6.3.4.2. Системы транспорта кальция.

Содержание кальция в отдельных структурах клетки регулируется с участием Са²⁺-помп и Са²⁺-каналов (рис. 6.61). Градиент электрохимического потенциала для Са²⁺ на плазмалемме (ПМ), тонопласте (ТП) и мембране ЭР таков, что поступление Са²⁺ в цитозоль происходит по каналам пассивно, а удаление с участием помп – с затратой энергии.

Низкая концентрация кальция в цитозоле – необходимое условие для функционирования Са²⁺ в качестве универсального посредника при передаче информации. Реализация функций мессенжера связана с очень малыми его потоками через мембраны. Разнообразные стимулы (гормоны, свет, механические воздействия, гипоосмотики и окислители, засуха, низкая и высокая температура, Nod-фактор, сигналы межклеточных взаимодействий, гравиотропизм и др.) через быстрое изменение потенциала клеточной мембраны приводят к открыванию Са²⁺-каналов и возрастанию его концентрации в цитозоле. Возвращение концентрации Са²⁺ к стационарному уровню покоя обеспечивается работой Са²⁺-АТФаз. Такое изменение концентрации Са²⁺ в цитозоле названо нестационарным или переходным (transient) состоянием. Локальное и часто кратковременное увеличение концентрации Са²⁺ в цитозоле действует как сигнал, передающий информацию от поверхности клетки внутрь. Кальциевый сигнал может усиливаться за счет дополнительного выхода Са²⁺ в цитозоль из вакуоли или ЭР.

Са²⁺- помпы. Выкачивание Са²⁺ из цитозоля осуществляют Са²⁺-АТФазы, которые принадлежат к большому семейству АТФаз Р-типа, и Са²⁺/Н-антипортеры.

Са²⁺-АТФазы растений и животных делят на: ПМ (или IIВ) типа, стимулируемые кальмодулином (КаМ), и ЭР (или IIА) типа, которые непосредственно КаМ не стимулируются. У растений, в отличие от животных, Са²⁺-АТФазы ПМ типа локализованы не только на плазмалемме (Са²⁺-АТФаза ПМ1), но и на эндомембранах (Са²⁺-АТФаза ПМ2 и ПМ3) (рис. 6.54). Са²⁺-АТФазы ЭР типа также присутствуют как на мембране ЭР, так и на тонопласте.

ПМСа²⁺-АТФазы имеют высокое сродство к Са²⁺ (К_m от 0,4 до 12 мкМ). На тонопласте, помимо Са²⁺-помпы, функционирует Са²⁺/Н⁺ антипорт. Выкачивание Са²⁺ из цитозоля с участием антипорта сопряжено с работой вакуолярной Н⁺-АТФазы, для которой гомеостатирование кальция считается конститутивной функцией. Более того, вакуолярная Н⁺-АТФаза, пирофосфатаза (Н⁺-ПФаза) и Са²⁺/Н⁺ антипортер совместно участвуют в поддержании рН и ионного гомеостаза в цитозольном и вакуолярном компартментах. Некоторые Са²⁺-АТФазы и Са²⁺/Н⁺ антипортеры идентифицированы на генном уровне.

Итак, Са²⁺-помпы выполняют несколько важных функций. Наряду с центральной – поддержание низкой концентрации кальция и создание фона для возникновения кальциевого сигнала, они обеспечивают создание пулов Са²⁺ в апопласте, вакуоли, ЭР, откуда он может контролируемо возвращаться в цитозоль. Функционирование Са²⁺-АТФаз, связанное с восстановлением [Са²⁺]цит до уровня покоя, одновременно обеспечивает завершение переходного состояния и, таким образом, формирование Са²⁺ сигнала (см. раздел 3.4.3).

Са²⁺-каналы. Са²⁺ каналы делятся на две группы: потенциал-зависимые (VD-voltage-dependent) и рецептор-управляемые или лигандо-зависимые. К настоящему времени изучены электрические и биохимические свойства, регуляция и физиологическая роль ряда кальциевых каналов из разных мембран растений, но пока не осуществлена их идентификация на генетическом уровне.

В плазмалемме клеток, главным образом, корней и замыкающих клеток устьица, обнаружено несколько VD Са²⁺-каналов, которые могут быть подразделены на каналы, активируемые при деполяризации, и при гиперполяризации плазмалеммы. К первому классу относится так называемый «макси-катионный канал» (рис. 6.54), который имеет высокую проводимость единичного канала, но мало селективен. Он пропускает K⁺, Na⁺, Ba⁺, Mg²⁺, Mn⁺ и некоторые другие ионы, хотя вход Са²⁺ через этот канал при физиологических концентрациях ионов, видимо, доминирует. Другой Са²⁺-канал, также активируемый при деполяризации (VD Са²⁺-канал) более селективен для Са²⁺, но имеет меньшую проводимость. Неселективные каналы, очевидно, основной путь поступления кальция в клетку из внешней среды, например, в корнях, или из апопласта в устьичные клетки листа. В класс VD Са²⁺-каналов плазмалеммы, активируемых при гиперполяризации, входят механочувствительные (stretch-activated) каналы разных типов, в том числе и Са²⁺-канал замыкающих клеток устьица, который регулируется АБК (рис. 6.54 – VD-мех Са²⁺-канал). У других клеток подобные каналы также могут иметь большое значение в восприятии тургора, например, при удлинении корневого волоска и пыльцевой трубки.

На тонопласте функционируют потенциал-зависимые каналы, активирующиеся при гиперполяризации – ВVD Са²⁺-канал и при деполяризации - медленный (slowly) SVD Са²⁺-канал (рис. 6.54). Оба эти типа VD-каналов не являются строго специфичными для Са²⁺ и проницаемы также для Mg²⁺, K⁺, а SVD Са²⁺-канал – еще и для Na⁺, Rb⁺, Cs⁺. Выход Са²⁺ через SVD Са²⁺-канал активируется, помимо потенциала, при увеличении [Са²⁺]цит и регулируется другими факторами (рН, концентрацией других ионов, соотношением [Са²⁺]цит/[Са²⁺]вак, КаМ, 14-3-3 белками и, возможно, состоянием фосфорилирования-дефосфорилирования). Функции SVD Са²⁺-канала связывают с осморегуляцией и поддержанием гомеостаза. Кроме того, через этот канал происходит Са²⁺ индуцируемое высвобождение Са²⁺ из вакуоли (CICR- Са²⁺ induced Са²⁺ release), что приводит к увеличению его концентрации в цитозоле и вносит вклад в специфичность сигнала (см. раздел 3.6.3).

Из вакуоли Са²⁺ выходит также через рецептор-управляемые каналы, которые открываются при рецепции вторичных мессенжеров: инозитол-1,4,5-фосфата (IP₃ инозитолтрифосфат) или циклической АДФ-рибозы (цАДФриб) (рис. 6.54). С активацией этих вакуолярных каналов связаны ответные реакции на гиперосмотический (BIP₃ Са²⁺кан) и холодовой (цАДФриб Са²⁺-кан) шок. В ответ на действие АБК при закрывании устьиц активируются оба эти канала.

В мембране ЭР также присутствуют потенциал- и лигандо-зависимые Са²⁺ каналы. Одним из первых каналов ЭР мембраны растений был охарактеризован потенциал-зависимый механочувствительный канал (ЭРVD Са²⁺-кан) (рис. 6.54) из усиков Brionia dioica (назван ВСС1 Brionia calcium channal). Предполагают, что ВСС1 регулируется через изменение концентрации кальция в люмене ЭР, хотя рН цитозоля также влияет на его активность. С IP₃ Са²⁺-каналом ЭР мембраны связывают увеличение [Са²⁺]цит и передачу информации в растущей пыльцевой трубке.

Итак, в растительной клетке в ответ на действие разных стимулов увеличивается концентрация кальция в цитозоле, что является Са²⁺ сигналом для передачи информации. Первичными источниками изменений концентрации являются Са²⁺-каналы с разными пропускными характеристиками, с разными способами регуляции и расположенные на плазмалемме и эндомембранах. Разнообразие путей входа Са²⁺ в цитозоль вместе с разнообразием путей выхода (Са²⁺ помпы) создают большую гибкость в контроле за его потоками как в пространстве клетки, так и во времени и обеспечивают возникновение специфического Са²⁺ сигнала, локализованного в связи с участием каналов разных типов в определенных участках клетки.

6.3.4.3. Са²⁺ и системы внутриклеточной сигнализации.

Изменение программ роста и развития, контроль метаболизма и формирование ответных реакций на действие условий среды происходит вследствие передачи сигналов на белки-мишени или в геном по сложной сети информационных (сигнальных) путей. В клетке информация передается цитозольным структурам и компартментам через изменения концентрации множества вторичных мессенжеров (посредников), которые действуют в той или иной сигнальной системе вместе с кальцием или самостоятельно. Однако, Са²⁺ в комплексной сети передачи информации (transduction) служит универсальным посредником, поскольку ни один вторичный мессенжер не реагирует на столь большое число стимулов, как свободный Са²⁺ цитозоля. Включение Са²⁺ в широкую сеть сигнальных путей, которые передают послания от разных стимулов (внешних и внутренних) и заканчиваются соответствующими ответными реакциями, поднимает вопрос о том, каким образом в растительной клетке с участием одного и того же мессенжера достигается специфичность сопряжения стимула и ответа.

Специфичность Са²⁺ сигнала. Исходно в основе специфичности кальциевой сигнализации лежит компетентность клетки, ее функциональное предназначение. Способность реагировать на определенные стимулы и формировать соответствующий ответ зависит от экспрессии генов, кодирующих компоненты каскадного пути передачи конкретного сигнала в соответствующих клетках. Комплекс характерных свойств клетки, определяющий особенность ее сигнальной системы, получил название «физиологического адреса», который различается у разных клеток (например, у замыкающих клеток устьиц и трихобластов корня). Информация от стимулов, включая силу их воздействия, первоначально кодируется в кальциевом сигнале, отражающем характер возрастания концентрации Са²⁺ в цитозоле ([Са²⁺]). Это переходное (транзитное) состояние может иметь вид всплесков, волны, пульсаций или осцилляций, плато, градиента, или быть сочетанием этих проявлений (рис. 6.55). Основные варьирующие параметры Са²⁺ сигнала, которые могут быть оценены количественно, это: уровень увеличения [Са²⁺]цит; продолжительность лаг-периода от момента воздействия до начала подъема [Са²⁺]; продолжительность подъема нахождения на высоком уровне и возвращения к уровню покоя. Сигнальная информация может быть закодирована в амплитуде и частоте осцилляций (пульсаций), их регулярности. Даже самое общее сравнение характера Са²⁺-сигналов при действии разных стимулов (рис. 6.55) свидетельствует об их разнообразии: кратковременное (холодовой шок) или очень продолжительное (красный свет) увеличение [Са²⁺]цит; появление двухфазной кинетики переходного состояния (гипоосмотический шок) или образование градиента концентрации Са²⁺ (растущий корневой волосок). Кинетика изменения концентрации Са²⁺ может меняться в зависимости от силы и продолжительности действия стимула. Однако, только в редких случаях величина изменения [Са²⁺]цит и конечная ответная реакция на стимул коррелируют со степенью его воздействия. Это обусловлено множеством причин, в частности, тем, что стимул (фактор) в своем действующем начале имеет две составляющие: само воздействие (физическое, химическое или комплексное) и параметры времени. При холодовом шоке, например, увеличение уровня [Са²⁺]цит (которое начинается сразу) (рис. 6.55 п.1) зависит не от абсолютного значения низкой температуры, а от скорости ее снижения. При действии многих стимулов увеличение [Са²⁺] в цитоплазме связано с осцилляциями (пульсациями), которые имеют определенную амплитуду и частоту и могут повторяться через менее или более регулярные интервалы (рис. 6.55 п.4 и 6).

Разнообразие свойств и способов регуляции Са²⁺-каналов является основой, обеспечивающей взаимодействие путей передачи сигналов с участием разных посредников. Идентифицирован ряд вторичных мессенжеров, которые связаны с возникновением и спецификой Са²⁺ сигнала (IP₃, цАДФриб, Н⁺ и др.). Инозитол-1,4,5,-фосфат – конечный продукт превращения минорного компонента плазмалеммы фосфатидилинозитола (РI), но непосредственным предшественником IP₃ является PIP₂ (РI-4,5бисфосфат) (рис. 6.64). При рецепции определенных стимулов активируются регуляторные G-белки плазмалеммы, в результате чего диссоциирует их -субъединица, активирующая фосфолипазу С (ФЛ «С»)^*. Активированная ФЛ «С» гидролизует PIP₂ с образованием двух вторичных мессенжеров: 1,2-диацетилглицерола (ДАГ) – активатора протеинкиназы С и IP₃ – регулятора активности Са²⁺-каналов эндомембран и, как считают, основного участника формирования Са²⁺ волны^**. Другой распространенный вторичный мессенжер животных и растительных клеток – цАДФриб также действует как сигнальная молекула, активирующая выход Са²⁺ из эндогенных депо.

Поступление кальция в цитозоль через рецептор управляемые Са²⁺-каналы вносит дополнительный (к притоку Са²⁺ извне) вклад в увеличение [Са²⁺]цит и приводит к возникновению и поддержанию осцилляций (например, в базальной части пыльцевой трубки, при осмотическом стрессе, при действии АБК в замыкающих клетках устьица) (рис. 6.55 п.4). Таким способом сигнальная информация не только кодируется в амплитуде и частоте всплесков, но с помощью осцилляции сигнал усиливается и меняется по продолжительности, что обеспечивает регуляцию его передачи во времени.

Специфичность Са²⁺ сигнала обусловлена также его локализацией в клетке и, если это касается такой формы сигнала как градиент или волна, вектором их распространения. Разный характер увеличения и снижения концентрации Са²⁺ в цитозоле может быть результатом его поступления из разных депо (апопласт, вакуоль, ЭР) через разнообразные Са²⁺-каналы, снижение при возвращении [Са²⁺]цит к уровню покоя (новый уровень может не совпадать с исходным) за счет работы Са²⁺-АТФаз разных мембран (рис. 6.54). В клетках, растущих кончиком (трихобласт, пыльцевая трубка и др.), сигналом ориентированного роста служит градиент с высокой Са²⁺ концентрацией в растущем кончике (рис. 6.55 п.5). Основой поддержания этого градиента является пространственное разделение входа Са²⁺ в цитозоль по Са²⁺ каналам плазмалеммы в зоне активного роста кончика и выкачивания Са²⁺ АТФазами плазмалеммы и эндомембран в базальной части клетки корневого волоска. При воздействии Nod-фактора, вызывающего образование азот-фиксирующих клубеньков у бобовых, кальций также поступает извне через Са²⁺каналы кончика корневого волоска (рис. 6.55 п.6). Но Са²⁺ сигнал проявляется как быстро нарастающее увеличение [Са²⁺]цит и всплески в области ядра, что приводит к скручиванию корневого волоска и смены программ дифференциации и функционирования.

Образование всплесков, осцилляций, волн, градиентов концентрации Са²⁺ цитозоля, их разнообразных субпроизводных и сочетаний, а также различия в кинетике и локализации изменений [Са²⁺]цит отражают комплексность системы формирования Са²⁺ сигнала в каждой отдельной клетке. Возникающий в ответ на определенный стимул Са²⁺-сигнал является настолько специфичным с точки зрения кодирования информации, что получил название Са²⁺ подписи (Са²⁺ signature). Подобный специфичный Са²⁺-сигнал – первый этап возникновения специфичной ответной реакции.

Пути передачи Са²⁺ сигналаю. Зашифрованная информация, чтобы достигнуть нужных белков-мишеней, определяющих ответ на стимул, передается по сигнальным путям с помощью образования комплексов кальция со специальными белками. К группе регуляторных белков растений, связывающих Са²⁺ относятся: кальмодулин – КаМ (CaM - calmodulin); Са²⁺-зависимые протеин-киназы – Са²⁺-завПК (CDPKs – calcium dependent protein kinases) и Са²⁺/КаМ зависимые протеин-киназы - Са²⁺/КаМ ПК (CCaMKs - calcium and calmodulin dependent protein kinases) (рис. 6.56). Эти белки имеют специальные места связывания Са²⁺, называемые EF руками. Термин возник из обозначения двух  спиралей, E и F, являющихся частью Са²⁺-связывающего центра. Часто белки, имеющие подобные домены связывания кальция, именуют как группу регуляторных белков «EF рука».

Са²⁺-завПКзы принадлежат к одной из групп суперсемейства протеинкиназ (ПК) эукариотических клеток. ПКазы катализируют обратимый перенос фосфата с АТФ на боковые участки аминокислот белковой цепи. Функции ПК могут быть обращены действием протеиновых фосфатаз (ПФФ). Реакции фосфорилирования-дефосфорилирования оказывают значительное воздействие на активность белков и их взаимодействие с другими белками. Са²⁺-завПКазы имеют три функциональных домена – каталитический, автоингибиторный и С-терминальный кальмодулин-подобный регуляторный домен с четырьмя EF руками, связывающими Са²⁺. Это позволяет считать Са²⁺-завПКазы (как и КаМ) первичными сенсорами путей передачи Са²⁺ сигнала (рис. 6.56 4а, 4б). Впервые Са²⁺завПКзы были обнаружены у растений и простейших и пока не найдены в клетках дрожжей и животных. Считают, что у растений большая часть киназной активности, которая стимулируется кальцием, связана именно с Са²⁺-завПКазами (меньшая с Са²⁺/КаМПКазами и КаМ). Обнаружено множество изоформ Са²⁺завПКаз (у Arabidopsis идентифицировано более 40 изоформ). Это ставит вопрос о функциях этих изоформ. Есть основание полагать, что разные изоформы могут «специализироваться» на узнавании Са²⁺-сигналов. Постоянно пополняемый список белков-мишеней для Са²⁺завПК включает транспортные белки мембран (Н⁺АТФазу ПМ, калиевые и анионные каналы замыкающих клеток устьиц, аквапорины и др.), ферменты (сахарофосфатсинтазу (СФС), фосфоэнолпируваткарбоксилазу (ФЭПк), нитратредуктазу (НР), фосфатидилинозитолкиназу и др.), факторы транскрипции, элонгации, белки цитоскелета и другие мишени (рис. 6.56, 5). Таким образом, Са²⁺-завПК включены в передачу Са²⁺-сигнала, связанную с поддержанием мембранного потенциала, регуляцией углеводного и азотного обмена, устьичными движениями, ответами на стрессовые воздействия, формированием архитектуры клетки и т.д..

Однако, видимо, полная активация фермента при фосфорилировании с участием Са²⁺-завПКаз возможна, если одновременно к регуляторному участку присоединяется 14-3-3-белок. Вместе с Са²⁺-завПК, 14-3-3-белки включены в передачу сигнала, функционируя как адапторы, шапероны, активаторы и репрессоры. Они участвуют в регуляции активности СФС, НР, ФЭПк, что обеспечивает согласованное функционирование этих ферментов в условиях дня и ночи. 14-3-3-белкам приписывается также роль обеспечения взаимосвязи между различными путями передачи сигналов, которые вызываются разными, действующими одновременно стимулами (экзогенными и эндогенными).

Кальмодулин (КаМ) относится к семейству белков «EF рука» и является наиболее распространенным Са²⁺-связывающим белком, который играет центральную роль у всех организмов. Растительные КаМ – высококислые белки с массой 14 кДа, локализованные в цитозоле (обнаружены в ядре и, возможно, прикреплены к плазмалемме). КаМ эукариотных организмов проявляют большую консервативность: аминокислотные последовательности белка растений идентичны КаМ позвоночных и дрожжей на 90 и 60%, соответственно. Но у растений, в отличие от животных, обнаружены мультигенные семейства КаМ-родственных генов, экспрессия которых индуцируется физическими (касание, тепловой и холодовой шок, темнота-свет) и химическими (ауксин, NaCl) стимулами. Индуцированная экспрессия некоторых из этих КаМ-генов опосредована увеличением [Са²⁺]цит (рис. 6.56, 4в). Предполагается, что характер их экспрессии, заканчивающийся появлением изоформ КаМ (рис. 6.56, 6), и/или конечные мишени сигнального пути (рис. 6.56, 5, 5а, 5в) различаются в зависимости от стимула. Таким образом, наличие изоформ КаМ значительно расширяет возможности адресной доставки сигнала. КаМ и комплекс Са²⁺КаМ не обладают свойствами фермента и включаются в передачу сигнала и регуляцию клеточных процессов, присоединяясь к белкам-мишеням. Са²⁺ связывающий центр КаМ имеет структуру спираль-петля-спираль. Петля, где связывается Са²⁺, состоит из 12 аминокислот и ограничена с С- и N- концов  спиральными участками, состоящими также из 12-14 аминокислот и обозначенными буквами E и F. Разные Са-связывающие белки могут иметь разное число центров для связывания Са²⁺. КаМ растений имеют четыре функциональные «EF-руки» с Са-связывающими доменами. Связывание Са²⁺ при увеличении его концентрации в цитоплазме вызывает пространственную переориентацию аминокислот в петле и  спиралях и переупаковку этих центров, связывающих Са²⁺, в структуре всего КаМ-белка. Передача сигнала становится возможной, если эти конформационные перестройки узнаются белками-мишенями, которые, в конечном итоге, преобразуют изменения концентрации Са²⁺ в цитозоле в ответ на специфический сигнал (рис. 6.56, 5).

Концентрация КаМ в цитозоле может составлять 5-20 мкМ и варьирует в разных типах клеток. Это предполагает вероятность конкуренции за КаМ между КаМ-связывающими белками, что может играть роль в детерминировании клеточного ответа на увеличение [Са²⁺]цит. Взаимодействие между Са²⁺КаМ и КаМ-регулируемыми белками, главным образом, гидрофобное, и даже незначительные модификации последовательностей на гидрофобном прикрепляющем участке КаМ могут лишить его возможности активировать белки-мишени.

Важное отличительное свойство Са²⁺-КаМ комплекса – способность связываться с большим числом разнообразных белков-мишеней. Са²⁺-КаМ комплекс активирует непосредственно или через модификацию реакций фосфорилирования-дефосфорилирования много больше 100 белков. У животных идентифицировано более 30 ферментов и других белков, которые регулируются Са-КаМ. В растительной клетке таких белков идентифицировано и охарактеризовано значительно меньше. Са²⁺-КаМ зависимыми являются: Са²⁺-АТФазы II В-типа; SV вакуолярный катионный канал; НАД-киназа, глутаматдекарбоксилаза, супероксиддисмутаза; миозин V, киназин; ПКазы и ПФФаза 2В, белки кончика корня и некоторые другие (рис. 6.56, 5, 5а).

Мишенями, на которые передаются Са²⁺-сигналы, часто являются транспортные системы, в том числе Са²⁺-помпы. Са²⁺-АТФазы II В-типа обеспечивают регуляцию [Са²⁺]цит, необходимую для возникновения Са²⁺ сигнала, определяют характер переходного состояния, связанный с завершающей стадией, и в то же время сама их активность регулируется с участием Са²⁺-КаМ. Са²⁺-АТФазы II В-типа являются компонентами не только плазмалеммы, но и эндомембран (рис. 6.54) и, возможно, локализованы в оболочке ядра. КаМ регулирует активность Са²⁺-помпы, связываясь на автоингибиторном домене С-конца и меняя пространственное расположение этого участка, он снимает его блокирующее действие. Но у растительных Са²⁺-АТФаз (по крайней мере, у некоторых - АСА2 - Arabidopsis Ca²⁺-ATPasa, локализованной на мембране ЭР, SCA1 - soybean Ca²⁺-ATPasa, на ПМ) КаМ-связывающий домен находится не на С-конце, а на N-терминале. У растений, как и у животных, КаМ-зависимые Са²⁺-АТФазы эндоплазматического ретикулума могут быть ведущими в регуляции и поддержании осцилляций и волны [Са²⁺]цит.

Са²⁺-КаМ комплекс может включаться в каскадную передачу Са²⁺-сигнала, взаимодействуя с киназами, относящимися к группе кальций/кальмодулин зависимых протеин-киназ (Са²⁺-КаМ ПК) (рис. 6.56, 5а). Эти ПК имеют не четыре, как Са²⁺-завПК и КаМ, а три «EF руки» на регуляторном домене. Са²⁺-КаМ связывается на сайте автоингибиторного домена, вследствие чего, как предполагают, происходит активирование Са²⁺/КаМ протеин-киназы. Са²⁺/КаМ ПК могут выполнять специальные функции в каскадной передаче сигнала, что обусловлено их субстратной специфичностью, субклеточной локализацией и чувствительностью к кальцию, которые не совпадают с подобными характеристиками у Са²⁺-завПК. Кроме того, параллельно с митоген-активиуемыми протеин-киназами (МАПК), Са²⁺/КаМ ПК регулируют экспрессию гена, фосфорилируя фактор транскрипции при получении Са²⁺ сигнала (рис. 6.56, 5в).

Действие ПКаз может быть нейтрализовано или обращено ПФФазами. По существу, именно баланс фосфорилирования-дефосфорилирования белков регулирует многочисленные реакции и процессы в клетке и включен в систему передачи сигналов. ПФФазы (как и ПКазы) делятся на две большие группы по субстратной специфичности аминокислот (серин/треонин либо тирозин) в сайте, где связывается и отщепляется фосфатная группа. В группу сер/тре ПФФ входит четыре семейства, среди которых ПФФазы 2 В являются Са²⁺-КаМ зависимыми. Сведений о ПФФазах значительно меньше, чем о ПКазах. Установлено, что они не только контрагенты киназ, но выполняют ведущую роль во многих сигнальных каскадах: при передаче сигнала от АБК на ионные каналы в замыкающих клетках устьиц, при стрессовых ответах на патогены, при регуляции роста корневого волоска, при свето- и гравиотропизмах и т.д..

Наиболее изученной Са²⁺-КаМ ПФФазой животных является кальцийнейрин. В клетках Arabidopsis taliana также обнаружена ПФФаза, подобная кальцийнейрину (КН), которая взаимодействует с Са²⁺-КаМ и активируется при возникновении Са²⁺-сигнала. КН – гетеродимер, состоящий из консервативной каталитической субъединицы А типа (объединена с одной из класса вариабельных субъединиц) и регуляторной субъединицы В типа (КНВ, где В – буква латинского алфавита). В корнях и стебле арабидопсис присутствует 6 изоформ КНВ и синтез одной из них активировался при действии засухи, холода, ветра. Наличие изоформ у КНВ и КаМ значительно увеличивает число возможных комбинаций их совместного регулирования активности кальцийнейрина (КН), расширяя спектр специфичности ответов.

Функция КНВ может быть связана с прикреплением фермента к цитоскелету или мембране, что, определит место в пространстве, где будет проявляться дефосфорилирующая активность. КН, как предполагают, может стать одним из компонентов трансдукона – большого комплекса разнообразных белков плазмалеммы, включенных в каскад стимул-ответ. Например, трансдуксон может быть системой поддержания и регуляции тургора и объединять: рецепторы, вторичные мессенжеры, К⁺- и Са²⁺- и анионные каналы, Са²⁺-ПКазу и КН, Са²⁺-АТФазу и КаМ, если помпа активирована. Подобный трансдукон может быть включен в разнообразные двигательные реакции растений (устьичные движения, тропизмы, настии и т.д.). Возможно, КН является составной частью механизма контроля ионных потоков из среды в корни.

С реакцией дефосфорилирования может быть связана еще одна важная функция - декодирования информации, зашифрованной в виде пиков и осцилляций кальциевого сигнала. Модель дешифровки этой информации предполагает совместное функционирование ПКаз и ПФФаз, имеющих разную кинетику Са²⁺-зависимой активации.

Итак, передача Са²⁺-сигнала на белки-мишени может происходить разными путями с участием первичных сенсоров (Са²⁺ ПКазы, КаМ) либо по более длинным каскадным путям (рис. 6.56). При этом через КаМ, ПК и ПФФ, имеющих множество изоформ, осуществляется специфическое кодирование Са²⁺-сигнала и передача информации к нужному белку-эффектору (мишени). Часто белками-мишенями становятся Са²⁺-каналы, Са²⁺-АТФазы и другие ионные каналы и помпы. Мишенями для сигналов, передаваемых по различным Са²⁺-зависимым сигнальным путям, могут быть отдельные ферментные системы, цитоскелетные белки, белки факторов транскрипции и др. (рис. 6.56).

Ответные реакции, связанные с Са²⁺ сигнализацией, делили на быстрые, происходящие на пост-трансляционном уровне, и медленные, связанные с экспрессией генома. В настоящее время быстрый и медленный ответы рассматриваются как разные стадии одного общего процесса адаптивной модификации метаболизма. Са²⁺ сигнализация, связанная с экспрессией генома, часто сочетается с гормональной регуляцией процессов, что добавляет еще больше сложности в расшифровку сети путей передачи сигнала по сетиразных сигнальных путей в клетке.