3.7.3. Структурно-функциональная организация и механизм работы атф-синтазного комплекса.

Рентгеноструктурные и генетические исследования, проведенные в последние годы, позволили выяснить пространственную организацию АТФ-синтазного комплекса, предполагаемая структура которого дана на рис. 2.2 (глава 2).

АТФ-синтаза хлоропластов представляет собой мембранно-связанный белковый комплекс, который можно разделить на две части - СF₀ и СF_1.. Сопрягающий фактор СF₀ является интегральным гидрофобным белком мембраны, выполняющим функцию протонного канала. У высших растений СF₀ состоит из 4-х типов субъединиц: субъединица I осуществляет связь СF₀ с СF₁, субъединица II организует 12 копий субъединицы III, которые образуют олигомерное кольцо и взаимодействуя с субъединицей IV обеспечивают транслокацию Н⁺ из люмена в строму. Стехиометрический состав СF₀ : I₁, II₁, III₁₂, IV₁ . У E. coli F₀ (рис. 2.2) состоит из трех типов субъединиц : a₁ (IV), b₁, b₁′ (I, II), C_9-12 (III).

Сопрягающий фактор I (СF₁) водорастворимый белковый комплекс, находится на стромальной поверхности мембраны, состоит из 5-ти типов субъединиц в соотношении α₃, β₃, γ, δ, ε. СF₁ содержит три каталитических центра синтеза АТФ, расположенных на трех b-субъединицах, и выполняет также структурную функцию, закрывая протонный канал мембраны. При удалении СF₁ с поверхности мембраны (обработкой растворами ЭДТА, бромида натрия) хлоропласты теряют способностьк фосфорилированию, что обусловлено не только удалением структур, несущих каталитические центры, но также увеличением протонной проводимости мембран и потерей их способности сохранять протонный градиент.

Три пары субъединиц α и β образуют гексамер (αβ)₃, где расположены каталитические и регуляторные центры. Субъединицы γ и ε формируют «ствол» АТФ-синтазы и играют ведущую роль в энергетическом сопряжении процессов транслокации протонов и работы каталитических центров. При вращении γ и ε субъединиц в ходе катализа происходит передача конформационных сигналов на пары αβ субъединиц, в результате чего происходит захват нуклеотидов (АДФ), синтез АТФ и высвобождение ранее синтезированной молекулы АТФ. Субъединица ε выполняет также регуляторную функцию, являясь ингибитором АТФ-азной активности СF₁, она осуществляет кинетический контроль активности фермента. Субъединица δ участвует в связи СF₀ и СF₁, она ассоциирована с парой субъединиц α и β и с субъединицами I и II.

В соответствии с ротационной теорией Бойера (ротационный механизм детально описан в гл. II, рис. 2.3) для нормального функционирования АТФ-синтазы необходимо прочное сопряжение процессов транслокации протонов, вращательного движение ε и γ субъединиц и взаимодействия их с (αβ)₃ гексамером.

Согласно ряду исследований (Futai et al., 2000), субъединицы III и IV (в СF₀) образуют единый комплекс, в котором субъединица IV совместно с субъединицами I, II и δ представляют статор, удерживающий (αβ)₃ гексамер, а 12 субъединиц III служат основанием ротора, сопряженным с субъединицами γ и ε. При транслокации протонов через каналы субъединицы IV и последовательного протонирования и депротонирования карбоксильной группы аминокислоты (аспарагин 61) в каждой из 12 субъединиц III происходит вращение олигомера III с последующим переносом протона в стромальное пространство. Движущей силой движения Н⁺ является трансмембранная разность протонных потенциалов в люмене (высокий) и в строме (более низкий). Вращательное движение олигомера III благодаря аминокислотным контактам сопряжено с вращением субъединиц γ и ε, что вызывает их конформационные изменения с последующей передачей конформационных сигналов в каталитические центры β-субъединиц благодаря взаимодействию α-спиралей γ-субъединиц с тремя β-субъединицами.

Таким образом, в результате взаимодействия СF₀ и СF₁ происходит передача конформационных сигналов, индуцированных транслокацией протонов через мембрану при участии субъединиц III и IV. Функциональное сопряжение между субъединицами осуществляется за счет ионизированных остатков аминокислот.

Структурная организация каталитических центров CF₁ исследована с помощью рентгеноструктурного анализа. Показано, что три β субъединицы имеют неодинаковую конформацию и их каталитические центры связывают разные нуклеотиды. Один из каталитических центров содержит АТФ (β_тр), другой связывает АДФ (β_др), а третий не содержит нуклеотида (β_Е). Каталитические центры β-субъединиц, связанных с нуклеотидами (АТФ и АДФ) находятся в закрытой конформации, а β-субъединиц, не связанных с нуклеотидами – в открытой конформаци. При функционировании фермента имеет место переход от закрытой к открытой конформации β_Е.

Главной составляющей гипотезы Бойера является идея кооперативности работы каталитических центров, согласно которой каждый из 3-х каталитических центров последовательно проходит через три различных конформационных состояния в течение каталитического цикла (Бойер, 1993). Нуклеотид связывающие центры β-субъединиц взаимодействуют сопряжено и кооперативно в ходе катализа. Последовательная передача конформационных изменений от одних центров к другим осуществляется путем изменения ориентации боковых цепей аминокислот в каждом каталитическом центре.

Механизм работы каталитических центров включает ряд этапов. Фермент содержит три кооперативно функционирующих каталитических центра. Константа связывания субстратов (АДФ+Ф_н) и продуктов реакции (АТФ) в каждом центре изменяется в ответ на энергозависимые конформационные изменения фермента. Изменения происходят последовательно: I этап – непрочное связывание АДФ и Ф_н (L-состояние), на 2-ом этапе – прочное связывание субстратов с образованием АТФ и выделением Н₂О (Т-состояние), 3-й этап – энергозависимое освобождение прочносвязанной молекулы АТФ и свободная диссоциация АТФ (О-состояние) (рис. 2.3, глава 2).

Главными участниками в реакциях синтеза АТФ в каталитических центрах являются – фосфатная группа АДФ, неорганический фосфат и ион магния, образующий координационную связь с одной из аминокислот каталитического центра (рис. 3.39). В реакции синтеза АТФ β-фосфат АДФ и неорганический фосфат образуют связь с аминогруппой лизина 155, а также с магнием при участии треонина 156. В ходе катализа в результате конформационных изменений каталитического центра между β-фосфатом молекулы АДФ и неорганическим фосфатом возникает фосфоэфирная связь и синтезируется молекула АТФ. Ангидридная связь при синтезе АТФ не требует специальных затрат энергии и образуется в результате резкого уменьшения константы равновесия реакции, обусловленного изменением микроокружения активного центра.

Согласно теории Бойера энергия Δμ_Н⁺ используется для конформационных изменений структур каталитического центра АТФ-синтазы, в результате которых изменяются константы связывания нуклеотидов, что завершается синтезом АТФ из АДФ и Ф_н и освобождением молекулы АТФ из активного центра фермента.