4.4.3. Афк участвуют в реакции сверхчувствительности и защищают растение при внедрении патогена.

Однако АФК являются не только опасным и неизбежным следствием аэробного образа жизни. Кроме негативных, эти молекулы выполняют и другие функции. Одна из таких функций – защитная. И здесь существует удивительная аналогия между растениями и животными. Давно известно, что фагоциты животных поглощают О₂ с большой скоростью, что сопровождается интенсивным образованием О₂^.- и Н₂О₂. Эти соединения как раз и являются тем оружием, которым фагоциты убивают чужеродные клетки.

Дыхательный «взрыв» у растений, связанный с чрезмерной генерацией АФК был впервые зарегистрирован в ответ на внедрение патогена в реакции «сверхчувствительности»*.

*Реакция сверхчувствительности связана с образованием некрозов и гибелью клеток растения в месте внедрения патогена. Таким способом, ценой гибели собственных клеток, растению удается избавиться от инфекции.

В клетках растений сверхгенерация супероксидрадикала, также как и у фагоцитов, происходит в результате реакции:

Н АДФН + 2О₂ НАДФ + 2 О₂^.- + Н⁺

Как и в фагоцитах, данная реакция катализируется НАДФН-оксидазой, расположенной в плазмалемме растительных клеток.

4.4.4. Супероксидрадикал и перекись в низких концентрациях действуют как сигнальные молекулы.

Как выяснилось, в клетках животных и растений, О₂^.- и Н₂О₂ в низких концентрациях могут действовать как сигнальные молекулы, влияющие на экспрессию генов. На клетках животных показано, что они стимулируют накопление в клетке цАМФ и цГМФ , вход в клетку ионов Са²⁺, вызывают активацию протеинкиназ и т.д.. Регуляторная роль этих молекул в жизни растений стала понятной при исследовании ответных реакций на действие стрессовых факторов. Давно было замечено, что некоторые стрессы сопровождаются у растений повышением клеточного уровня О₂^.- и Н₂О₂ . Оказалось, что в этом случае роль этих опасных молекул двойственная. С одной стороны они провоцируют окислительные реакции, способный привести клетку к гибели, с другой – выступают как участники сигнальных каскадов, результатом которых является экспрессия генов, контролирующих синтез компонентов защитных систем. В 4.3.3.11. мы говорили о том, что альтернативная оксидаза препятствует развитию окислительного стресса и часто ее активность увеличивается в неблагоприятных для растения условиях. В эксперименте синтез АО de novo можно стимулировать, подвергая растение действию таких стимулов, как низкая температура, атака патогена, обработка салициловой кислотой и антимицином А. Во всех случаях наблюдается четкая корреляция между экспрессией гена АОХ1 и накоплением перекиси. Так, в культурах клеток табака подавление цитохромного дыхания антимицином А сопровождалось интенсивным образованием О₂^.- и накоплением перекиси. В этих условиях уже через 60 минут резко возрастало содержание мРНК АОХ1, а через несколько часов увеличивалось содержание и активность АО. Отсюда следует важный вывод - сигнал для синтеза АО de novo возникает в митохондриях и передается в ядро (рис.4.29.). Как было показано в культурах клеток табака и петунии, транскрипцию гена АОХ1 и синтез АО можно вызвать просто обрабатывая клетки экзогенной перекисью водорода. Аналогичного эффекта можно также добиться обрабаткой салициловой кислотой. Известно, что салициловая кислота связывает и блокирует каталазу, что, естественно, приводит к повышению внутриклеточного содержания перекиси. На основании этих данных исследователи вполне справедливо пришли к выводу, что Н₂О₂ действует как сигнальная молекула, вторичный мессенджер в цепи сигнальной трансдукции, результатом которой является экспрессия ген АОХ 1 и синтез АО.

Перекись является также звеном в цепи передачи сигнала, включающего экспрессию генов, кодирующих синтез ферментов аскорбат-глутатионового цикла. Например, добавлением перекиси можно инициировать синтез аскорбатпероксидазы в культурах клеток риса. Известно, что салициловая кислота, которая синтезируется в растении, обладает гормональной активностью и участвует в индукции ответных реакций растения на внедрение патогена. Оказалось, что в этом случае эффект объясняется тем, что салициловая кислота блокирует активность каталазы. Именно накопление перекиси влияет на транскрипцию генов, контролирующих синтез pathogenesis-related –белков. Таким образом, при внедрении патогена появление в клетке Н₂О₂ является сигналов для экпрессии генов, включенных в системную устойчивость.

Однако наиболее интригующей является роль АФК в апоптозе, т.е. генетически программируемой клеточной смерти. Апоптоз в клетках животных связан с деградацией белков, конденсацией хроматина и сопровождается характерными цитологическими изменениями. Специфические протеазы (caspases) и эндонуклеаза, которые в норме присутствовали в цитозоле в неактивной форме, вовлекаются в апоптоз и участвуют в разрушении белков и фрагментации ДНК. Известно, что активация протеазы связана с их протеолитическим расщеплением. Долгое время считалось, что митохондрии не вовлекаются в апоптоз, так как не подвергаются видимым изменениям. Однако оказалось, что именно митохондрии – главные участники активной программы клеточной смерти. Внутреннее пространство митохондрий содержит особые белки, которые при выходе в цитозоль как раз и вызывают активацию протеаз и эндонуклеаз, тем самым инициируя апоптоз.. Прежде всего, это так называемый AIF-фактор (apoposis-induced factor), находящихся в матриксе, и цитохром с, локализованный в межмембранном пространстве. Однако что же заставляет эти соединения выходить из митохондрий и как они это делают? Еще до наступления видимых изменений, характерных для апоптоза, в митохондриях фиксируется повышенный уровень О₂^.-. Супероксидрадикал, действуя прямо или косвенно, инициирует формированием специальных mtPTP –пор, (permeability transition pore). mtPTP –поры представляют собой комплекс белков, формирующий в месте контакта внутренней и наружной мембран широкий канал, или пору, через которую в цитозоль выходят AIF-фактор и цитохром с (рис.4.30). Интересно, что в образовании mtРТ-пор принимают участие белки, которые в норме выполняли в митохондриях другие функции. Хотя точный состав mtРТ-пор неизвестен, есть основания думать, что в их состав входят:

- АТФ\АДФ транслокатор. В нормально функционирующих митохондриях этот транспортный белок интегрально встроен во внутреннюю мембрану и осуществляет обмен АТФ и АДФ;

- VDAC – потенциал-зависимый анионный канал внешней мембраны;

- циклофилин D (cyclophilin D) – белок, в норме присутствующий в матриксе митохондрий;

- неизвестные белки из цитозоля;

На формирование и открытие mtРТ-пор оказывают влияние многие факторы, такие как величина  на мембране, концентрация Са²⁺, уровень АТФ и АДФ в матриксе и цитозоле. Кроме того, косвенным образом состояние mtРТ-пор зависит от эффективности антиоксидантных систем, нейтрализующих О₂^.-. Открытие mtРТ-пор приводит к цепи необратимых событий, заканчивающихся гибелью клетки. Выход из митоходрий в цитозоль AIF– фактора и цитохрома с сопровождается активацией специфической протеазы и запуском каскада протеолитических реакций, результатом которых является разрушение белков и деградация ДНК. (рис.4.31.). Помимо этого, нарушение замкнутости внутренней мембраны приводит к коллапсу  и энергетическому кризису, что также ускоряет гибель клетки.

У растений программируемая клеточная смерть (ПКС) является неотъемлимой частью нормального роста и развития. Старение листьев и цветков, отмирание клеток при формировании сосудов ксилемы и корневого чехлика, гибель клеток в реакции «сверхчувствительности» – примеры, когда смерть клеток является генетически детерминированной. Хотя апоптоз растений сопровождается несколько иной, чем у животных, цитологической картиной, можно предполагать, что сценарий этого процесса у тех и других включает общие элементы. Показано, что смерть клеток, формирующих сосуды ксилемы у Zinnia, а также клеток табака в реакции сверхчувствительности сопровождалась активацией специфических протеаз и эндонуклеаз, а также фрагментацией ДНК. Сигнал, индуцирующий ПКС у растений неизвестен. Однако, им вполне вероятно являются О₂^.- и Н₂О₂, накопление которых предшествует гибели клеток, например при старении листьев и цветков. При этом АФК, видимо, не только разрушают клеточные структуры как окислители. Есть данные, что при старении листьев Н₂О₂ вызывает экспрессию генов, включенных в процесс разрушения хлорофилла. Однако вопрос о роли митохондрий в ПКС у растений остается пока неизученным. Существуют лишь единичные и косвенные данные, подтверждающие, что апоптоз у растений также связан с событиями, происходящими в митохондриях. Например, на клетках кукурузы было показано, что их гибель сопровождается выходом из митохондрий в цитозоль цитохрома с. На примере клеток животных известно, что Са²⁺ на фоне низкого содержания АТФ способствует открытию mtPT-пор и развитию апоптоза. Аналогично этому, на клетках кукурузы было показано, что вход в клетку кальция при низком уровне АТФ может спровоцировать их смерть по типу апоптоза.