4.2.10. Глюкоза может быть окислена через окислительный пентозофосфатный цикл.

В клетках растений и животных существует еще один способ окисления глюкозы, не связанный с энергообменом, но играющий важную роль в обмене конструктивном - окислительный пентозофосфатный цикл (оПФЦ). В ПФЦ можно выделить два этапа (см.рис.4.12.). Первые две реакции цикла необратимы и связаны с последовательным окислением глюкозо-6-фосфата при участии глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и 6-фосфоглюконат дегидрогеназы. В результате этих двух реакций теряется СО₂, восстанавливаются две молекулы НАДФ⁺ и образуется рибулезо-5-фосфат. Второй этап включает реакции, связанные с рекомбинацией 5С-сахаров, в результате которых образуется исходный субстрат - глюкозо-6-фосфат. Для того, чтобы цикл был замкнут, необходимо участие 6 молекул глюкозо-6-фосфата и образование соответственно 6 молекул рибулезо-6-фосфата. Перегруппировка молекул сопровождается превращением 6 молекул х 5С-сахаров в 5 молекул х 6С-сахаров.

У растений ферменты оПФЦ обнаружены как в цитозоле, так и в пластидах. Пластидные и цитозольные изоформы кодируются ядерными генами. В гетеротрофный тканях корня оПФЦ в пластидах протекает достаточно активно, но функционирование оПФЦ в хлоропластах вызывает много вопросов. Дело в том, что на свету в хлоропластах действует цикл Кальвина, многие ферменты которого (фосфатазы, транскетолазы, альдолаза, триозофосфатизомераза) являются также ферментами оПФЦ. Поэтому полагают, что в хлоропластах оПФЦ действует только в темноте. «Выключение» цикла на свету связано с механизмом регуляции глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. Мы уже видели, что активность ферментов может изменяться в результате их обратимого фосфорилирования. Еще один распространенный способ регуляции – это окисление или восстановление фермента по особой, регуляторной дисульфидной связи. На свету глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа переходит в неактивное состояние в результате восстановления по дисульфидной связи (-S-S-  - SH HS-). Полагают, что в восстановлении участвует ферредоксин или тиоредоксин, восстановленные в ходе фотосинтеза. Основная функция оПФЦ – это генерация НАДФН, который требуется во многих биосинтезах, а также синтез углеводов с разным числом углеродных атомов. Образующиеся в цикле 5С- и 4С- углеводы активно уходят из цикла, т.к. необходимы для синтеза нуклеотидов, ароматических соединений, витаминов, флавоноидов, компонентов клеточной стенки и т.д. Кроме того, 3С- и 6С- сахара также могут покидать цикл и включаться в процесс гликолиза, который протекает в тех же компартментах. С учетом этого, функционирование полного и замкнутого оПФЦ in vivo как в цитозоле, так и в хлоропласте представляется маловероятным.

4.3. Электронный транспорт и синтез атф в митохондриях растений.

4.3.1. Электрон - транспортная цепь дыхания состоит из четырех белковых комплексов и АТФ-синтазы, интегрированных во внутреннюю мембрану митохондрий. Перенос электрона от НАДН на кислород идет по градиенту редокс-потенциала.

В предыдущем разделе мы рассмотрели окислительные превращения глюкозы в биохимических реакциях. Конечным результатом этих реакций является образование небольшого количества АТФ и восстановительных эквивалентов в виде НАДН и ФАДН₂. Заключительный этап дыхания связан с трансформацией энергии на сопрягающей мембране и синтезом основной массы АТФ. Образованные в ЦТК НАДН и ФАДН₂ окисляются в ЭТЦ дыхания, локализованной во внутренней мембране митохондрий.

Окисление сопровождается транспортом 2е^- по цепи переносчиков на О₂, который восстанавливается до воды. Переносчиками электронов (кроме убихинона) в дыхательной цепи служат белки, содержащие простетические группы. Это флавопротеиды, в составе которых есть ФМН или ФАД, цитохромы, и железо-серные белки. Способность этих соединений отдавать или принимать электроны может быть охарактеризована через стандартный редокс-потенциал Е₀^/. В дыхательной цепи перенос электрона от НАДН (Е₀^/=-0,32) на О₂ (Е₀^/=+0,82) идет через цепь переносчиков по градиенту, т.е. от соединений с более отрицательным к соединениям с более положительным редокс-потенциалом (рис.4.13). Последовательность расположения в цепи переносчиков впервые была определена в начале 50-тых годов Б.Чансом. Дело в том, что многие компоненты дыхательной цепи имеют разные спектры поглощения в окисленном и восстановленном состоянии. При использовании высокочувствительной спектрофотометрии оказалось возможным определить их переходы из окисленного в восстановленное состояние и обратно во времени. Обнаружение ингибиторов, избирательно блокирующих электронный транспорт на разных участках, чрезвычайно помогло в этих исследованиях.

В митохондриальной мембране ЭТЦ организована сложным образом. В составе основной цепи, т.е. общей для животных, растений и грибов, есть четыре трансмембранных белковых комплекса(1-1V) и АТФ-синтаза (комплекс V) (рис.4.13 и 4.14.). Каждый из комплексов состоит из многих субъединиц белка, часть которых кодируется митохондриальной ДНК, а часть- ядерным геномом. Переносчики электронов входят в состав комплексов и их простетические группы, или редокс-центры, формируют пути переноса электрона. Связь между комплексами осуществляют подвижные переносчики: убихинон и цитохром с. Участники транспорта могут функционировать как двухэлектронные (флавопротеиды и убихинон) и одноэлектронные (цитохромы и Fe-S белки) переносчики.

Общая схема работы основной дыхательной цепи (далее ДЦ) такова (рис.3.2). Образованный в матриксе в ходе ЦТК НАДН окисляется на комплексе I, который представляет собой НАДН-дегидрогеназу. Окисление НАДН сопровождается переносом 2е^- на убихинон, или просто хинон (Q - от английского quinon). Мы знаем (см. «биоэнергетика»), что для полного восстановления Q необходимо два атома водорода. Поэтому, принимая 2е^- , убихинон захватывает недостающие 2Н⁺ из матрикса и переходит в восстановленную форму убихинола (QH₂). Убихинон может быть также восстановлен в результате окисления сукцината на комплексе II, который представляет собой сукцинатдегидрогеназу и является также компонентом ЦТК. Окисление сукцината до фумарата в ЦТК сопровождается восстановлением ФАД - простетической группы комплекса II, с которой е^- передаются на убихинон.

Убихинон в виде пула Q и QH₂ растворен в липидном бислое мембраны. С пула QH₂ электроны уходят на комплекс III, или цитохром b\с₁ комплекс, с которого передаются на цитохром с, локализованный в межмембранном пространстве. Этот небольшой водорастворимый белок действует как одноэлектронный переносчик между комплексами III и IV, перемещаясь путем диффузии вдоль мембраны. Комплекс IV, или цитохромоксидаза, - последний комплекс ДЦ, терминальная оксидаза всех аэробных организмов. Комплекс акцептирует электроны с цитохрома с и передает их на О₂, который в итоге восстанавливается до Н₂О.

Для полного восстановления О₂ необходимо 4e‾. Поэтому 4 цитохрома с должны быть окислены на комплексе IV, чтобы произошла реакция:

О₂ + 4Н ⁺ + 4e‾ = 2Н₂О.

Перенос e‾ в цепи по градиенту редокс-потенциала представляет собой экзергонический процесс с отрицательным значением G^/₀. Освобождаемая при этом свободная энергия запасается на мембране в форме Н⁺. Электронный транспорт сопряжен с генерацией Н⁺, т.к. неразрывно связан с направленным переносом ионов Н⁺ через мембрану. Три комплекса цепи - комплексы I, Ш, IV - функционируют как протонные помпы, перекачивая протоны из матрикса в межмембранное пространство. Энергия Н⁺ реализуется для синтеза АТФ из АДФ и Фн на АТФ- синтазных комплексах ( F₀F₁ АТФазах), также интегрированных во внутреннюю мембрану митохондрий.

Сопряженный с электронный транспортом синтез АТФ получил название окислительного фосфорилирования. Такой является основная, или «стандартная» дыхательная цепь, общая для животных и растений. Но у растений, в отличие от животных, дыхательная цепь организована сложнее: помимо комплексов I-IV она содержит пять дополнительных ферментов. Это четыре НАД(Ф)Н –дегидрогеназы, способные, помимо комплекса I, окислять НАДН, а также и НАДФН. Но наиболее интересная и удивительная особенность дыхания растений связана с присутствием во внутренней мембране растительных митохондрий альтернативной оксидазы. Альтернативная оксидаза (АО) окисляет QH₂ и восстанавливает О₂ до воды и является, таким образом, второй терминальной оксидазой в дыхательной цепи растений. С пула QH₂ электроны могут идти по двум направлениям – по цитохромному пути через комплексы Ш и IV, или по альтернативному пути через альтернативную оксидазу (рис.4.14.). Электронный транспорт по альтернативному пути не сопровождается генерацией Н⁺, и поэтому большая часть энергии электронного потока рассеивается в виде тепла.

Рассмотрим теперь подробно события, которые происходят на комплексах ДЦ и которые являются предметом интенсивного изучения во многих лабораториях мира. Все комплексы удалось выделить из мембран и исследовать (за исключением комплекса I) их трехмерную молекулярную структуру с разрешением 2,9 Å с помощью ренгеноструктурного анализа. В то же время события на комплексах нельзя считать до конца разгаданными, - полученные данные только приближают нас к истине. При этом следует признать, что исследований на растительных объектах было мало, и во многом наши знания базируются на аналогиях с другими, более изученными системами животного или бактериального происхождения.

4.3.2. Комплекс I – НАДН-убихинон-оксидоредуктаза окисляет НАДН и восстанавливает убихинон. Электронный транспорт в комплексе сопряжен с генерацией Н⁺.

Комплекс I, или НАДН-дегидрогеназа, был выделен из ряда объектов: митохондрий сердца быка, из митохондрий сахарной свеклы (Beta vulgaris), картофеля ( Solanum tuberosum), бобов ( Vicia faba), а также митохондрий гриба Neurospora crassa и мембран E. coli. Исследования показали, что по своим свойствам он существенно не отличается у объектов животного и растительного происхождения. Этот крупный комплекс с молекулярной массой 700-900 кДа состоит из 30 – 41 ( в зависимости от объекта) белковых субъединиц. В его составе присутствует эволюционно-консервативный кор-комплекс, состоящий из 14 субъединиц. Электронная микроскопия показала, что комплекс имеет характерную L-образную форму, напоминающую башмак. Гидрофобная «подошва» представлена белками, встроенными в мембрану, а гидрофильная часть – «лодыжка» – обращена в матрикс (рис.4.15). У растений девять субъединиц, входящих в состав гидрофобной части комплекса, кодируются митохондриальной ДНК, а остальные компоненты находятся под контролем ядерных генов. Интересно, что мутации, затрагивающие комплекс I, возникают при некоторых заболеваниях человека, например в случае болезни Альцгеймера. У растений мутации по комплексу I описаны у табака (Nicotiana silvestris) и кукурузы (Zea mays): мутации сопровождались патологией пыльцы и приводили к такому явлению, как цитоплазматическая мужская стерильность.

В

ē

Q_i^.-

качестве редокс-центров в комплексе действует один ФМН, расположенный в гидрофильной части комплекса, а также 6-7 железо-серных центров ( 2Fe-2S и 4Fe-4S -кластеры), обозначаемых как N1, N2, N3 и т.д (рис.4.15.). Кроме того, в гидрофобной части комплекса есть по крайней мере два сайта связывания для Q, в одном из который по-видимому, находится прочно связанный убихинон, фиксированный в структуре комплекса.

Классическими ингибиторами комплекса I являются ротенон, амитал натрия и пиерицидин А. Ротенон - флавоноид, эстрагируемый из корней некоторых тропических растений, блокирует электронный транспорт между одним из Fe-S клстеров и пулом убихинона. Ротенон давно используется как инсектицид и рыбный яд, т.к. митохондрии насекомых и рыб особенно к нему чувствительны. Амитал натрия представляет производное барбитурой кислоты. Пиерицидин А – антибиотик, продуцируемый Streptomyces, является структурным аналогом убихинона и конкурирует с ним за места связывания. Комплекс окисляет «внутренний», т.е. образованный в матриксе НАДН*

(Е₀^/ =-0,32В), и восстанавливает убихинон (Е₀^/ =+0,09В). При этом комплекс работает как протонная помпа: на каждый окисленный НАДН и восстановленный Q через мембрану из матрикса ( in) в межмебранное пространство (out) перекачивается как минимум 4 Н⁺:

Н АДН + Н⁺ + Q + 4Н⁺_in НАД⁺ + QН₂ + 4H⁺_out

Известно, что при окислении НАДН отдает 2 е^- на ФМН, с которого электроны поочередно уходят Fe-S-центры, функционирующие как одноэлектронные переносчики. При этом точный путь е^- в комплексе не установлен: есть данные, что восстановление Q идет с N2-кластера. В конечном итоге хинон принимает 2e^- и полностью восстанавливается до QH₂, захватывая из матрикса 2Н⁺. Транспорт электрона в комплексе сопряжен с направленным переносом протонов и генерацией на внутренней мембране Н⁺. Механизм этого процесса не установлен. Обсуждаемые модели (Dutton et al.,1998) основаны на предположении, что в комплексе оперирует система, похожая на Q- цикл (см. 4.3.4.). Дело в том, что в комплексе обнаружены сайты, в которых связанные хиноны могут находиться в разных редокс-состояниях: окисленном (Q), восстановленном (QH₂) и в состоянии семихинона (Q·ˉ). Предполагается, что электронный транспорт в комплексе связан с обратимым восстановлением и окислением связанных хинонов. Процесс организован так, что при восстановлении Q протоны захватываются из матрикса, а при окислении – освобождаются в межмембранное пространство.

* Комплекс I имеет низкое сродство к НАДФН и не вносит существенного вклада в его окисление.