Лабораторная работа № 2 получение биомассы дрожжей Культивированием на мелассной барде

Мелассная барда может служить основой питательной среды для выращивания биомассы дрожжевых организмов в качестве дешевого источника незаменимых аминокислот и витаминов в составе получаемого белкового препарата.

Поскольку состав мелассная барда обеднен источниками азота и фосфора в результате спиртового культивирования дрожжей на мелассе, необходимым условием является внесение усваиваемых форм азота и фосфора в виде солей и минеральных кислот.

Для обеспечения в дрожжах фосфора в пересчете на Р₂О₅ на уровне 3,0 – 3,5% и аммонийного азота 7,0-8,0% (в расчете на сухое вещество), а также с учетом некоторого остатка в культуральной жидкости необходимо внести (г/л барды): диаммонийфосфата 1,0-1,2 ( или ортофосфорной кислоты – 0,9-1,2); суперфосфата (18%-ного) 2,8-3,0%; сульфата аммония 2,0-2,5 %.

Динамика потребления питательных веществ барды зависит от начальной концентрации в ней сухих веществ. При использовании неразбавленной барды (8-9 % сухих веществ) до 82-85 % сухих веществ (СВ) остаются неутилизированными, а при разбавлении барды даже в 2 раза до 75% СВ остаются неиспользованными.

В качестве продуцентов белковой массы используются дрожжевые организмы Сandida guillermondii, Rhodotorula utilis, интенсивно потребляющие карбоновые (уксусную, молочную, янтарную, гликолевую) кислоты.

Подготовка посевного материала

Для получения инокулята дрожжей Rhodotorula utilis готовят твердую питательную среду (сусло 6 ^оБ+ 1,5% агара) и пересевают смывом с 1-2 косячков культуры на качалочные колбы объемом 250 мл с 50 мл жидкой питательной среды состава (г/л): барда 10 –30 (или уксуснокислый натрий – 5,0-8,0 ); (NH₄)₂SO₄ – 2,0; (NH₄)₂HPO₄ – 1,8; KCl – 0,5; дрожжевой автолизат – 0,1 (на колбу 1 косячок культуры).

Среду стерилизуют при 0,5 ати и после охлаждения до температуры культивирования засевают суспензией клеток со скошенного агара (1 пробирка на колбу). Для посевного материала культуры выращивают на качалке (150-180 об/мин) в колбах на 250 мл с объемом среды 50 мл при 30-33 ^оС.

Время выращивания инокулята составляет 18-24 ч. Затем производят засев лабораторного ферментера полученным инокулятом. Количество инокулята составляет ~ 2-5 % от объема питательной среды.

Подготовка мелассной ( послеспиртовой) барды

После отделения мертвых клеток спиртовых дрожжей Saccaromyces cerevisiae и шлама фильтрацией, мелассную барду в зависимости от состава разбавляют, подкисляют до рН 4,0-4,5, добавляют питательные соли и используются для выращивания дрожжевых организмов Rhodotorula utilis.

Таблица 1 – Характеристика мелассной барды

Показатели/компоненты	Содержание, %
1 Сухие вещества	8,0 – 9,0
2 Органические сухие вещества	6,0 –7,0
3 Редуцирующие вещества	0,2 –0,3
4 Карбоновые кислоты	1,0 – 1,6
5 Глицерин	0,5 – 0,7
6 Азот общий	0,3 – 0,5

Проведение периодического культивирования дрожжей в лабораторном ферментере

Процесс культивирования дрожжей Rhodotorula utilis осуществляют в лабораторном ферментере (рабочий объем 3 л), оснащенным барботером (подача воздуха с помощью микрокомпрессора), встроенным змеевиком, позволяющем поддерживать оптимальную температуру культивирования.

Контроль рН осуществляют с помощью рН-метра, подтитровывая питательную среду с помощью раствора серной кислоты до рН 4.5-5,0. Оптимальная температура культивирования 28-30^оС, концентрация растворенного кислорода – не менее 2 мг/л.

Содержание сухих веществ определяют ареометром, РВ – методом Шомодьи-Нельсона, карбоновые кислоты – по общей титруемой кислотности.Результаты микробиологического контроля состояния дрожжевой культуры Rhodotorula utilis заносят в таблицу 2. Контроль за состоянием клеток (подсчет растущих, почкующихся, мертвых клеток и др.) производят в камере Горяева (увеличение х40) с использованием светлопольного микроскопа.

Выращивание дрожжей проводят в условиях интенсивной аэрации на жидкой среде следующего состава (г/л), которая представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Состав питательной среды для выращивания дрожжей Rhodotorula utilis

Компоненты среды (г/ л)	Варианты
	I	II	Ш
1 Мелассная барда (в пересчете на РВ не более 0,1-0,2%)	100	200	300
2 Диаммоний фосфат (в пересчете на Р2О5 4,7%)	1,2	1,2	1,2
3 Азот в виде солей - Сульфат аммония - Карбамид (мочевина)	0,9 0,7	0,9 0,7	0,9 0,7
4 Калий хлористый	0,5	0,5	0,5
5 Дрожжевой автолизат	0,1	0,1	0,1

В качестве пеногасителя используют производные жирных кислот.

Во время ферментации контролируют основные параметры процесса, отбирая пробы каждые 1-2 ч, которые заносят в таблицу 2. Общее время лабораторной ферментации составляет 8-12 ч.

Для анализа накопления биомассы дрожжей, содержания РВ, рН пробы отбирать каждый час, для других видов анализа – 1 раз в 2 ч.

Таблица 3 – Контроль параметров культивирования на лабораторном ферментере

Время отбора проб, ч	Концентрация биомассы		рН	Контроль параметров (концентрация, мг/л)
	Х, ОД600 мг АСВ в л	клеток в мл		Кислород растворен.	РВ	сухие вещества	Азот аммонийный	Фосфа- ты
0-….12

На основании расчета удельной скорости роста в течение 1-2 ч культивирования рассчитать потребность в субстрате (в пересчете на мелассную барду) для осуществления лабораторного культивирования в режиме его дробного внесения и составить график внесения барды с учетом разбавления в культуральной среде (таблица 4)

Таблица 4 – Контроль и режим дозирования субстрата

Время культивирования, ч	Внесение субстрата (мелассной барды)			Текущая концентрация РВ, г/л
	объем питательной среды с бардой, мл	Концентрация РВ, г/л	Содержание сухих веществ

По окончании культивирования культуральную жидкость отделяют декантацией или сепарацией от биомассы дрожжей. Полученную биомассу дрожжей взвешивают с учетом влажности, и на основании полученных данных делают вывод об эффективности процесса (выход биомассы, коэффициент использования субстрата, продуктивность). В полученной биомассе определяют содержание белка по Къельдалю.

Указания к работе. Соли азота следует вносить в питательную среду лишь в количествах, необходимых для прироста биомассы дрожжей, поскольку азот используется дрожжами наравне с углеродом для синтеза белка. Такая подача азотсодержащих солей способствует оптимизации удельной скорости роста, наибольшему усвоению субстрата и нормализации pH среды.

С учетом этого фактора необходимо до начала культивирования по лабораторному культивированию определить химический состав мелассной (послеспиртовой) барды и оценить содержание остаточного азота, фосфора, карбоновых кислот, РВ и сухие вещества барды.