Лабораторная работа № 3

получение биомассы дрожжей Культивированием

На пшеничных отрубях

Для производства микробных белковых препаратов в качестве источника углерода могут быть использованы крахмалосодержащие вещества, например, отходы сельскохозяйственных, зерноперерабатывающих производств, в том числе отруби, мука и зерно злаковых культур после помола.

В процессе приготовления субстрата его подвергают ферментативному и/или химическому гидролизу преобразуя его в сусло (раствор, содержащий моносахара и олигосахариды), на котором в дальнейшем будет выращиваться микробная культура. Гидролиз проводится или только одним из методов или чаще всего для получения более высокого содержания сахаров (до 1,5-1,8% РВ) включает оба.

Для осуществления ферментативного гидролиза применяют амилолитические ферментные препараты, используемый при температуре 60-70^оС и низком рН (3-4) (например, амилосубтилин). Затем осуществляется подготовка и стерилизация питательной среды. Или же получение гидролизатов отрубей осуществляется в процессе приготовления и стерилизации питательной среды. Длительность цикла стерилизации (с охлаждением) составляет до 6 ч.

Дрожжевые грибы Endomicopsis fibuliger в отличие от дрожжевых грибов Saccaromyces cerevisiae характеризуются образованием субстратного мицелия при росте на углеводсодержащих средах и относятся к активным продуцентам амилолитических ферментов. Это свойство может быть использовано для получения микробной дрожжевой биомассы как источника белка или белкового продукта при росте на крахмалосодержащих субстратах, как, например, пшеничные отруби.

В случае совместного (смешанного) культивирования дрожжей-сахаромицетов и микроорганизмов-продуцентов амилаз, которые при росте на углеводсодержащих субстратах сами продуцируют комплекс амилолитических ферментов, возможно получение биомассы микроорганизмов без использования препаратов амилаз.

Цель работы: Изучение процесса накопления микробной биомассы смешанной культуры дрожжевых грибов методом периодического глубинного культивирования на основе пшеничных отрубей.

Подготовка посевного материала

Для получения инокулята дрожжей Saccaromyces cerevisiae готовят твердую питательную среду (сусло 6 ^оБ+ 1,5% агара) и пересевают смывом с 1-4 косячков культуры на качалочные колбы объемом 250 мл с 50 мл жидкой питательной среды состава, г/л: сахароза –10; (NH₄)₂SO₄ – 2,08; (NH₄)₂HPO₄ – 1,47; KCl – 0,93; дрожжевой автолизат – 0,2 (на колбу 1 косячок культуры).

Для получения инокулята дрожжевого гриба Endomicopsis fibuliger готовят твердую питательную среду (сусло 6 ^оБ+ 1,5% агара) и пересевают переносом мицеллия гриба вместе с кусочками агаризованной среды с 1-4 косячков на качалочные колбы объемом 250 мл с 50 мл жидкой питательной среды состава (г/л): крахмал растворимый – 10-15; К₂НРО₄- 1500; NН₄Сl – 1000; МgSO₄ ^. 7H₂O –450; FeSO₄^. 6H₂O – 36; ZnSO^. 6H₂O – 18; CuSO^. 5H₂O – 7,5; MnSO^. 5H₂O – 1; CoCl^. 6H₂O – 1; CaCl^. 2H₂O – 10. (на колбу 1 косячок культуры).

Т

Показатели	Характеристика
Цвет	Красно-желтый с сероватым оттенком
Запах	Не затхлый, не плесневелый, без каких-либо посторонних запахов
Вкус	Без горьковатого или кислого вкуса
Влажность, %	Не более 13%
Не допускается	зараженного вредителями ; с содержанием металлопримесей, кроме частиц определенного размера (не более частиц до 20 мм  5,0; 0,5-2 мм – 1,5)
Содержание крахмала, %	20,0-26,0 ( в пересчете на сухие отруби)

аблица 1 – Характеристика пшеничных отрубей

Подготовка питательной среды

Отруби пшеничные – 1-3,5% в составе питательной среды ( рН 3,5-4,0) для выращивания сахаромицетов, предварительно гидролизуют в условиях стерилизации в автоклаве при температуре 137-142^оС в течение 30 мин в колбах и после охлаждения (без фильтрации) переносят в лабораторный ферментер.

Проведение периодического культивирования дрожжей в лабораторном ферментере

Процесс смешанного культивирования дрожжей Saccaromyces cerevisiaeи и дрожжеподобного гриба Endomicopsis fibuliger осуществляют в лабораторном ферментере (рабочий объем 3 л), оснащенном барботером (подача воздуха с помощью микрокомпрессора), встроенным змеевиком, позволяющим поддерживать оптимальную температуру культивирования.

Для культивирования смешанной культуры в рабочую ферментационную среду с гидролизатом отрубей вносят посевные материалы дрожжей Saccaromyces cerevisiae и дрожжевого гриба Endomicopsis fibuliger в приблизительно равных соотношениях.

Оптимальное значение рН поддерживают в пределах 3,5-5,0, подтитровывая питательную среду с помощью раствора аммиачной воды. В качестве пеногасителя используют производные жирных кислот.

Оптимальная температура культивирования 28-30 ⁰С, концентрация растворенного кислорода – не менее 2 мг/л.

Посевной материал составляет 5-10% от объема питательной среды.

Выращивание дрожжей проводят в условиях интенсивной аэрации на жидкой среде следующего состава (г/л), которая представлена в таблице 2.

Содержание этанола поддерживают на уровне 0,1-0,2%.

Таблица 2 – Состав питательной среды для выращивания дрожжей

Компоненты среды, г/ л	Варианты
	I	II	Ш
1 Отруби пшеничные,	1,0-1,5	2,0-2,5	3,0-3,5
2 Аммоний фосфорнокислый однозамещенный (в пересчете на Р2О5 4,7%)	1,47	1,47	1,47
3 (в пересчете на аммонийный азот 3,2%): Аммоний сернокислый Карбамид (мочевина)	1,88 -	- 1,6	0,9 0,7
4 Калий хлористый (в пересчете на К)	0,93	0,93	0,93
5 Дрожжевой автолизат	0,1-0,2	0,1-0,2	0,1-0,2

Все минеральные компоненты питательной среды задают в начале культивирования перед подачей засевных дрожжей. Дополнительный контроль за осахариванием можно производить с помощью йодного индикатора (раствор Люголя).

Во время ферментации контролируют основные параметры процесса, отбирая пробы каждые 1-2 ч, которые заносят в таблицу 2. Общее время лабораторной ферментации составляет 8-12 ч. Для анализа накопления биомассы дрожжей, содержания РВ, рН пробы отбирать каждый час, для других видов анализа – 1 раз в 2 ч.Концентрацию редуцирующих веществ (РВ) определяют по методу Шомодьи-Нельсона, используя для контроля РВ метод Бертрана 1-2 раза. Для оценки содержания сухих веществ измеряют плотность культуральной среды с помощью ареометра. Концентрацию биомассы оценивают весовым методом с использованием мембранных фильтров.

Таблица 3 – Контроль параметров культивирования на лабораторном ферментере

Время отбора проб, ч	Концентрация биомассы		Количество	Контроль параметров Культивирования (концентрация, мг/л)
	ОД600	Х, мг АСВ в л	клеток в мл		рН	Кислород растворен.	РВ (глюкоза)	Азот аммонийный	Фосфа-ты
0-….12

На основании полученных данных делают вывод об эффективности процесса (выход биомассы, удельная скорость роста культуры, коэффициент использования субстрата, продуктивность). По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют декантацией от биомассы дрожжей и последующей сепарацией. Полученную биомассу дрожжей собирают в холодильник для выделения ферментов и анализа на фруктофуранидазную и амилолитическую активности.