2.1.1.5. Визначення загального вмісту білків сироватки крові

Визначення загального білка сироватки крові за біуретовою реакцію

Принцип методу. Білки реагують у лужному середовищі з іонами Купруму(ІІ), утворюючи сполуки, забарвлені у фіолетовий колір.

Обладнання. Фотоелектроколориметр КФК-3, штатив з пробірками, піпетки, кювети, міліметровий папір.

Реактиви

1. Натрій хлорид – 0,9 % розчин.

2. Натрій гідроксид – 0,2 н розчин без карбон(IV) оксиду (20 мл 1 н розчину NaOH доводять до 100 мл перевареною дистильованою водою).

3. Біуретовий реактив: 4,5 г сегнетової солі (KNaC₄H₄O₆) розчиняють у 40 мл 0,2 н NaOH. Після розчинення додають 1,5 г CuSO₄×5H₂O та 0,5 г KI. Розчин доводять до 100 мл 0,2 н NaOH. Зберігають у темному місці (або у посудині з темного скла). Реактив можна використовувати протягом місяця.

4. Калій йодистий – 0,5 % розчин у 0,2 н розчині натрій гідроксиду (0,5 г KI розчиняють у 100 мл 0,2 н NaOH). Зберігають у посудині з темного скла не більше двох тижнів.

5. Робочий розчин біуретового реактиву: 20 мл біуретового рективу (№ 3) змішують з 80 мл розчину № 4. Зберігають у посудині з темного скла не більше двох тижнів.

6. Стандартний розчин альбуміну (з сироватки людини або бика) – 0,1 г/мл приготовлений на 0,9 % розчині NaСl: 1 г альбуміну розчиняють (у невеликому циліндрі чи точній мірній пробірці) у 6–7 мл в 0,9 % розчині NaСl і доводять кінцевий об’єм фізіологічним розчином до 10 мл; 1 мл стандартного розчину містить 0,1 г білка.

Хід роботи

До 5 мл робочого розчину біуретового реактиву додають (обережно, щоб не утворювалась піна) 0,1 мл сироватки крові. Через 30 хв, щонайпізніше через 1 год, пробу колориметрують на фотоелектроколориметрі у кюветі товщиною 1 см при λ = 546 нм проти контролю, який готують шляхом додавання 0,1 мл 0,9 % розчину NaСl до 5 мл робочого розчину біуретового реактиву. Концентрацію загального білка сироватки крові обчислюють за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіка. Зі стандартного розчину альбуміну (0,1 г/мл) готують робочі розчини з різною концентрацією білка (див. таблицю). З кожного розведення беруть по 0,1 мл робочого розчину і вносять у пробірки, які містять по 5 мл робочого розчину біуретового реактиву. Через 30–60 хв екстинкцію стандартних проб вимірюють на ФЕКу проти контролю (“сліпої проби”) (див. хід роботи, п. 1).

Алгоритм побудови калібрувального графіка для визначення загального білка сироватки крові

Номер пробірки	Стандартний розчин білка, мл	0,9 % NaCl, мл	Вміст білка в пробі, г	Концентрація, % (маса/об’єм)
1	0,4	0,6	0,04	4
2	0,6	0,4	0,06	6
3	0,8	0,2	0,08	8
4	1,0	–	0,10	10

Серію стандартних розчинів обробляють у такий самий спосіб, як і дослідні проби. Вимірювання оптичної густини стандартних розчинів починають з менших концентрацій. Значення оптичної густини (що відповідають різним концентраціям) наносять на міліметровий папір. На осі абсцис з дотриманням однакових інтервалів рівномірно відкладають значення концентрації стандартних розчинів білка; на осі ординат – відповідні їм значення оптичної густини. Масштаб вибирають так, щоб крива була під кутом 45 °. Наносять середнє значення екстинкції з декількох визначень і через отримані точки, а подекуди і між ними проводять пряму лінію (рис. 2.8).

Рис. 2.8. Калібрувальна крива для визначення концентрації білка біуретовим методом

Нормальні значення концентрації загального білка маса/об’єм, або г/100 мл: у сироватці крові дорослих становлять 6,5–8,5, у дітей до шести років – 5,6–7,8, у немовлят – 5,3–6,8; у сечі – 25–70 мг/добу; у лікворі – 15–45 мг/100 мл.

Примітка. Калібрувальна крива за біуретовим методом відображає лінійну залежність до Е = 0,5 (близько 10 г/100 мл), що збігається з даними інших авторів.

Якщо концентрація білка у сироватці перевищує 10 г/100 мл, її розводять фізіологічним розчином (зазвичай дворазово), в реакцію беруть 0,1 мл суміші, а отриманий результат множать на коефіцієнт розведення, який дорівнює двом. Усі реактиви, які використовують у методиці, готують на дистильованій воді.

Визначення концентрації білка за методом Лоурі

Принцип методу. В основі визначення концентрації білка цим методом є здатність Купрум похідних білка відновлювати реактив Фоліна з утворенням забарвлених продуктів реакції. Метод широко застосовують не тільки для визначення концентрації білка у біологічних рідинах, а й для серійних аналізів фракцій на вміст білка після розділення складних сумішей хроматографічними методами. Важливо пам’ятати, що позитивну реакцію Фоліна дають відновники – аскорбінова кислота, глутатіон і навіть глюкоза.

Обладнання. Фотоелектроколориметр або спектрофотометр, штатив з пробірками, піпетки.

Реактиви

1. Реактив А: 20 г Na₂CO₃ розчиняють в 1 л 0,1 н розчину NaOH.

2. Реактив В: 10 г двозаміщеного натрій або калій виннокислого (Na₂C₄H₄O₆ або K₂C₄H₄O₆) розчиняють у 300 мл дистильованої води. У виготовлений розчин додають 5 г мідного купоросу (CuSO₄×5H₂O) і після його розчинення об’єм доводять до 1 л дистильованою водою.

3. Реактив Фоліна: 100 г натрій вольфрамату (Na₂WO₄) та 25 г натрій молібдату (Na₂MoO₄×2H₂O) розчиняють у 700 мл дистильованої води. До суміші додають 50 мл 85 % розчину W₃PO₄ та 100 мл концентрованої хлоридної кислоти. Суміш кип’ятять протягом 10 год у колбі з оберненим холодильником. Після закінчення кип’ятіння у колбу додають 150 г Li₂SO₄, 50 мл дистильованої води та п’ять крапель брому (Br₂). Суміш кип’ятять під витяжною шафою протягом 15 хв. Після охолодження об’єм суміші доводять до 1 л, фільтрують і зберігають у темній банці з притертим корком. Для визначення концентрації кислоти у виготовленому реактиві відбирають 2 мл і титрують 0,1 н розчином NaOH за фенолфталеїном.

4. Реактив С. Готують перед аналізом, змішуючи 50 частин реактиву А та одну частину реактиву В.

5. Реактив Е. Готують з реактиву Фоліна, який розводять так, щоб одержати 1 н розчин кислоти. Наприклад, якщо під час титрування реактиву Фоліна виявилось, що він містить 2,3 г-екв. кислоти, то для приготування реактиву Е необхідно взяти 10 мл реактиву Фоліна та 13 мл дистильованої води. Реактив Е можна зберігати впродовж тривалого часу.

Хід роботи

До 1 мл розчину додають 5 мл реактиву С. Суміш перемішують і через 10 хв додають 0,5 мл розчину Е. Через 30 хв фотометрують при λ = 750 нм. Кількість білка у розчині визначають за калібрувальною кривою.

Побудова калібрувальної кривої. Для її побудови готують розчин білка з відповідною концентрацією (наприклад, 10 мл 0,05 г/100 мл розчину альбуміну). З основного розчину готують кілька розведень з концентрацією білка від 0,05 до 0,3 мг/мл і доводять об’єм проб до 1 мл.