2.1.2.6. Визначення кількості лейкоцитів в 1 л крові
Принцип методу. У визначеному об’ємі камери Горяєва під мікроскопом підраховують лейкоцити, а потім перераховують отриманий результат на 1 мкл чи 1 л крові. Кров заздалегідь розводять пробірковим методом аби зменшити кількість клітин, що перебуватимуть в одному полі зору під мікроскопом.
Обладнання. Вата, скарифікатори, штатив з пробірками, камера Горяєва, автоматичні лічильники, покривні скельця, скляні палички, мікроскоп, піпетки, груші, дозатори, рукавички.
Реактиви
1. Спирт – 70 º розчин.
2. Рідина для розведення лейкоцитів – 3–5 % розчин оцтової кислоти, приготовлений на фізіологічному розчині і підфарбований метиленовим зеленим або синім (4 мг барвника на 10 мл рідини).
3. Дезрозчин.
Хід роботи
У наперед висушену чисту пробірку типу Еппендорф вносять 0,4 мл рідини для розведення лейкоцитів (оцтова кислота лізує залишкові кількості еритроцитів, а метиленовий зелений підфарбовує ядра лейкоцитів).
Проколюють шкіру пальця. Першу краплю знімають. Капіляр промивають фізіологічним розчином, потім ретельно видувають залишки цього розчину. Набирають 0,02 мл крові, кінчик капіляра витирають сухою ваткою, капіляр опускають на дно пробірки з рідиною для розведення і обережно видувають. Капіляр промивають два-три рази верхнім шаром розчину, ресуспендують. У клінічній лабораторній практиці приймають, що отримане спвівідношення 1:21 дорівнює 1:20. Суміш ретельно перемішують і нею заповнюють камеру Горяєва, яка заздалегідь підготовлена.
Перед використанням камеру і шліфоване скло миють та висушують. Покривне скло притирають до камери так, щоб з’явилися райдужні ньютонівські кільця (тільки за цих умов зберігається правильний об’єм камери).
Заповнення камери Горяєва: притирають покривне скло, пастерівською піпеткою набирають невелику кількість підфарбованих лейкоцитів, підносять її до щілини між камерою і покривним склом. Рідина повинна рівномірно заповнити камеру, без пухирців повітря, не затікаючи в борозни. Заповнену камеру залишають у горизонтальному положенні на 1–2 хв для осідання лейкоцитів. Оскільки лейкоцитів значно менше, ніж еритроцитів, і на великий квадрат їх припадає 1–2, то для точності їх рахують у великих квадратах (нерозграфлених). Підрахунок виконують під мікроскопом за малого збільшення (об’єктив ×8, окуляр ×10 або ×15) в затемненому полі зору (діафрагма прикрита, конденсор опущений) у 100 великих квадратах, розташованих по всій сітці камери Горяєва (рис. 2.17).
Рис. 2.17. Порядок підрахунку лейкоцитів у всій сітці камери Горяєва
Розрахунок кількості лейкоцитів (в 1 мкл) виконують за формулою:
кількість лейкоцитів у 1 мкл крові
;
х
=
а×50×103,
де а – кількість лейкоцитів, що були підраховані у певній кількості малих квадратів; 4 000 – об’єм малого квадрата (оскільки об’єм малого квадрата дорівнює 1/4 000 мм3 , то, щоб перейти до об’єму 1 мм3 (1 мкл), множимо отримане значення на 4 000); b – розведення крові; с – кількість малих квадратів, у яких рахували лейкоцити.
Приклад. У 100 великих квадратах (1 600 малих) налічується 148 лейкоцитів. Пам’ятаючи, що кров розведена у 20 разів, розраховують кількість лейкоцитів в 1 мкл крові:
Отож, щоб дізнатися точний вміст лейкоцитів в 1 мкл крові, якщо дотримано вказаних правил розведення і підрахунку, достатньо отриману внаслідок підрахунку суму поділити на два і дописати два нулі.
Нормальні значення. Загальна кількість лейкоцитів у середньому в 760 разів менша від кількості еритроцитів. У нормі в 1 мкл крові дорослої людини міститься від 4 000 до 9 000 лейкоцитів (у новонароджених кількість лейкоцитів становить 12 000–15 000 в 1 мкл, до 5 років вона зменшується до 10 000, а з 10 років встановлюється на тому ж рівні, що і в дорослих). Кількість лейкоцитів у крові коливається протягом дня, досягаючи максимуму у вечірні години.
Клініко-діагностичне значення. Збільшення кількості лейкоцитів у крові називається лейкоцитозом, зменшення – лейкопенією.
Лейкоцитоз виникає у здорових людей залежно від деяких фізіологічних умов, наприклад:
після прийому їжі, особливо багатої на білок (“травний” лейкоцитоз – до 12 000 лекоцитів в 1 мкл крові, але через 3–4 год їх кількість повертається до норми);
у процесі посиленої м’язової роботи (“біогенний” лейкоцитоз – іноді кількість лейкоцитів досягає 20 000 в 1 мкл крові);
після гарячих і холодних ванн у період реактивного розширення судин шкіри;
під час вагітності;
у момент сильних емоцій.
В усіх цих випадках лейкоцитоз є розподільний, тобто виникає в результаті судинних реакцій з викидом лейкоцитів із кров’яних депо.
Лейкоцитоз може розвиватися внаслідок введення деяких фармакологічних препаратів, особливо гормонального походження, що пояснюється мієлотропною дією деяких гормонів (адреналін, адренокортикотропний гормон, кортикостероїди), що виявляється у прискореному дозріванні клітин кісткового мозку і виходом у кров зрілих лейкоцитів.
Лейкоцитоз характерний для таких патологічних станів:
хронічних і гострих лейкозів (до 600 000 в 1 мкл);
гострих інфекційних запальних і гнійних процесів (до 40 000 в 1 мкл);
інфаркт міокарда (до 20 000 в 1 мкл);
сильні опіки (до 30 000 в 1 мкл);
злоякісні пухлини (до 30 000 в 1 мкл);
шокові, післяопераційні стани;
значні крововтрати (“постгеморагічний” лейкоцитоз – 12 000–15 000).
Виникнення лейкопенії спостерігається у здорових людей при голодуванні, зниженні загального тонусу, під час глибокого сну.
Лейкопенія з’являється за таких умов:
коли в організмі наявні бактеріальні інфекції (черевний тиф, бруцельоз), вірусні хвороби (грип, кір, краснуха, печінкова жовтяниця). У цих випадках кількість лейкоцитів падає до 3 000 в 1 мкл крові. Це залежить від пригнічувальної дії деяких токсинів на лейкопоез. Поява лейкопенії під час інфекційних захворювань, для яких характерний лейкоцитоз, свідчить про зниження імунної опірності організму;
при системному червоному вовчаку (кількість лейкоцитів в активній фазі хвороби коливається від 4 000 до 2 000 в 1 мкл) і деяких інших імунних станах (лейкопенія пов’язана з утворенням антитіл до власних лейкоцитів);
при різних типах агранулоцитозів: медикаментозних (після прийому пірамідону, сульфаніламідів, синтоміцину тощо); токсичних (у разі дії бензолу, іонізуючої радіації);
у разі гіпопластичних й апластачних станів кровотворення – вроджених і набутих (променева хвороба, бензольна інтоксикація, ускладнення після цитостатичної терапії), які характеризуються жировим переродженням кісткового мозку з частковою (гіпоплазія) або тотальною (аплазія) редукцією кровотворення;
при деяких гемобластозах – алейкемічні варіанти гострого лейкозу (зменшення продукції клітин крові за рахунок пригнічення нормальних ростків кровотворення пухлинно-проліферативними процесами).
Останні три групи лейкопеній бувають найбільш вираженими, і кількість лейкоцитів знижується до 1 000–800 і менше в 1 мкл крові.