6.3.2. Азот (Харитонашвили е.В.).

6.3.2.1. Формы азота, используемые растением.

В среде обитания растений N представлен в виде газообразного азота атмосферы (78%) и в виде органических и неорганических соединений в почве, реках, мировом океане (Рис.6.1). Растениям недоступен напрямую огромный запас азота в воздухе (N₂), а также органический азот почвы, на долю которого приходится 99% общего азота почвы. Они поглощают N из почвы в виде минеральных ионов нитрата и аммония.

Азот почвы происходит из атмосферы в результате процессов азотфиксации: химической и биологической. Биологическая азотфиксация – уникальная способность некоторых прокариот восстанавливать N₂ до NH₄⁺ при обычных температуре и давлении: это цианобактерии, актиномицеты, зеленые серные бактерии, бактерии родов Azotobacter и Clostridium и др. Органический азот почвы может быть превращен в NH₄⁺ в процессе аммонификации – разложения органического вещества гетеротрофными бактериями. Пополнение пула нитратного азота почвы обеспечивают бактерии нитрификаторы, которые используют энергию окисления аммония до нитрата для жизнедеятельности. Процессы денитрификации, осуществляемые анаэробными микроорганизмами, приводят к потерям почвенного минерального азота и его переходу в атмосферный N₂ (Рис.6.1).

Биологическая азотфиксация вносит наиболее значительный вклад в круговорот азота в биосфере. Азотфиксирующие организмы можно разделить на две группы: свободноживущие и симбиотические формы. Существует три основных типа азотфиксирующих симбиозов микроорганизмов с растениями: ризобий с большой группой бобовых растений (Fabaceae), цианобактерий с голосеменными и актиномицетов с небобовыми покрытосеменными растениями. Бобовые – самая большая группа растений, образующих «товарищество» с бактериями-азотфиксаторами рода Rhizobium. В симбиотические отношения вступают арахис, маш, соя, чечевица, горох, фасоль, люцерна, клевер, люпин, бобы и другие. Растение-хозяин снабжает бактерии углеводными компонентами и получает зафиксированный атмосферный N₂ в виде аминокислот, амидов или уреидов.

6.3.2.2. Поглощение и усвоение нитрата.

Нитрат считают основным источником минерального азота для растений, хотя для его усвоения необходимо высокое содержание углеводов и запасов энергии. На хорошо аэрируемых не очень кислых почвах большая часть минерального азота представлена именно нитратом, который находится в водной фазе. Анион легко перемещается c током воды в почве. Особенно быстро происходит его вымывание из поверхностного слоя, в котором расположены корни растений. В силу высокой подвижности концентрация NO₃^- в почвенном растворе изменяется в широких пределах: от 5 мкмолей до 2 мМ и выше и во многом зависит от климатических факторов.

Усвоение нитрата - сложно организованная система последовательных биохимических и физиологических процессов, включающая поступление аниона в корень, его восстановление и накопление в корнях, радиальный транспорт, загрузку NО₃ в сосуды ксилемы и транслокацию в надземные органы, восстановление и накопление нитрата в листьях (Рис. 6.37). У некоторых растений доля нитрата, транспортируемого в побег, достигает 80-90%. Из листьев же в корни NО₃^- не перемещается. Азот нитрата, восстановленный в корнях, в виде аминокислот, амидов или уреидов поступает в побеги. На уровне целого растения происходит довольно интенсивный круговорот аминокислот и амидов между надземными органами и корнями. Содержание N в ксилеме достигает 0,01 – 0,21 % (вес/объем), во флоэме оно в 10 – 20 раз ниже.

Усвоение нитрата генетически детерминировано, что выражается в видовой и сортовой специфике поглощения NO₃^- , распределения по органам, восстановления и накопления. Накопление нитрата в тканях, достигающее при определенных условиях высоких значений, – одна из особенностей азотного обмена растений. С одной стороны, в условиях возникшего азотного дефицита накопленный ранее NO₃^- служит эндогенным источником N для новых азотпотребляющих синтезов. С другой стороны, нитрат, местом накопления которого служит вакуоль, выполняет осморегуляторную функцию.

Поглощение нитрата. Механизмы транспорта через плазмалемму. Движущей силой транспорта через плазмалемму является протонный градиент. Это вторичный активный транспорт в симпорте с протоном.

Кинетически в растительной клетке идентифицированы две системы транспорта NO₃^-: высокого сродства HATS (high-affinity transport system), или механизм I, и низкого сродства LATS (low-affinity transport system), или механизм II.

Работа HATS описывается кинетической кривой Михаэлиса-Ментен: скорость поглощения нитрата достигает насыщения при концентрациях 0,2 – 0,5 мМ NO₃^-, K_m обычно колеблется в диапазоне от 10 до 100 М. Система транспорта высокого сродства может быть конститутивной, которая индуцируется в отсутствие нитрата, и индуцибельной, индуцируемой нитратом.

Поглощение нитрата через LATS наблюдается при концентрациях NO₃^- выше 0,5 мМ и не достигает насыщения. Считается, что система транспорта нитрата низкого сродства является конститутивной. Однако, последние работы с мутантными формами Arabidopsis выявили индуцируемую нитратом форму LATS.

Идентифицированы два семейства мембранных белков, которые могут осуществлять активный транспорт нитрата через плазмалемму в симпорте с протоном: нитрат-нитритные портеры (NNP - the nitrate-nitrite porters) и петидные транспортеры (PTR - the peptide transporter). Оба семейства представлены у прокариот и эукариот и относятся к главному суперсемейству транспортных белков MFS. К нему же относятся и фосфатные транспортеры, о которых шла речь выше (см. раздел 3.1.3)

Методами молекулярной биологии были идентифицировали два семейства генов: NRT1 (nitrate reductase transporter) - кодируют переносчики с двойственными свойствами (с высокими и низкими K_m) или переносчики низкого сродства и NRT2 - кодируют индуцируемые переносчики NO₃^- высокого сродства.

При изучении и описании поглощения нитрата растениями обязательно следует принимать во внимание, что это результат двух разнонаправленных потоков: входа (influx) и выхода (efflux). Транспортная система выхода нитрата индуцируется самим нитратом и стимулируется аммонием. Однако, в отличие от индуцируемых систем транспорта входа, система выхода, будучи индуцированной один раз, остается стабильной в присутствии ингибиторов РНК и синтеза белка в период до тех пор, пока нитрат и нитрит имеются в наличие в цитозоле. Возможно, это белок с большим периодом полуобновления, который работает как селективный канал. Транспортная система оттока кинетически описывается кривой насыщения с К_м=5 мМ, что близко к значениям концентрации нитрата в цитозоле.

Транспорт нитрата через мембраны может быть важным звеном в регуляции усвоения нитрата в растении. На уровне плазмалеммы контролируется поглощение нитрата из среды, на уровне тонопласта - накопление и ремобилизация запасенного ранее NO₃^-, на уровне транспорта через мембрану ЭР - симпластный транспорт на средние расстояния и, наконец, выход нитрата из клеток стелярной паренхимы определяет загрузку ксилемы – наименее изученный транспортный поток нитрата.

Накопление и компартментация нитрата в растительных тканях. Накопленный в растительных тканях нитрат ассиметрично распределен между двумя основными клеточными компартментами: цитозолем и вакуолью (Рис. 6.38). По мере накопления сперва заполняется доступный для восстановления метаболический пул (МП) в цитозоле, затем формируется запасной или вакуолярный пул (ЗП). Различия по содержанию нитрата (мкмоли NO₃^-/г сырой массы) у растений, выращенных при разной его доступности, связаны в первую очередь с размерами ЗП. Однако, на уровне клетки нитрат еще и перемещается по симпласту. Поэтому более достоверно компартментацию нитрата отражает трехкомпартментая модель, которая учитывает, наряду с метаболическим и запасным, подвижный пул (ПП) нитрата (Рис. 6.38).

В осстановление нитрата. Характеристика нитратредуктазы. Восстановление нитрата в растениях (а также в водорослях, грибах и микроорганизмах) осуществляется в две стадии: первая - двухэлектронное восстановление нитрата до нитрита, катализируемое нитратредуктазой (НР) и вторая – шестиэлектронное восстановление нитрита до аммония, катализируемое нитритредуктазой (НиР). Далее аммоний включается в состав аминокислот в реакциях первичного аминирования и амидирования.

Первая реакция самая медленная и лимитирует весь процесс в целом. Нитрит и аммоний токсичны для растения и в норме не накапливаются. Их концентрации в листьях составляют ~ 15 нмолей и ~ 10 мкмолей на г сырой массы соответственно.

По структуре НР (ЕС 1.6.6.1) – металлофлавопротеин, образующий гомодимеры с молекулярной массой 100 кДа, и гомотетрамеры. Каждая субъединица состоит примерно из 1000 аминокислот и включает три кофактора: ФАД, гем-Fe (цитохром b₅) и молибдоптерин, которые обеспечивают передачу электронов от НАД(Ф)Н на NO₃^- (Рис. 6.39). Их окислительно-восстановительные потенциалы (Е’^o) соответственно равны –272, -160 и –10 мВ. Фермент имеет центры связавания с НАД(Ф)Н и нитратом. Большинство форм НР у растений используют в качестве восстановителя НАДН, но некоторые (соя, кукуруза, ячмень, рис) являются биспецифичными и связываются либо с НАДН, либо НАДФН. Электроны от восстановителя передаются на ФАД, затем через геминовое железо на молибден и далее на нитрат (Рис. 6.39).

НР локализована в цитозоле. У большинства видов она обнаружена как в корнях, так и в листьях. Хотя, например, у клюквы, белого клевера, цикория НР локализована только в корнях, а у Cocklebur – исключительно в листьях. На схеме (Рис. 6.40) представлены данные по распределению ассимиляции нитрата между корнями и листьями у разных видов растений.

В корнях при низких экзогенных концентрациях нитрата НР обнаруживается в эпидермальных и кортикальных клетках ближе к поверхности корня. При высоких концентрациях NO₃^- в среде НР есть во всех клетках коры и стели. В листьях С₄ растений НР локализована в клетках мезофилла, но не в клетках обкладки, так как хлоропласты мезофилла в большей степени продуцируют восстановитель при нециклическом фотосинтетическом транспорте электронов.

Регуляция активности НР. Регуляция активности НР может осуществляться на стадии транскрипции, трансляции и на пост-трансляционном уровне.

Транскрипционный уровень. НР – фермент, индуцируемый субстратом, со временем полуобновления t_1/2 ~ 4-5 ч. Индукция нитратом зависит от конститутивного «нитрат-сенсорного» белка неизвестной природы, который предположительно связывается с регуляторной областью гена НР. Регуляторная последовательность или «нитратный бокс» в промоторе НР идентифицирована. В ответ на поступление нитрата уровень мРНК (НР) быстро увеличивается в течение минут и достигает стационарного состояния в течение нескольких часов. Чувствительность индукционной системы регуляции: 50 мкмолей NO₃^- в течение 10 минут. Кроме нитрата, изменения в уровне мРНК (НР) наблюдаются в ответ на другие сигналы: свет, углеводы (сахароза), глутамин. Действие света опосредовано через фитохром. Наиболее четко индукция НР светом проявляется у этиолированных проростков. В темноте накопление сахаров коррелирует с повышением уровня мРНК (НР). Увеличению концентрации ГлуNH₂ соответствует снижение количества транскриптов НР. У растений в стационарном состоянии с индуцированной НР количество мРНК демонстрирует суточную периодичность с максимумом в предрассветные часы. Возможно, в промоторной областе гена НР есть места связывания с разными регуляторными белками, воспринимающими свет, концентрацию ГлуNH₂, водный и углеродный статус, скорость фотосинтеза и другие лимитирующие условия, которые модулируют восстановление нитрата на транскрипционном уровне.

Этап трансляции генетической информации также может быть местом регуляции ассимиляции нитрата, но этот вопрос изучен недостаточно.

Пост-трансляционный уровень. Потенциальная активность НР зависит от: 1) количества функционально активного белка НР, 2) уровня активности белка НР и 3) доступности субстратов в цитозоле.

Доступность отдельных структурных компонентов не лимитирует количество функционально активного белка НР. Однако у растений в условиях оптимального роста и достаточного снабжения нитратом потенциальная возможность его восстановления (количество функционально активного белка, активность НР in vitro) больше, чем реальная активность НР (in vivo).

В основе механизма управления активностью фермента лежит процесс быстрой и обратимой инактивации НР, который происходит в два этапа (Рис. 6.41). Первый – фосфорилирование активной НР Са²⁺-зависимой протеинкиназой по серину «первой петли». Второй – связывание 14-3-3 белка с фосфорилированной НР и переход НР в неактивное состояние. На втором этапе необходимо наличие ионов Mg²⁺ или Са²⁺. Сродство фермента к субстратам в неактивном состоянии не меняется, но блокируется поток электронов от гема на молибдоптериновый домен фермента.

Регуляция на уровне транскрипции и обратимая инактивация фермента совместно позволяют растениям точно настраивать интенсивность ассимиляции нитрата в соответствии с конкретным состоянием. Например, транскрипция НР в фотосинтезирующих тканях подчиняется циркадному ритму. Гены НР наиболее интенсивно транскрибируются в предрассветные часы, но синтезируемый белок НР в это время обратимо ингибируется темнотой и низкой доступностью СО₂.

Метаболитная регуляция на пост-трансляционном уровне определяется содержанием свободного ГлуNH₂ и отношением ГлуNH₂ /Глу. Когда уровень ГлуNH₂ низкий и нитрат доступен, скорость восстановления нитрата возрастает, в то время как высокий уровень ГлуNH₂ тормозит его восстановление. Предполагается, что регуляторная область связывания ГлуNH₂ расположена на N-конце фермента. У трансгенных растений с конститутивно экспрессированной м-РНК (НР) и белком, у которого посттрансляционный контроль потерян в результате делеции N-конца, регуляторная роль ГлуNH₂ утрачивается и восстановление контролируется только доступностью НАДН.

Нитритредуктаза. Нитрит, образующийся при восстановлении нитрата, транспортируется в хлоропласты или пластиды в нефотосинтезирующих тканях, где восстанавливается до аммония. Нитритредуктаза (НиР) (EC 1.7.7.1), катализирующая эту реакцию, использует в качестве донора 6е^- восстановленный ферредоксин.

NO₂^- + 6 Фд_восст. + 8 H⁺ NH₄⁺ + 6 Фд_ок. + 2 H₂O

В хлоропластах восстановление нитрита через ферредоксин обеспечивается за счет нециклического потока электронов в ЭТЦ фотосинтеза, в нефотосинтетических тканях - за счет НАДФН из окислительного пентозофосфатного пути при участии ферредоксин-НАДФ⁺ редуктазы.

НАДФН + 2 Фд_ок. (Fe³⁺)  НАДФ⁺ + 2 Фд_восст.(Fe²⁺) + H⁺

НиР – мономер с молекулярной массой 60 – 70 кДа, состоит из двух доменов и кофакторов, которые передают электроны от ферредоксина на нитрит. Ферредоксин связывается с N-терминальной последовательностью белковой молекулы. На второй половине белка на С-конце локализовано место связывания с нитритом. Это два железо-серных центра [4Fe – 4S] и сирогем (Рис. 6.42).

Активность НиР на порядок выше активности НР, поэтому нитрит в обычных условиях не накапливается и скорость ассимиляции нитрата лимитирует первая реакция. НиР, также как и НР, индуцируется нитратом (а не нитритом) и светом.