Содержание работы

Объект и методы исследования.

Исследование выполнено на базе отделения микрохирургии глаза и лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой по экогенетике НИЦ ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России.

Обследованы 114 детей (228 глаз): 72 девочки и 42 мальчика в возрасте 4-16 лет, у которых были собраны анамнестические данные, наследственный анамнез на наличие миопии у членов семьи первой и второй степеней родства.

В числе этих детей выделена группа из 84 пациентов (168 глаз), которым в дополнение к перечисленным методам обследования выполнено молекулярно-генетическое исследование: 58 девочек и 26 мальчиков 4-16 лет: 19 – с осевой миопией высокой, 44 – средней, 7 – слабой степени и 14 – с эмметропией.

Из исследования были исключены дети с гиперметропией, анизометропией, астигматизмом, а также пациенты, страдающие другой патологией органа зрения любого генеза.

Офтальмологическое обследование включало визометрию без коррекции и с оптимальной коррекцией по таблицам Сивцева или Орловой (с оптотипами в виде детских картинок), авторефрактометрию («Tomey TR-4000», Япония) и скиаскопию до и после циклоплегии (трехкратных инстилляций 1%- раствора циклопентолата гидрохлорида), бинокулометрию с помощью цветотеста (ЦТ-1) с расстояния 5м, аппланационную тонометрию по Маклакову, кинетическую периметрию с помощью настольного периметра с использованием порогового тестового объекта, эхобиометрию («Visante OCT», Германия) в режиме А-сканирования в координатах время-амплитуда, при которой оценивали длину переднезадней оси глазного яблока (ПЗО), глубину передней камеры (ПК), толщину хрусталика (ТХ) и глубину стекловидной камеры (ГСК) глаза. Последнее значение рассчитывали по формуле: ГСК = ПЗО-ПК-ТХ (мм).

Молекулярно-генетическое исследование включало тестирование полиморфизма G-1997T и SpI гена COL1A1, полиморфизма A-3731G, BsmI и TaqI гена VDR, полиморфизма G-75A и С+83Т гена APOA1. Полиморфизм G-1997T и SpI гена COL1A1, A-3731G и TaqI гена VDR определяли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с помощью набора реагентов «ОстеоГЕН-М» (ООО «ГЕН», Россия). Полиморфизм BsmI гена VDR - методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Выделения ДНК из лимфоцитов периферической проводили методом N.Blin, D.W.Stafford (1976). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на автоматических термоциклерах «Терцик» («ДНК-технология», Россия) и «T3 Thermocycler» («Biometra», Германия) с использованием термостабильной рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим» Россия; «Синтол» Россия). Определение полиморфного сайта методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) рестриктазами фирм «Сибэнзим» (Россия) и «Fermentas» (Литва).

Для выполнения ПЦР использовали праймеры: F5’CAACCAAgACTACAAgTACCgCgTCagTgA3 и R5’AACCagggggAAgAggTCAaggg3’ (ЗАО «Синтол», Россия). Рестрикцию проводили с помощью эндонуклеазы PctI («Сибензим», Россия). Электрофоретическое разделение рестрикционных фрагментов осуществляли в 2% агарозном геле [Pani M. et al., 2000]. Полиморфизм G-75A и C+83T гена APOA1 определяли методом ПДРФ. Для ПЦР были выбраны следующие праймеры: F 5' Agg gAC AgA gCT gAT CCT TgA ACT CTT AAg 3' и R 5' TTA ggg gAC ACC TAg CCC TCA ggA AgA gCA 3' (ЗАО «Синтол», Россия). Рестрикцию проводили с помощью рестриктазы MspI («Сибэнзим», Россия) в течение 16 часов. После рестрикции фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 10% полиакриламидном геле [Heng С. et al., 2001].

Статистический анализ выполнен с использованием методов математической статистики, реализованных в пакетах Statistics ver.6.0. и SPSS ver. 13.0. Для анализа были использованы данные исследования и правого, и левого глаза каждого ребенка, при этом величины исследованных показателей между правым и левым глазом детей не достоверно не различались. Для анализа номинальных переменных - данных о частотах генотипов и аллелей по исследованным генам, использовали тест Хи-квадрат, точный критерий Фишера и критерий отношения рисков (ОР), или отношения преобладания, в зависимости от контекста [Флетчер Р. и др., 1998]. Для проверки гипотез относительно различия в подгруппах центральных параметров распределений (средних, медиан и других) непрерывных величин - эхобиометрических параметров глазного яблока, были использованы непараметрические методы: критерий Манна-Уитни и Крускала–Уоллиса. Для определения корреляции между количественными показателями использовали метод корреляции по Спирману.

Для комплексной оценки полученных данных и выявления маркеров миопии использован многофакторный анализ, с помощью которого построены модели межгрупповых различий, позволяющие выявить наиболее «весомые», информативные показатели, определяющие эти различия.

Результаты исследований и их обсуждение.

Результаты визометрии обследованных представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика остроты зрения обследованных детей

Клиническая рефракция	Пол	Число		Острота зрения без коррекции	Максимальная коррекция	Острота зрения с коррекцией
		детей	Глаз
Миопия слабой степени	М	8	16	0.4 ± 0.05	1.75 ± 0.25	1.0 ± .0
	Ж	13	26	0.45 ± 0.06	2.05 ± 0.37	0.89 ± 0.03
Миопия средней степени	М	15	30	0.12 ± 0.02	4.42 ± 0.29	0.79 ± 0.05
	Ж	32	66	0.2 ± 0.01	4.28 ± 0.38	0.81 ± 0.03
Миопия высокой степени	М	5	10	0.06 ± 0.02	8.35 ± 0.68	0.76 ± 0.04
	Ж	14	28	0.08 ± 0.01	8.16 ± 0.70	0.79 ± 0.04
Эмметропия	М	15	30	0.86 ± 0.01	-	1.0 ± .0
	Ж	11	22	0.92 ± 0.02	-	1.0 ± .0

Установлено, что некорригированная острота зрения детей с миопией находится в обратной зависимости от степени тяжести миопии. На фоне максимальной оптической коррекции во всех сравниваемых группах (за исключением детей с миопией высокой степени) зафиксирована полная острота зрения. Не выявлено статистически значимых различий между группами обследованных мальчиков и девочек со сходной клинической рефракцией (p > 0.05).

Результаты ультразвукового обследования сравниваемых групп детей с миопией представлены в таблице 2.

Таблица 2

Некоторые эхобиометрические параметры глазного яблока обследованных детей

Клиническая рефракция	Число глаз	Длина ПЗО, мм	Глубина ПК, мм	Толщина хрусталика, мм	Глубина СК, мм
Миопия слабой степени	14	24,46 ± 0,19	3,47 ± 0,15	3,47 ± 0,04	17,64±0,31
Миопия средней степени	90	24,85 ± 0,08*	3,71 ± 0,04*	3,41 ± 0,03	17,76±0,12
Миопия высокой степени	38	25,93 ± 0,12*	3,53 ± 0,09	3,62 ± 0,05*	18,62±0,19*
Эмметропия (контроль)	14	23,82 ± 0,17	3,38 ± 0,07	3,38 ± 0,11	17,16±0,2

*/ Различия по сравнению с контрольной группой статистически значимы: p<0,001.

У всех детей с осевой миопией зафиксированы значения длины переднезаднего отрезка глазного яблока, пропорциональные степени миопии. При этом они различались при сравнении соответствующих величин в группах обследованных с миопией высокой степени и эмметропией (p<0,001), а также с миопией средней степени и эмметропией (р<0,001). Также статистически значимые различия были выявлены при сравнении соответствующих величин в группах детей с миопией высокой и слабой степени (p<0,001). Значения глубины передней камеры в сравниваемых группах были пропорциональны степени миопии. В частности, выявлены статистически значимые между величинами рассматриваемого показателя у детей с миопией средней степени и в контрольной группе (р<0,001), а также у детей с миопией высокой степени (р=0,002).

Толщина хрусталика оказалась максимальной у детей с миопией высокой степени, достоверно превышая соответствующие показатели во всех сравниваемых группах (р<0,001). По величинам данного параметра группы обследованных с миопией средней, слабой степени и эмметропией не различались.

При сравнении глубины стекловидной камеры, в зависимости от выраженности миопии, обнаружены значимые различия соответствующих величин у детей с миопией высокой степени и эмметропией (p<0,001), а также с миопией средней степени и эмметропией (р=0,036). Также значимые различия выявлены между группами детей с миопией высокой и средней степени (p<0,001). В целом, максимальные значения исследованных эхобиометрических показателей (переднезадний размер глазного яблока, глубина стекловидной камеры и толщина хрусталика) обнаружены у детей с миопией высокой степени.

Установлена положительная корреляция (разной силы) переднезаднего размера глазного яблока и глубины передней камеры во всех исследованных группах: r=0,699; p=0,020 – с миопией высокой; r=0,351; p=0,031 – средней степени и r=0,539; р=0,015 – эмметропией и миопией слабой степени. Аналогичная зависимость обнаружена между длиной ПЗО и глубиной стекловидной камеры: r=0,834; p<0,001 – при миопии высокой; r=0,920; p<0,001 – средней степени и r=0,580; р=0,013 – при эмметропии и миопии слабой степени. Таким образом, глубина передней и стекловидной камер коррелирует с длиной переднезаднего отрезка глазного яблока у детей с миопией всех степеней.