5.1. Унифицированный метод определения общего холестерина (метод Илька)

Принцип метода: Присутствующий в плазме или сыворотке крови холестерин и его эфиры дают цветное окрашивание при обработке смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной кислот.

Реактивы:

1. Ледяная уксусная кислота.

2. Концентрированная серная кислота.

3. Уксусный ангидрид.

4. Абсолютный спирт.

5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты.

6. Калибровочный раствор: 232 мг холестерина растворяют в 2-3 мл хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным спиртом. Раствор содержит холестерин в концентрации 6 ммоль/л.

Ход определения: К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл плазмы или сыворотки без гемолиза, перемешивают , ставят на 20 мин в термостат или водяную баню при 37°С, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см при длине волны 625 нм.

Построение калибровочной кривой. К 0,05-0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое же количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдерживают 20 мин при 37°С, так же как опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/л пробы, вкоторую взято 0,1 мл – содержанию 6 ммоль/л и т.д.

5.2. Унифицированный метод определения общего холестерина по реакции с хлорным железом (метод Златкис-Зака)

Принцип метода: Содержащийся в плазме или сыворотке крови свободный и эфирносвязанный холестерин окисляется хлорным железом в присутствии уксусной, серной и фосфорной кислот с образованием ненасыщенных продуктов, окрашенных в красно-фиолетовый цвет. Фосфорная кислота повышает стойкость реактива, содержащего хлорное железо.

Реактивы:

1. Ледяная уксусная кислота.

2. Серная кислота концентрированная.

3. Железо хлорное FeCI₃ х 6Н₂О.

4. Ортофосфорная кислота; содержит 85%-ный Н₃РО₄.

5. Раствор хлорного железа: 2,5 г хлорного железа растворяют в 80 мл ортофосфорной кислоты. Нагревая до полного растворения, затем охлаждают и доводят объем до 100 мл ортофосфорной кислотой.

6. Цветной реактив: к 8 мл раствора хлорного железа добавляют серную кислоту так, чтобы суммарный объем был 100 мл.

7. Калибровочный раствор холестерина в уксусной кислоте: 116 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор содержит холестерин в концентрации 3 ммоль/л.

Ход определения: К 1,3 мл уксусной кислоты осторожно добавляют 0,05 мл плазмы или сыворотки крови без гемолиза, перемешивают, а затем добавляют 1 мл цветного реактива, хорошо перемешивают встряхиванием и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего фотометрируют при длине волны 530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта, в который берут 1,3 мл уксусной кислоты, 0,05 мл исследуемой сыворотки или плазмы и 1 мл концентрированной серной кислоты.

Для приготовления калибровочного графика вместо исследуемого материала берут 0,05-0,2 мл калибровочного раствора, к которому добавляют уксусную кислоту до суммарного объема 1,35 мл, а затем добавляют 1 мл цветного реактива. Проба, в которую взяли 0,05 мл калибровочного реактива по окраске соответствует опытной пробе с содержанием холестерина в исследуемом материале 3 ммоль/л; проба, в которую взяли 0,1 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина 6 ммоль/л и т.д. Расчет проводят по калибровочному графику.