4.3.9. Растительные митохондрии содержат четыре над(ф)н-дегидрогеназы - над(ф)н-убихинон-оксидоредутазы. Они окисляют надн и надфн по обе стороны внутренней мембраны и восстанавливают убихинон.

Дыхательная цепь растений содержит четыре дополнительные НАД(Ф)Н - дегидрогеназы, способные окислять НАДН и НАДФН, восстанавливая пул убихинона. Альтернативные дегидрогеназы кодируются ядерными генами и представлены одним небольшим полипептидом ( М.В = 26-43 кДа), содержащим ФАД в качестве кофермента. Общим свойством этих ферментов является то, что их активность не подавляется ротеноном, «классическим» ингибитором комплекса I. В то же время специфические ингибиторы для них четко не установлены. Между собой дегидрогеназы различаются по кинетике, степени чувствительности к ингибитору дифенилениодиду и по потребности в ионах Са²⁺.

Ротеноннечувствительные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы расположены по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны (рис.4.14). На обращенной к матриксу стороне есть две дегидрогеназы (НАДН-ДГ _in и НАДФН-ДГ_in ), одна из которых специфична к НАДН, а другая к НАДФН. Они способны окислять эндогенный НАДН и НАДФН и в какой-то мере конкурируют с комплексом I, объективно снижая величину Н⁺ . В то же время НАДН-ДГ_in обладает значительно меньшим сродством к НАДН, чем комплекс I, и, вероятно, включается в работу только при достаточно высоком уровне НАДН в матриксе. Две другие, НАДН-ДГex и НАДФН-ДГex_, расположены на внешней стороне внутренней мембраны. Их присутствие объясняет тот факт, что митохондрии растений, в отличие от митохондрий животных, способны окислять цитозольный НАД(Ф)Н, проникающий в межмембранное пространство через поры в наружной мембране. Присутствие внешних НАД(Ф)Н-дегидрогеназ в дыхательной цепи растений делает излишним использование некоторых челночных механизмов, работающих на доставку НАДН в митохондрии животных. В то же время следует учесть, что три альтернативные дегидрогеназы являются Са²⁺-зависимыми, а это значит, что они, вероятно, активируются только при увеличении цитозольной концентрации Са²⁺, которая в норме очень низка.

Физиологическая роль альтернативных НАД(Ф)Н-дегидрогеназ в ДЦ растений остается не совсем ясной. Очевидно, что она связана с контролем пулов НАДН и НАДФН в цитозоле и матриксе митохондрий. Следует отметить, что наличие нескольких ферментов, выполняющих одну и ту же функцию, является в данном случае еще одним подтверждением пластичности растительного метаболизма.

4.3.10. Митохондрии растений содержат альтернативную оксидазу –убихинол-кислород оксидоредуктазу. Альтернативная оксидаза окисляет qh2 и восстанавливает о2 до воды.

Изучение особенностей дыхания растений, связанных с альтернативной оксидазой (АО), имеет давнюю и интересную историю. Еще в Х1Х веке ботаники описали явление, которое впоследствии назвали термогенезом ароидных растений. При цветении некоторых видов температура цветка резко повышается, иногда превышая температуру окружающего воздуха на десятки градусов. Этот феномен ярко выражен при цветении таких растений как Arum maculatum, Symplocarpus foetidis, Sauromatum guttatum, Philodendron selloum. Так, температура цветка лилии Arum italium может достигать 51⁰С при температуре воздуха 15⁰С, а початок (цветка) скунсовой капусты ( Symplocarpus foetidis ) нагревается до 30⁰ С при температуре воздуха всего лишь в 5⁰С. Таким образом, хотя терморегуляция считается функцией теплокровных животных, в случае термогенеза у ароидных природа не была столь догматична.

Гиперпродукция тепла в цветке ароидных длится приблизительно 12 часов и необходима для испарения пахучих (как правило, неприятно пахнущих) веществ и привлечения насекомых-опылителей. При исследовании этого феномена оказалось, что повышение температуры тканей сопровождается вспышкой дыхательной активности, при этом поглощение О₂ не подавляется цианидом и СО - классическими ингибиторами дыхания животных. Вскоре выяснилось, что и другие ткани высших растений имеют в поглощении О₂ компоненту, не подавляемую цианидом. Так было открыто цианидрезистентное дыхание, характерное для всех семенных растений, а также грибов, водорослей и даже некоторых простейших. Если цианид (1 мМ) полностью подавляет дыхание животных, то у растений цианидрезистентное дыхание варьирует от 10 до 90% в зависимости от вида и физиологического состояния. Целенаправленное изучение этого явления привело к открытию в дыхательной цепи растений альтернативной оксидазы(АО), и связанного с ней альтернативного пути переноса электрона. Активность АО не подавляется цианидом, а также другими ингибиторами комплекса IV – СО и азидом. Специфическими ингибиторами АО признаны соли гидроксамовых кислот (SHAM- салицилгидроксамовая кислота) и n-пропил-галлат.

Альтернативную оксидаза представляет собой один полипептид ( М.В.~ 32 кДа), синтез которого кодируется одним ядерным геном АОХ1. Мутанты по гену АОХ1 получены на растениях табака, картофеля, хлореллы и гриба N. crassa. Известно также, что АО может присутствовать в разных изоформах, экспрессия которых может зависеть от типа ткани. Так у растения Sauromatum guttatum было найдено три изоформы АО с разным молекулярным весом.

Во внутренней мембране растительных митохондрий АО может находиться в мономерной или димерной форме (рис.4.22.). В структуре белка АО есть два остатка цистеина, при окислении которых образуется дисульфидная связь, ковалентно связывающая два мономера. При восстановлении фермента по дисульфидной связи активность АО возрастает в несколько раз.

Альтернативная оксидаза прямо восстанавливает О₂ до Н₂О за счет одного акта, связанного с отнятием от двух молекул QH₂ четырех e‾ согласно реакции:

2QH₂ +O₂ → 2Q + 2H₂O

Механизм восстановления О₂ точно не установлен. Известно, что в каталитическом центре АО есть два атома железа, для связывания которых лигандами служат остатки глутамата, аспарагина и гистидина. Точечный мутагенез по этим остаткам сопровождается инактивацией фермента. Реакция, к

атализируемая АО, не сопряжена с транслокацией протонов и не вносит вклад в создание на мембране Н⁺.

В дыхательной цепи растений реализуются два возможных пути, или две цепи, по которым отнимаемые от субстратов дыхания электроны переносятся на О₂. Эти два пути не автономны, а имеют общий участок, на котором работают комплексы I и II, а также альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, сбрасывающие электроны в пул убихинона (рис.4.14 и 4.23.). Однако с пула убихинона электронные потоки могут разветвляться и идти по основному цитохромному или альтернативному пути. Электронный транспорт по цитохромному пути включает комплексы III и IV, а значит связан с работой протонный помп и синтезом АТФ. Если с пула убихинона электронный поток сворачивает на альтернативный путь через АО, значительная часть его энергии теряется в виде тепла и не используется для синтеза АТФ. В этом случае при окислении НАДН генерация Н⁺ потенциально возможна только на комплексе I, т.е. как минимум два из трех пунктов сопряжения теряются. При окислении сукцината, или, если в окислении НАДН участвуют альтернативные НАДН-дегидрогеназы, вся заключенная в субстратах дыхания энергия рассеивается в виде тепла. Таким образом, вклад альтернативного пути в энергетический баланс в лучшем случае составляет треть от возможного*. Поэтому в случае преобладания альтернативного дыхания клетки для получения АТФ должны использовать в три раза больше субстрата. Избыточное тепло, образуемое из-за необходимости сжигать большее количество субстрата для получения того же количества АТФ, и лежит в основе термогенеза. Можно сказать, что альтернативное дыхание представляет собой вид не сопряженного электронного транспорта, который не зависит от дыхательного контроля.

В митохондриях растений цитохромный и альтернативный путь дыхания конкурируют за электроны, а их вклад в общее поглощение О₂ объективно зависит от активности каждого из них. В первую очередь их соотношение будет зависеть от содержания и активности альтернативной оксидазы.

Определить вклад альтернативной оксидазы в общее поглощение О₂ in vivo является делом довольно трудным. Долгое время считали, что электроны идут преимущественно по цитохромному пути и переключение потока e‾ на альтернативный путь наступает только в условиях «сверхпотока», т.е. при насыщении основного пути. Полагали, что «диспетчером» в этом процессе выступает пул убихинона: при переходе 40-60% пула в восстановленного состояние ци-

*Есть мнение, что альтернативное дыхание, снижая термодинамическую эффективность запасания энергии, в определенном смысле убыстряет сам процесс синтеза АТФ.

тохромный путь насыщается и избыточные электроны начинают уходить, можно сказать « переливаться» на альтернативную цепь. Основываясь на этом допущении, вклад цитохромного и альтернативного пути в общее поглощение О₂ определяли с помощью ингибиторного анализа, используя цианид как ингибитор цитохромоксидазы и SHAM как ингибитор АО. Считалось, что подавление поглощения О₂ SHAM отражает реальный вклад альтернативного дыхания в общую дыхательную активность. Однако оказалось, что все обстоит гораздо сложнее. Дело в том, что цитохромный путь дыхания in vivo практически не достигает насыщения. АО включается при достижении определенного уровня восстановленности пула Q, после чего активно конкурирует с цитохромной цепью за электроны. Стало ясно, что в норме электроны с пула убихинона сразу перераспределяются по двум путям в соответствии с активностью каждого из них. Отсюда следует, что при подавлении одного из путей ингибитором, электронный поток быстро сворачивается в другое русло, что может привести даже к усилению дыхания. Например, при подавлении АО SHAM, эффект ингибитора будет компенсирован усилением электронного потока по цитохромной цепи и не отразится на общем поглощении кислорода. В настоящее время реальный вклад АО определяют довольно сложным и малодоступным методом масс-спектрометрии: метод основан на разном дифференциальном фракционировании АО и цитохромоксидазой изотопов кислорода О¹⁸ и О¹⁶ в составе образующейся воды. Следует отметить, что даже в присутствии КCN и SHAM, поглощение кислорода растительной клеткой полностью не подавляется. Так называемое «остаточное» дыхание может варьировать от 5 до 30% от общего и обусловлено поглощением О₂ в реакциях, прямо не связанных с дыханием.

Активность АО прежде всего определяется тем, в окисленном или восстановленном состоянии находится фермент. В то же время непосредственный восстановитель дисульфидной связи фермента точно не установлен (рис.4.22). Им скорее всего является НАДФН, образованный в матриксе при участииНАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы.Но скорее всего НАДФН сначала восстанавливает белок тиоредоксин*, который в свою очередь прямо восстанавливает дисульфидную связь в составе АО. Кроме того, активность АО зависит от уровня пирувата, который аллостерически активирует фермент.

* Тиоредоксин - небольшой (12-14 кДа) регуляторный белок с двумя остатками цистеина в активном сайте, которые могут окисляться с образованием дисульфидной связи. В восстановленном состоянии тиоредоксин способен восстанавливать регуляторную дисульфидную связь в составе других белков. Вместе с НАДФН, тиоредоксин включен в регуляцию активности многих ферментов, например ферментов цикла Кальвина. Недавно тиоредоксин обнаружен в митохондриях растений.

Соотношение цитохромного и альтернативного дыхания варьирует достаточно широко и зависит как от стадии онтогенеза, так и от физиологического состояния растения. Наиболее впечатляющий тому пример- резкое увеличение интенсивности альтернативного дыхания при цветении ароидных. Но активация альтернативной оксидазы наблюдается и во многих других случаях: при прорастании семян, при старении листьев и цветков, при формировании пыльцы. Вспышка дыхательной активности (так называемый климактерический подъем дыхания) при созревании плодов также связана с усилением альтернативного дыхания. Интересно, что стимуляция альтернативного дыхания, связанная с экспрессией гена АОХ1 и синтезом АО de novo, часто наблюдается в неблагоприятных условиях. Стрессы разной природы, такие как низкотемпературный стресс, засоление, засуха, поранение или внедрение патогена сопровождаются увеличением активности АО. Физиологическая роль АО понятна только в случае термогенеза в цветках ароидных. В других случаях интенсивность дыхания и активность АО не столь велики, чтобы вызвать заметное повышение температуры тканей. Тогда зачем же у растений существует этот способ дыхания, в котором энергия дыхательных субстратов рассеивается и не используется для синтеза АТФ? На этот вопрос существует несколько ответов, возможно, все они являются правильными.

Есть мнение, что альтернативное дыхание - это эволюционно возникший способ, позволяющий растениям поддерживать дыхание при подавлении основной цитохромной цепи цианидом. Дело в том, что многие виды (около 2500 видов, принадлежащих к разным семействам) в естественных условиях в качестве продуктов вторичного метаболизма образуют цианкогенные гликозиды, распад которых может сопровождаться образованием НСN. Биологическая роль этих соединений может быть защитной, направленной против патогенных микроорганизмов или травоядных животных. В свою очередь, цианид могут продуцировать и некоторые патогенные бактерии и грибы. Так, грибок Stemphylium loti, поражающий растение Lotus corniculatus, способен к образованию цианида, и инфекция сопровождается активацией АО в клетках растения. Однако образование в ряде случаев цианида некоторыми растениями не объясняет, почему АО есть у всех растений и какую роль выполняет в нормально функционирующей клетке.

Впервые подобное объяснение было предложено Ламберсом (Lambers,1985). Гипотеза «сверхпотока» предполагала, что альтернативное дыхание – это в своем роде «выхлопной клапан», через который «сжигается» избыток углеводов, которые клетка не в состоянии эффективно использовать или запасти. Сейчас эта гипотеза трансформировалась: альтернативное дыхание рассматривают как механизм поддержания баланса между углеводным метаболизмом и скоростью электронного транспорта. Чтобы понять смысл этого утверждения рассмотрим конкретную ситуацию. Мы знаем, что скорость электронного транспорта контролируется через систему дыхательного контроля и снижается при высоком соотношении АТФ\АДФ в матриксе (4.3.7). Предположим, что электронный транспорт по цитохромной цепи заторможен под действием дыхательного контроля. В этих условиях уровень НАДН в матриксе возрастет. Мы знаем, что ключевые ферменты ЦТК регулируются через соотношение АТФ\АДФ и НАДН\НАД⁺. При высоком уровне НАДН и АТФ работа ЦТК будет блокирована, что должно привести к накоплению пирувата. Но пируват является аллостерическим активатором АО, и его накопление приведет к увеличению активности АО. Это в свою очередь стимулирует электронный транспорт по альтернативной цепи, который, с одной стороны, не будет сопряжен с синтезом АТФ, а с другой стороны приведет к быстрому окислению избытка НАДН. Тем самым будет снят тормоз с ЦТК, интермедиаты которого активно используются в различных биосинтезах. Следовательно, функция АО может заключаться том, чтобы в нужный момент стимулировать быстрое окисление НАДН в дыхательной цепи и тем самым снять с ЦТК «аденилатный контроль», т.е. разрешить работу цикла в условиях, когда концентрации АТФ в матриксе достаточно велики.

Вторая важная функция АО заключается в защите клетки от окислительного стресса. Как уже упоминалось, митохондрии являются сайтами образования супероксидрадикала и Н₂О₂ (4. 3.8.). Интенсивному образованию и накоплению этих опасных соединений способствует торможение электронного транспорта и «перевосстановление» цепи при высоких значенияхН⁺. В этой ситуации повышение активности АО и увеличение скорости транспорта приведет к «разгрузке» цепи за счет быстрого сброса электронов на кислород с образованием «безопасной» воды. Существуют убедительные доказательства в пользу того, что альтернативная оксидаза препятствует генерации в цепи О₂^.- и накоплению в митохондриях перекиси. Одно из них было получено при использовании трансгенных растений табака. К культурам клеток с низкой (линия AS8) и супервысокой (линияS11) активностью АО добавляли антимицин А, ингибитор комплекса III. В результате блокирования электронного потока сброс e‾ на кислород с комплексов I, II, III резко возрастал. В клетках с низкой активностью АО это приводило к чрезмерной генерации О₂^.- и накоплению перекиси, что в итоге заканчивалось их гибелью. В клетках с высокой активностью АО уровень перекиси был не столь высоким, и они выживали. Эти опыты доказывают, что действие альтернативной оксидазы препятствует развитию окислительного стресса. Однако наиболее убедительным доказательством защитной функции АО служит тот факт, что перекись водорода является вторичным мессенджером в сигнальном каскаде, приводящем к экспрессии гена АОХ1 и синтезу АО de novo.(см. 4. 4.4.)

4.3.11. Энергия ⁺ используется для транспорта метаболитов через внутреннюю мембрану митохондрий.

Внутренняя мембрана содержит множество белков-транспортеров, которые переносят метаболиты и ионы через мембрану в ту и другую стороны. Некоторые из них показаны на рис. 4.24. Переносчик может переносить через мембрану только одну молекулу или ион – такой вид транспорта называется унипорт. Однако большинство транспортных белков митохондрий, действуют как портерные системы, способные одновременно перетаскивать через мембрану два соединения в одном (симпорт) или в противоположных (антипорт) направлениях. При этом транспорт заряженных молекул и ионов так или иначе связан с ⁺ на мембране и идет с использованием его составляющих – рН и . Если перенос заряженных молекул влияет на величину , то такой транспорт называют электрогенным. Электронейтральный транспорт не вносит изменений в заряд мембраны.

Движущей силой транспорта может быть градиент рН в том случае, если соединение переносится совместно с ионом Н⁺ или ОН^-. Например, в мембране локализованы белки, которые осуществляют электронейтральный транспорт в матрикс фосфата и пирувата в антипорте, т.е. в обмен на ион ОН^-, который при этом выносится из митохондрий по градиенту рН. Движущей силой электрогенного транспорта является потенциал на мембране - . Ионы или несущие заряд молекулы с помощью транспортеров пересекают мембрану, двигаясь согласно заряду на мембране, внутренняя сторона которой заряжена отрицательно, а внешняя - положительно. По такому принципу действует, например, очень важный белок- транспортер - АТФ/АДФ- транслокатор. Этот переносчик выносит в цитозоль АТФ в обмен на АДФ, тем самым обеспечивая субстратом АТФ-синтазные комплексы. Адениннуклеотиды переносятся через мембрану в виде ионов АТФ ^4- и АДФ^3- согласно градиенту : заряд молекул таков, что в результате их обмена один избыточный отрицательный заряд выносится со стороны матрикса.

АТФ/ АДФ транслокатор имеет специфический ингибиторы. Это бонгкрековая кислота и антрактилозид, которые являются ядами соответственно бактериального и растительного происхождения.

Как уже говорилось в 2.8. , в митохондриальной мембране функционируют транспортеры анионов ди – и трикарбоновых кислот, участвующих в ЦТК. Хотя карбоксильные группы кислот в физиологических условиях несут отрицательный заряд, их транспорт является электронейтральным, т.к. идет по типу антипорта в обмен на ион фосфата или другую дикарбоновую кислоту. Характерно, что в подобном обмене участвуют транспортные каскады, когда транспорт одного соединения из митохондрий зависит от транспорта другого в митохондрию. К примеру, транспорт в митохондрии малата идет в обмен на фосфат, который перед этим поступил в матрикс в обмен на ион ОН^- при использовании градиента рН.

Генерируемый работой цепи  используется не только при транспорте небольших молекул и ионов, но и белков. Известно, что большинство митохондриальных белков кодируются ядерными генами и синтезируются в цитозоле. Белки синтезируются в форме предшественников и наряду со структурной основой содержат особую N-концевую аминокислотную последовательность, которая называется сигнальной, или транзитной. Обычно сигнальный пептид содержит около 80 аминокислотных остатков, среди которых много положительно заряженных остатков аргинина и лизина. От сигнальной последовательности зависит связывание белка с рецептором на митохондриальной мембране и его проникновение в матрикс. Белок проникает в митохондрии в развернутом виде в месте контакта двух мембран- внутренней и наружной. И этот процесс идет успешно только в том случае, если на внутренней мембране поддерживается . Мембранный потенциал необходим как для связывания белка с рецептором, так и для успешного прохождения белком двух мембран. При рассеивании потенциала разобщителями типа валиномицина, белки в момент прохождения застревают в мембране. Транспортируемые в митохондрии белки сначала попадают в матрикс, где первая сигнальная последовательность отщепляется специальной пептидазой (МРР-пептидазой). По последним данным в растительных митохондриях МРР- пептидаза ассоциирована в цитохром b/c₁ комплексом. После этого могут открыться другие сигнальные последовательности, уточняющие адрес доставки в нужный компартмент, например, во внутреннюю мембрану. В то же время есть белки, которые не содержат сигнальных последовательностей, но тем не менее непонятным образом проникают в митохондрии – например, АТФ/АДФ-транслокатор и цитохром с.