Тема 7. Продолжение. Экспериментальный анализ раннего развития.

Как уже было сказано ранее, были выделены два вида индукторов – нейрализующий и мезодермализующий. В основном эти работы были выполнены в лабораториях Тидемана (Германия) и Тойвонена (Финляндия). Оба эти индуктора были выделены из чужеродных тканей, и встал вопрос, может быть и нормальные индукторы состоят из двух частей : N-индуктор – в передней части хорды, а М-индуктор – в задней её части. Шпеман ранее показал, что при пересадке дорзальной губы со стадии ранней гаструлы (1) и поздней (2) получаются разные результаты: в (1) случае индуцируются головные структуры, а во (2)- туловищные.

Тойвонен поставил следующий опыт : взял бластулу амфибий и в полость посадил два чужеродных индуктора – М и N. Получился зародыш со всеми структурами. Тойвонен объяснил это тем, что из подсаженных кусочков диффундировал индуктор и это влияние постепенно ослабевает с расстоянием. Области, близкие к N-индуктору, дают головные структуры, а к М-индуктору – туловищные. Это была гипотеза двух градиентов.

Опыт Ньюкупа.

Голландский ученый Ньюкуп, выяснял, как определенные участки зародыша становятся мезодермой. Известно, что в норме мезодермой становится зона зародыша, расположенная анимальнее энтодермы

В бластуле тритона он вырезал среднюю зону – область серого серпа и «насадил» верхушку бластулы на дно. У таких «укороченных» зародышей из прилежащих к энтодерме участков крыши возникала мезодерма - на границе среза возник серый серп. Это показывает, что свойством регуляции обладает и сам первичный индуктор.

Кроме того этот опыт показал что первая по времени развития индукция протекает на стадиях средней- поздней бластулы. Эти опыты были поставлены позже опытов Шпемана, за результатами которого сохранилось историческое название – первичная эмбриональная индукция. Опыты Ньюкупа были поставлены в 50е годы и их результаты получили название «ньюкуповской индукции». Известно, что в ходе нормального развития у зародышей тритона мезодермой становится зона, расположенная непосредственно анимальнее энтодермы (зона 3). Приобретает ли она эти свои свойства автономно или же под влиянием энтодермы (зона 4)? Чтобы проверить это предположение, Ньюкуп удалял зону 3 и сращивал с энтодермой более анимальную зону 2, из которой в норме образуется только эктодерма. Однако, из таких «укороченных» зародышей из прилежащих к энтодерме участков возникла мезодерма. Путём поворотов энтодермы относительно крыши бластулы было показано, что индукционное действие энтодермы обладает дорзовентральной специфичностью: Дорзальная энтодерма индуцирует дорзальную (осевую) мазодерму, а вентральная энтодерма – вентральную мезодерму (боковую пластинку и её производные).

Эмбриональные индукции в раннем развитии амфибий как каскад активации генов.

Уже вскоре после опытов Шпемана и Мангольд было обнаружено, что индукционные эффекты порождаются не только «живыми», но и «убитыми» тканями индуктора. Это привело к мысли о химическом механизме его действия.Было проведено испытание множества веществ и оно показало, что эффекты, сходные в той или иной степени с естественными индукторами, производятся веществами самого различного состава и происхождения, например, вытяжки костного мозга и печени взрослых животных, вещества растительного происхождения, жирные кислоты, хлористый литий. Всё это показывало на удивительную пластичность эмбриональных тканей и на их способность реагировать на самые различные воздействия. Однако смысл этих реакций и понимание процессов, которые протекают в раннем развитии оставались непонятными. Методы экспериментальной эмбриологии выявили процессы, протекающие при гаструляции и нейруляции, но полностью объяснить их не могли.

Такое понимание пришло из молекулярной биологии и генетики. Активное исследование молекулярных механизмов раннего развития началось в 80х годах 20го века. Оказалось, что процессы эмбриональной индукции связаны с активацией или подавлением определенных генов, ответственных за синтез определенных белков. В развитии формируются целые каскады генов, активирующих или репрессирующих друг друга. Процессы эмбриональной индукции представляют собой такой каскад, последовательными этапами которого являются «ньюкуповская» и «шпемановская» индукции. Материальные основы для этих последовательных индукционных процессов закладываются ещё в оогенезе и в этот каскад входит «поворот оплодотворения», который , как мы уже разбирали , заключается в повороте кортикального слоя яйцеклетки, после вхождения в неё сперматозоида, с вегетативного полюса на будущую дорзальную поверхность,. При таком наползании светлой «вегетативной» цитоплазмы на пигментированную «анимальную» и становится видным сектор цитоплазмы, окрашенный в серый цвет –серый серп. При этом с помощью микротрубочек, отходящих от отцовской центриоли, в эту область перемещаются везикулы с различными веществами, главным из которых является белок dishevelled.

В процессе роста ооцита амфибий поблизости от его вегетативного полюса синтезируется большое количество белков, которые будут участвовать в последующих индукционных процессах. (Их мРНК были синтезированы на хромосомах типа ламповых щеток). К таким белкам относятся - гликопротеины семейства Wnt 1 и многочисленные белки (30) надсемейства TGF-бета ( факторы роста опухолей –tumor growth factors. Во взрослых организмах они стимулируют рост раковых опухолей). К этому надсемейству относятся белки Vg1, которые вызывают индукцию на стадии бластулы –«ньюкуповскую» индукцию мезодермы. В той же области яйцеклетки синтезируется и фосфопротеин dishevelled.

Другой важный участник индукционного каскада – белок бета-катенин, который исходно распределен в цитоплазме зиготы более или менее равномерно. Вскоре после оплодотворения он подвергается ферментативному расщеплению. Однако на дорзальной стороне зародыша активность расщепляющего фермента подавлена активностью белка dishevelled. Поэтому на дорзальной стороне бета-катенин сохраняется и по мере делений дробления перемещается в клеточные ядра бластомеров. Он принимает участие в ньюкуповской индукции. Он связывается с определенными участками генома (промоторами), активируя другие гены. Так, он активирует ген nodal, который у всех зародышей позвоночных «работает» только в мезодерме левой стороны тела и значит, определяет лево-правую асимметрию.

Бета-катенин активирует ген siamosis, который в свою очередь активирует ген ещё одного ядерного белка –goosecoid. Этот белок содержится в ядрах клеток первичной губы бластопора – индуктора «шпемановской» индукции. Как и бета-катенин, goosecoid является регуляторным белком и активирует работу других генов, которые в свою очередь кодируют белки, секретируемые в клетках «шпемановского» индуктора. Эти белки – chordin и noggin - секретируются в межклеточное пространство. Эти белки и являются непосредственными факторами «шпемановской» индукции.

Теперь необходимо сказать о белках семейства BMP (bone morphogenetic proteins). Это морфогенетические белки, получаемые из костного мозга, они также входят в надсемейство TGF-бета. Их концентрация наивысшая на вентральной стороне зародыша. Они секретируются в межклеточное пространство и, связываясь с мембранными рецепторами эмбриональных клеток, «запрещают» им дифференцироваться в нервную ткань и другие производные осевых зачатков, «разрешая» развитие только в сторону покровной эктодермы. Чтобы нейральная дифференцировка всё же состоялась, ВМР должны быть удалены из межклеточного пространства, либо связаны в такой комплекс, который не может взаимодействовать с мембранными рецепторами клеток-мишеней.

Первое возможно при искусственном разрушении межклеточных контактов или при длительной культивации небольших кусочков эмбриональной ткани вне зародыша. Действительно, если культивировать небольшие участки покровной эктодермы, то в них возникают участки нервной ткани – без всякого влияния индукторов, т.е, происходила «самонейрализация». Это выглядело как нарушение индукционных воздействий, которые по результатам опытов Шпемана необходимы для формирования нервной пластинки под воздействием материала хорды. Только после получения молекулярно-генетических данных о процессах, которые происходят при гаструляции, стало ясно, в чём заключается роль «первичного организатора» - дорзальной губы бластопора. Оказалось, что функция белков chordin и noggin, которые концентрируются в этой области, выделяясь в межклеточное пространство, как раз и состоит в том, чтобы связывать молекулы ВМР в межклеточном пространстве, препятствуя их связыванию с мембранными рецепторами клеток. Это открытие привело к существенному пересмотру традиционных представлений о шпемановской индукции. Если раньше считали, что в поверхностную эктодерму клетки развиваются без индукционных влияний, то теперь стало ясно, что таким явлением является дифференцировка нейральных закладок. Это “индукция по умолчанию” (default induction), поскольку данная дифференцировка нуждается лишь в блокировании ВМР, и именно такое блокирование осуществляется шпемановскими индукторами.

Подразделение нервной системы на отделы также осуществляется путем «индукции по умолчанию». Оказалось, что если не препятствовать связыванию белков группы Wnt с клетками презумптивной нейральной эктодермы, то вся нервная пластинка развивается в спинной мозг. Для формирования головного мозга необходимо связать факторы Wnt в межклеточном пространстве. Это осуществляется головными индукторами – белками Cerberus и Dickkopf, секретируемыми прехордальной пластинкой. Если такое связывание произошло, то в области будущего головного мозга активируется ген ОТХ-2. Однако у всех позвоночных, кроме ланцетника, на последующих стадиях развития (ранняя-средняя нейрула) активность этого гена в большей части закладки головного мозга также блокируется, позволяя там активироваться гену “переднего конца” – anf. Только тогда происходит полноценное развитие мозга.

Явление «индукции по умолчанию» представляет большой теоретический интерес.

Каскад активации генов в раннем развитии амфибий

1.Оогенез

Синтез белков, концентрирующих около вегетативного полюса:

1.Гликопротеины Wnt-1. (

2. белки надсемейства TGF-бета (tumor growth factors –факторы роста опухолей. Эти белки закодированы в оогенезе молекулами мРНК, синтезированными на хромосомах типа ламповых щеток. мРНК хранятся в информосомах). К ним относятся:

а) Vg1- вызывают ньюкуповскую индукцию мезодермы.

б) BMP(bone morphogenetic proteins)

в) фосфопротеин dishevelled, который перемещается на будущую дорзальную сторону зародыша в ходе поворота оплодотворения,

г) бета-катенин (исходно распределен в цитоплазме зиготы равномерно)

Wnt (читается - виэнти) – основной класс секретируемых морфогенетических лиганд, особую важность они имеют при установлении общего паттерна развития у всех многоклеточных животных, Wnt – путь включает большое количество белков, которые могут регулировать образование Wnt- сигнальных молекул, их взаимодействие с рецепторами клеток мишеней и физиологический ответ этих клеток на действие экстраклеточных Wnt- лиганд. Канонический Wnt – путь - когда Wnt-белки связываются с рецепторами клеточной поверхности (рецепторы сем. Frizzled). Это заставляет рецепторы активировать белки сем Dishevelled а это изменяет количество бета-катенина, которое достигает ядра. Белки Dishevelled являются ключевым компонентом Wnt-рецепторного комплекса, связанного с мембраной. В результате целого ряда взаимодействий бета-катенин проникает в ядро и взаимодействует с TGF/LEF семейством транскрипционных факторов, которые активируют специфическую активность генов.)

Wnt белки (Wnt - от Drosophyla locus wingless и orthologous vertebrate retrovirus integration site Int-1) играют важную роль в процессах развития и физиологии – пролиферации, дифференцировке, апоптозе, выживании, адгезии, миграции и полярности (Wodazz A., Nusse R. 1998. Mechanisms of Wnt signaling in development. Annual Rev. Cell Dev.Biol. V.14: 59-88). Wnt белки действуют как лиганды для Wnt рецепторов. Wnt лиганды и рецепторы экспрессируются различно в пространственно-временном порядке, входя в динамичные и сложные процессы развития. Наиболее изучен бета- катенин-зависимый путь ( так называемый канонический Wnt сигнальный путь). Неканонический независимый от бетакатенина Wnt-Са²⁺ путь – опосредует клеточную миграцию и полярность в эмбриогенезе (Kikuchi A., Yamamoto H. 2008, Tumor formation due to abnormalities in the beta-catenin-independent pathway of WNT-signaling. Cancer Sci. V. 99: 202-208, Veeman R.T. et al. 2003. Dev.Biol. V.5: 367-377, Kohn A.D., Moon D.T., 2005, Cell Calcium V. 38: 439-446).

2. Оплодотворение.

бета-катенин после оплодотворения подвергается ферментативному расщеплению везде, кроме дорзальной стороны, где он защищен белком dishevelled, который подавляет активность расщепляющего фермента.

3. Дробление.

Ньюкуповская индукция на стадии ранней бластулы.

бета-катенин во взаимодействии с Vg1 и другими факторами участвует в ньюкуповской индукции, вызывая активацию других генов: ген nodal, который активен в мезодерме левой стороны и определяет лево-правостороннюю асимметрию. бета-катенин постепенно перемещается в ядра клеток бластомеров, которые составляют зачаток хорды.