§ 2. Измерение токов одиночного канала

Пэтч-кламп метод

Для измерения ионных токов через оди­ночные каналы первоначально был предло­жен непрямой метод анализа мембранного шума²-³*. Затем был разработан способ пря­мой регистрации одиночных ионных каналов с помощью метода, который называется пэтч-кламп (patch-clamp⁴- ⁵>). В совокупности эти подходы дали прямые ответы на вопросы, ка­сающиеся функции ионных каналов, как то:

какой заряд проходит через одиночный ка­нал? как долго канал остается открытым? как время нахождения ионного канала в открытом или закрытом состоянии зависит от мембран­ного потенциала?

Пэтч-кламп метод, предложенный Э. Не­ером, Б. Сакманном и их коллегами, значи­тельно углубил наши знания о функциониро­вании ионных каналов. Для пэтч-кламп реги­страции необходимо, чтобы кончик стеклян­ной пипетки с внутренним диаметром около 1 мкм плотно контактировал с мембраной исследуемой клетки. При удачном подведе­нии, благодаря легкому присасыванию, меж­ду клеточной мембраной и стеклом пипетки (рис. 2.3А—В) создается сопротивление боль­ше 10⁹ Ом (отсюда возник термин «гигаомный контакт», gigaohm seal). Когда пипетка соеди­нена с соответствующим усилителем, можно зарегистрировать небольшие токи, проходя­щие через участок мембраны, находящейся внутри кончика пипетки (рис. 2.3F). Такая конфигурация пэтч-кламп метода называет­ся cell attached (контакт с клеткой). Высо-коомный контакт гарантирует, что ионные токи, проводимые этим участком клеточной мембраны, проходят преимущественно через

Глава 2. Ионные каналы и нейрональная сигнализация

39

(А)

■Electrode tip

Cell

(Cigaohra seal) CELL ATTACHED

\)-|/f^D)'

Рис. 2.3. Регистрация ионных токов мето­дом пэтч-кламп. Электрод образует плотный контакт с мембраной (А), который благодаря легкому понижению давления превращает­ся в гигаомный контакт (В). Оттягивание мембраны с последующим отрывом ее фраг­мента приводит к конфигурации inside-out (С). Другой вариант основан на последова­тельном образовании конфигурации whole celt и затем — outside-out (E).

Fig. 2.3. Patch Clamp Recording. (A-E) Patch configurations, represented schematically. The electrode forms a seal on contact with the cell membrane (A), which is converted to a gi-gaohm seal by gentle suction (B) Records may then be made from the patch of mem­brane within the electrode tip (cell-attached patch). Pulling away from the cell results in the formation of a cell-free vesicle, whose outer membrane can then be ruptured to form an inside-out patch (C). Alternatively, the membrane within the electrode tip may be ruptured by further suction to obtain a whole-cell recording (D) or, by pulling, to obtain an outside-out patch (E). (F) Recording arrange­ment. The patch electrode is connected to an amplifier that converts channel currents to voltage signals. The signals are then displayed on an oscilloscope trace or computer screen so that amplitudes and durations of single-channel currents can be measured. (A-E after Hamill et aL, 1981.)

Pull (low Ca²⁺)

(C) INSIDE-OUT PATCH

|/(D) WHOLE-CELL f \ RECORDING

Pull

(E) OUTSIDE-OUT PATCH

Oscilloscope

усилительную аппаратуру, а не теряются в ме­сте контакта пэтч-пипетки с клеткой. При использовании пэтч-кламп метода регистри­руемые события состоят из прямоугольных токовых сигналов, отражающих процессы от­крытия и закрытия одиночных ионных кана­лов. Таким образом, мы в реальном времени можем наблюдать активность одиночных бел­ковых молекул мембраны.

В простом случае токи одиночных каналов появляются нерегулярно и с различной про­должительностью, но с постоянной амплиту­дой (рис. 2.4А). В некоторых случаях, одна­ко, картина токов может быть более слож­ной. Некоторые ионные каналы, например, в открытом состоянии могут иметь более чем

один уровень проводимости, как это показа­но на рис. 2.4В. Кроме того, ионные кана­лы могут проявлять комплексную кинетику. Например, ток через одиночный ионный ка­нал может выглядеть не как простой прямо­угольник, а как «вспышка» открытий канала (рис.2.4С).

Таким образом, пэтч-кламп метод пре­доставляет новые уникальные возможности для изучения поведения ионных каналов. Во-первых, изоляция маленького участка мем­браны позволяет наблюдать активность все­го нескольких ионных каналов, а не тысяч, которые активируются в целой клетке. Во-вторых, высокое сопротивление контакта да­ет возможность регистрировать даже крайне

40

Раздел П. Передача информации в нервной системе

(А)

[Closed (С) Open - <Р) 20 рА

40

120

160

200

(В)

4рА

(С) (О,)

100

100

100 0

100

2рА

200 400 600 800 1000 1200 1400

Time (ms)

Рис. 2.4. Примеры одиночных ионных каналов, зарегистрированных методом пэтч кламп

Fig. 2.4. Examples of Patch Clamp Recordings. (A) Glutamate-activated channel currents recorded in a cell-attached patch from locust muscle occur irregularly, with a single amplitude and varied open times. Downward deflections indicate current flowing into the cell. (B) Acetylcholine-activated currents from single channels in an outside-out patch from cultured embryonic rat muscle reach a maximum amplitude of about 3 pA and relax to a substate current of about 1,5 pA. Downward deflections indicate inward current. (C) Pulses of outward current through glycine activated chloride channels in an outside-out patch from cultured chick spinal cord cells are interrupted by fast closing and reopening transitions to produce bursts. (A after Cull-Candy, Miledi, and Parker, 1980; В after Hamill and Sakmann, 1981; С from A. I. McNiven and A. R. Martin, unpublished.)

малые токи. В результате мы имеем возмож­ность точного измерения амплитуд токов оди­ночных ионных каналов и можем провести анализ кинетики каналов.

Конфигурации пэтч-кламп метода

Пэтч-кламп метод позволяет осуществлять также регистрацию ионных каналов и в других конфигурациях. Достигнув контакта в кон­фигурации cell attached, можно, отводя элек­трод, оттянуть участок мембраны для форми­рования inside-out (внутренняя сторона нару­жу) конфигурации (рис. 2.3С). В последнем случае цитоплазматическая сторона мембра­ны будет обращена к перфузионному раство­ру. С другой стороны, с помощью неболь­шого дополнительного присасывания можно прорвать участок мембраны, расположенный внутри регистрирующего электрода, обеспе-

чив контакт последнего с цитоплазмой клет­ки (рис. 2.3D). В этих условиях будут реги­стрироваться токи в конфигурации whole-cell (целая клетка). Наконец, после полу­чения конфигурации «целая клетка», мож­но оттянуть электрод от клетки, сформиро­вав из мембраны сначала тонкую перемыч­ку, а затем, после отделения этого участ­ка, получить конфигурацию outside-out (на­ружная сторона наружу; рис. 2.3Е). Каждая из этих конфигураций имеет свои преиму­щества, их использование зависит от типа изучаемого ионного канала и той инфор­мации, которую мы хотим получить в дан­ном эксперименте. Например, для апплика­ции веществ на внешнюю сторону мембра­ны предпочтительной является конфигурация outside-out.

Пэтч-кламп конфигурация «целая клет­ка» предполагает обмен между цитоплазмой