4. Определение некоторых индивидуальных белков сыворотки крови

1. Определение гаптоглобина

Принцип метода: сывороточный гаптоглобин образует с раствором гемоглобина комплекс, осаждаемый риванолом. По уровню оставшегося в растворе гемоглобина фотометрически определяют содержание гаптоглобина в сыворотке крови.

Реактивы:

1. Риванол. К 100 мг риванола добавить 15 мл дистиллированной воды, встряхнуть до полного растворения.

2. Гемоглобин. К 100 мг гемоглобина добавить 10 мл дистиллированной воды, встряхнуть и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин для удаления агрегатов.

3. раствор сульфата аммония 10 %.

Ход определения: Для проведения исследования необходимо поставить 3 пробы: опытную, контрольную и стандартную.

В опытную пробу вносят 0,3 мл дистиллированной воды, 0,5 мл негемолизированной сыворотки, 0,2 мл раствора гемоглобина и перемешивают.

В контрольную пробу вносят 0,5 мл дистиллированной воды, 0,5 мл сыворотки крови и перемешивают. Обе пробы инкубируют 10 минут при комнатной температуре, после чего добавляют по 3 мл раствора риванола.

В стандартную пробу вносят 2,8 мл дистиллированной воды и 0,2 мл гемоглобина, перемешивают. Через 5 минут все три пробы центрифугируют при 3000 об/ мин в течение 6-7 минут. К надосадочной жидкости добавляют 0,2 мл 10 %-ного раствора сульфата аммония и инкубируют 60 минут при комнатной температуре.

Далее измеряют оптическую плотность опытной, контрольной и стандартной проб по отношению к дистиллированной воде в кюветах с толщиной слоя жидкости 5 мл на ФЭК (зеленый светофильтр, № 6)

Оценка результата; расчет ведут по формуле:

Х = ((Ес - (Ео - Ек) х2) / Ес, ЭТО надо исправить

где Х - концентрация гаптоглобина г/л; Ес, Ео, Ек – оптическая плотность стандартной, опытной, контрольной проб.

Содержание гаптоглобина в сыворотке крови составляет 0,4-1,8 г/ л .

2. 2.4.2. Определение содержания церулоплазмина

Принцип реакции: реакция основана на том, что церулоплазмин ( ЦП ) окисляет диамины. Окисленный диамин, соединяясь с диметилпарафенилендиамином, дает розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна ферментативной активности ЦП.

Реактивы: 1. 0,5 % раствор солянокислого парафенилендиамина (ПФД ) в ацетатном буфере рН 5,2. 2. Ацетатный буфер рН 5,2 : 20 мл ледяной уксусной кислоты и 163 г ацетата натрия (CH 3COONa: 3Н 2О ) разводят в 1 л дистиллированной воды. 3. 0,25% раствор роданистого калия.

Ход определения. Опыт: к 1мл раствора ПФД прибавляют 0, 1 мл сыворотки, инкубируют 30 минут при 37 градусов, затем и нгибируют добавлением 5 мл роданистого калия и помещают пробирки в лед. Определяют оптическую плотность на ФЭК при длине 525 против контрольного опыта.

Для построения калибровочной кривой надо взять чистый препарат ЦП, сделать разведения от 0,05 до 1, 0 мг% и провести работу как в опыте.

2.4.3. Определение гемоглобина

Гемоглобин – основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к хромпротеидам и обеспечивающий ткани кислородом. Гемоглобин состоит из белка – глобина и гема – соединения протопорфирина 1Х с железом. Железо придает гемоглобину характерную окраску. Присоединение к гему различных химических групп сопровождается изменением окраски, на этом основано определение концентрации гемоглобина в крови.

Исследование содержания гемоглобина в крови включает определение гемоглобина и его дериватов, которые присутствуют в крови здоровых людей или появляются при различных патологических состояниях. У здоровых людей в крови гемоглобин находится в виде оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и в небольшом количестве – метгемоглобина, карбоксигемоглобина и вердоглобина.

Гемиглобинцианидный метод определения гемоглобина

Принцип. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин железосинеродистым калием. Образующийся с ацетонциангидрином окрашенный цианметгемоглобин определяют колометрически.

Реактивы. 1. Трансформирующий раствор: ацетонциангидрин – 0, 5 мг; калий железосинеродистый – 0, 2 г; натрия гидрокарбонат – 1 г; дистиллированная вода – до 1 л. Раствор желтого цвета, прозрачный. При обесцвечивании или появлении осадка непригоден. 2. Калибровочный раствор гемиглобинцианида.

Ход определения. В пробирку к 5 мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови ( разведение в 251 раз), тщательно перемешивают и оставляют стоять на 10 минут. Измеряют на ФЭКе при длине волны 500- 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы. Измеряют при тех же условиях стандартный раствор.

Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида, или по формуле:

Еоп

Нb (г%) = ------ . С. К . 0,001,

Ест

Где Е оп – экстинкция опытной пробы, Ест –экстинкция стандартного раствора, С – концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%, К- коэффициент разведения крови, 0,001 – коэффициент для перерасчета мг/100 мл в г/ 100 мл.

N пробирки		Станд.раствор,мл		Трансформирующий раствор, мл	Содержание гемоглобина, г%
1	-			6	Холостая проба
2			2	4	5
3			4	2	10
4			6	-	15