3.1.6. Определение активности липазы

Панкреатическая липаза относится к группе эстераз, гидролизует в эфирные связи с освобождением жирных кислот.

Фермент секретируется поджелудочной железой. В сыворотке крови активность низкая. Липаза может существовать в двух изоформах. Кроме панкреатической липазы в сыворотке крови содержится липопротеиновая липаза. Липаза является термолабильным ферментом и при 37 °С частично инактивируется.

В сыворотке здоровых людей активность липазы низкая, при остром панкреатите активность может увеличиться до 200 раз по сравнению с нормой.

Методы определения активности липазы отличаются по используемому субстрату и основаны на определении количества освободившихся под действием фермента жирных кислот. В качестве субстратов часто применяют: оливковое масло, трибутирин, 2-нафтилмеристат, твин-80, триолеин и др.

Оптимум рН для липазы 8,8-9,0. Липаза поджелудочной железы водорастворима, ее липолитическое действие проявляется на поверхности жировых гранул. Липазу активируют желчные кислоты, ионы кальция. Желчные кислоты приводят к уменьшению поверхностного натяжения, это ведет к образованию эмульсий и увеличению контакта между жирами и липазой.

Свободные жирные кислоты, образовавшиеся в результате ферментативной реакции, ингибируют липазу. Связывание жирных кислот ионами кальция с образованием нерастворимых соединений является причиной активации липазы в присутствии ионов кальция.

Принцип метода: При определении липазы с использованием оливкого масла в качестве субстрата, активность фермента пропорциональна количеству гидролизованного оливкого масла или количеству жирных кислот, образующихся при гидролизе.

Реактивы:

1. Оливковое масло.

2. Окись алюминия.

3. Меди сульфат 5-водный (СиSО₄) для получения абсолютного спирта.

4. Этиловый спирт.

5. Основной раствор оливкового масла. В колбу наливают 100 мл абсолютного спирта, добавляют 1,1 мл масла и встряхивают долго (1 час) для приготовления эмульсии.

6. Рабочая эмульсия оливкового масла : 1,5 мл основного раствора оливкового масла медленно добавляют к 100 мл буфера рН 8,8.

7. Трис (оксиметил)аминометан.

8. Дезоксихолевой кислоты натриевая соль.

9. НСI концентрированная.

10. Буфер, содержащий трис 0,025 моль/л и натриевую соль дезоксихолевой кислоты, 0,014 моль/л, рН 8,8: 0,3 г триса и 0,6 г дезоксихолата натрия растворяют в 40 –60 мл воды, доводят рН до 8,8 концентрированной НСI (3-8 капель) и доливают водой в мерной колбе до 100 мл.

Ход определения: В кювету приливают 3 мл рабочей эмульсии оливкового масла, добавляют 0,1 мл сыворотки, смешивают и ставят в термостат при 30 или 37 °С. Через 2 мин измеряют экстинкцию (Е1) против воды или воздуха при длине волны 340 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, затем кювету снова помещают в термостат при той же температуре и через 5 мин измеряют экстинкцию (Е2), рассчитывают разницу за одну минуту (Е).

Для расчета активности липазы можно использовать контрольную сыворотку с известной активностью липазы. Активность липазы в контрольной сыворотке определяют так же, как в исследуемой.

Нормальные величины 0-470 нмоль /с.л или 0-28 мкмоль/мин.л.