- •Розділ 2. Дослідження системи крові
- •2.1. Загальний аналіз крові
- •2.1.1. Гематологічні дослідження
- •2.1.2. Загальний клінічний аналіз крові
- •2.2. Система еритрону
- •2.2.1. Дослідження морфології та функції еритроцитів
- •2.2.2. Морфологічна ідентифікація та кількісний аналіз ретикулоцитів периферичної крові
- •2.2.3. Гетерогенна система гемоглобіну
- •2.2.3.1. Визначення концентрації гемоглобіну
- •Метод к. Зінгера
- •2.2.4. Серологічні дослідження крові
- •2.2.4.3. Визначення групи крові та резус-фактора людини за допомогою тест-реагентів «Цоліклон»
- •2.2.5. Диференціальна діагностика анемій та гемоглобінопатій
- •2.3. Лейкоцити – гетерогенна група клітин периферичної крові
- •2.3.1. Виділення та дослідження функціонального стану лейкоцитів
- •2.3.2. Дослідження апоптозу лейкоцитів периферичної крові
- •2.4. Дослідження системи гемостазу
- •2.4.1. Дослідження ролі тромбоцитів у процесі гемостазу
- •2.5. Дослідження клітин кісткового мозку
- •2.5.1. Виділення та дослідження морфології клітин кісткового мозку
- •2.5.2. Цитохімічні дослідження клітин кісткового мозку
- •2.6. Визначення імунологічних показників крові
- •Розділ 2. Дослідження системи крові Організація роботи на практикумі “Дослідження системи крові”
- •2.1. Загальний аналіз крові
- •3. Гомеостатична функція.
- •2.1.1. Гематологічні дослідження
- •2.1.1.1. Техніка проколу шкіри пальця та взяття крові для клініко-біохімічних аналізів
- •2.1.1.2. Визначення гематокритної величини
- •Уніфікований мікрометод визначення гематокриту (загального об’єму еритроцитів, модифікація і. Тодорова)
- •2.1.1.3. Визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом
- •Визначення концентрації глюкози в сироватці крові
- •2.1.1.4. Глюкозотолерантний тест
- •2.1.1.5. Визначення загального вмісту білків сироватки крові
- •Алгоритм побудови калібрувального графіка для визначення загального білка сироватки крові
- •Алгоритм побудови калібрувального графіка для визначення загального білка сироватки крові
- •2.1.1.6. Електрофорез білків сироватки крові на папері
- •2.1.1.7. Електрофорез білків сироватки крові в агаровому гелі
- •2.1.2. Загальний клінічний аналіз крові
- •Лейкоцитарний росток. Лейкоцити периферичної крові поділяються на гранулоцити (нейтрофіли, еозинофіли, базофіли) і агранулоцити (лімфоцити, моноцити) (рис. 2.13).
- •2.1.2.1. Визначення швидкості осідання еритроцитів (шое)
- •2.1.2.2. Визначення концентрації гемоглобіну
- •Хід роботи
- •Різні розмірності вираження концентрації гемоглобіну
- •2.1.2.3. Визначення кількості еритроцитів в 1 л крові
- •2.1.2.4. Розрахунок середнього вмісту гемоглобіну в еритроциті
- •2.1.2.5. Розрахунок кольорового показника крові
- •2.1.2.6. Визначення кількості лейкоцитів в 1 л крові
- •2.1.2.7. Визначення кількості тромбоцитів в 1 л крові
- •2.1.2.8. Техніка виготовлення мазків крові
- •2.1.2.9. Підрахунок лейкоцитарної формули периферичної крові
- •2.2. Система еритрону
- •2.2.1. Дослідження морфології та функції еритроцитів
- •2.2.1.1. Підрахунок кількості еритроцитів меланжерним методом
- •2.2.1.2. Визначення глікогену еритроцитів цитохімічним методом
- •2.2.1.3. Визначення осмотичної резистентності еритроцитів
- •2.2.1.4. Визначення резистентності еритроцитів до кислотного гемолітика
- •Кінетика гемолізу еритроцитів
- •2.2.1.5. Виявлення базофільної зернистості еритроцитів
- •2.2.1.6. Безапаратне фракціонування еритроцитів крові у градієнті густини сахарози
- •2.2.2. Морфологічна ідентифікація та кількісний аналіз ретикулоцитів периферичної крові
- •2.2.2.1. Визначення кількості ретикулоцитів
- •1. Фарбування ретикулоцитів блискучим крезиловим синім безпосередньо на предметному склі.
- •2. Фарбування ретикулоцитів у пробірках.
- •2.2.2.2. Визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів
- •2.2.3. Гетерогенна система гемоглобіну
- •2.2.3.1. Визначення концентрації гемоглобіну
- •Хід роботи
- •Хід роботи
- •2.2.3.2. Визначення гемоглобіну у фіксованих препаратах
- •2.2.3.3. Забарвлення тотальних препаратів на гемоглобін солянокислим бензидином
- •2.2.3.4. Визначення вмісту лужностійкого гемоглобіну
- •Метод к. Зінгера
- •2.2.3.5. Кількісне визначення термолабільного гемоглобіну
- •2.2.3.6. Визначення вмісту глікозильованого гемоглобіну
- •2.2.3.7. Визначення фетального гемоглобіну на мазках крові
- •2.2.4. Серологічні дослідження крові
- •2.2.4.3. Визначення групи крові та резус-фактора людини за допомогою тест-реагентів «Цоліклон»
2.1.1.7. Електрофорез білків сироватки крові в агаровому гелі
Подібно до крохмального й акриламідного, агаровий гель є дуже м’яким носієм. На відміну від електрофорезу на папері, в агаровому гелі не відбувається інактивації білків, що дає змогу визначати активність окремих білкових фракцій безпосередньо в гелі після завершення електрофорезу. Приготування агарового гелю є набагато простішим, ніж приготування крохмального чи поліакриламідного гелів. Тривалість електрофорезу в агаровому гелі – 1–4 год.
Електрофорез сироватки крові проводять в 1 % агарі в мединал-вероналовому буфері (рН 8,6) з іонною силою 0,05. Усі білки сироватки при рН 8,6 заряджені негативно і переміщаються в електричному полі в напрямі до анода. Однак практично всі білкові фракції сироватки, які рухаються повільно, переміщаються до катода. Аномальний напрям руху цих білків пояснюють наявністю в агаровому гелі електроендоосмотичного струму рідини, спрямованого від анода до катода, а також струму рідини, який виникає під час нерівномірного випаровування води з поверхні гелю. Випаровування призводить до нерівномірного розподілу електричного поля в гелі. Зменшити випаровування води можна трьома способами:
1) герметично закривати електрофоретичну камеру під час електрофорезу;
2) проводити електрофорез за низьких температур у холодильнику або в холодній кімнаті;
3) буферний розчин повинен бути попередньо охолоджений.
Реактиви
1. Веронал-мединаловий буфер (рН 8,6; іонна сила 0,1): у 500 мл дистильованої води розчиняють 17,52 г мединалу, додають 2,76 г вероналу і, переміщуючи, нагрівають у теплій водяній бані до розчинення вероналу. Тоді об’єм розчину доводять дистильованою водою до 1 л.
2. Агар – 1 % розчин. Агар повинен бути чистим і прозорим. Готують 2 % розчин на дистильованій воді. Гарячий розчин розливають у ванночки товщиною 1,0–1,5 см. Після застигання агарову пластинку розрізають на кубики, переносять їх у товстостінний стакан і промивають протягом двох діб під проточною водопровідною водою, тоді протягом доби – дистильованою водою, змінюючи її чотири–п’ять разів. Агар підсушують фільтрувальним папером, переносять у колбу, розігрівають, гарячий розчин розводять у два рази буферним розчином і тричі фільтрують через три шари марлі. Розчин агару зберігають у холодильнику. Перед нанесенням на пластинку його нагрівають на киплячій водяній бані доти, поки в агарі не зникнуть пухирці повітря.
3. Амідовий чорний 10Б – 0,1 % розчин у 2 % оцтовій кислоті.
4. СН3СООН – 5 % розчин.
Приготування агарових пластинок і проведення електрофорезу. Для приготування агарових пластинок використовують предметні скельця. Попередньо їх знежирюють, ретельно промивають водою і висушують. Скельця нумерують, викладають на строго горизонтальну поверхню і на кожне скельце обережно наливають піпеткою із широким носиком 4 мл агару. Пухирці повітря в агарі необхідно вивести піпеткою на край скла. Коли агар застигне і утвориться твердий гель, у ньому посередині вирізають лунку (кишеньку) для внесення досліджуваного розчину. Підготовлені скельця складають в електрофоретичну камеру. Агарове плато з’єднують з буферним розчином містками з фільтрувального паперу. В кожну лунку на пластинці вносять сироватку крові, попередньо розведену буферним розчином. На електрофореграму наносять приблизно по 100–300 мкг білка в об’ємі 0,01 мл. Прилад підключають до джерела струму. Повільно підвищуючи напругу, доводять силу струму до 20–25 мА (за напруги 200–300 В), електрофорез проводять протягом 3–4 год.
Обробка агарових пластинок. Після завершення електрофорезу струм вимикають, предметні скельця з агаровим гелем відразу виймають з камери і поміщають на 30 хв у 5 % розчин СН3СООН. Кожну пластинку покривають смужкою фільтрувального паперу, змоченого в 5 % розчині СН3СООН, для видалення води та солей, а згодом висушують за кімнатної температури протягом ночі. Для пришвидшення процесу висушування його проводять при 37 °С або під потоком теплого повітря. Папір, який може приклеїтися до агарового шару, обережно знімають, попередньо розмочивши його водою. Перед зафарбовуванням агарове поле повинне бути абсолютно сухим і прозорим. Зафарбовування зразків на електрофореграмах проводять амідовим чорним 10Б протягом ночі. Фарбу, яка не зв’язалася з білками, відмивають 5 % розчином СН3СООН. Відмиті електрофореграми висушують при 37 °С.