислот, ліпідів, вуглеводів, мінеральних речовин, оцінюють активність ферментів.
Реакція ШЙК чи РАS – приклад одного із найбільш використовуваних гістохімічних методів. Назва методу походить від скороченої назви реактиву Шиффа – Йодна кислота (від англ. Periodic Acid Schiff). Метод використовується для виявлення вуглеводів та їхніх похідних – глікогену, глікопротеїнів, мукопротеїнів, протеогліканів і ін. Він базується на окисненні йодною кислотою гідроксильних груп цукрів до альдегідних груп, з якими зв’язується безколірний реактив Шиффа (містить фуксин), перетворюючись на стабільну сполуку червоного кольору.
Визначення глікогену еритроцитів проводять цитохімічно за методом Шабадаша.
Обладнання. Вата, скарифікатори, предметні скельця, шліфоване скло, скляні палички, піпетки, груші, дозатори, кювета для забарвлення препаратів, термометр, мікроскоп, рукавички.
Реактиви
1. Рідина Шабадаша – 0,03 М розчин калій перйодату.
2. Реактив Шиффа – 1 г фуксину для фуксин сульфітної кислоти розчиняють у 200 мл киплячої дистильованої води і охолоджують до +50 ºС. Відфільтровують і додають 20 мл 1 н хлоридної кислоти, охолоджують до +2 ºС і додають 1 г натрій метадисульфанату; розчин повинен бути прозорим, злегка жовтуватим, рН 2,0.
3. Сірчиста вода – до 10 мл 10 % розчину калій метадисульфату додають 200 мл води і 10 мл 1 н НСl.
4. Гематоксилін.
5. Реактив Шабадаша – до 100 мл етилового спирту додають 1,8 г купрум нітрату, 0,9 г кальцію нітрату і 10 мл формаліну.
Хід роботи
Виготовляють мазки крові (див. п. 2.1.2.8). Висушений мазок крові фіксують у рідині Шабадаша 30 хв, промивають у двох змінах дистильованої води та інкубують. Занурюють у перйодат на 20 хв (у темряві). Промивають у сірчистій воді 1−2 хв. Промивають у трьох змінах дистильованої води, забарвлюють реактивом Шиффа 30−40 хв (у темряві). Промивають у трьох змінах дистильованої води (по 3 хв) і у трьох змінах сірчистої води, забарвлюють водним розчином гематоксиліну (5−10 хв), промивають у дистильованій воді, висушують і мікроскопують. Глікоген забарвлюється у червоно-вишневий колір.