30. Процесс репликации. Полуконсервативный механизм репликации днк. Репликативная вилка. Репликон. Ферменты репликации. Этапы репликации.
Процесс удвоения молекулы ДНК, или самовоспроизведения, называется репликацией. Созданная Уотсоном-Криком модель двойной спирали ДНК заложила основу в понимании возможности копирования генетического материала. Во-первых, соединяются две полинуклеотидные цепи только водородными связями. Во-вторых, из специфичности спаривания азотистых оснований вытекает, что каждая цепь может служить матрицей для синтеза комплементарной цепи. Было выяснено, что механизм репликации является полуконсервативным: каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной консервативной цепи, полученной от родительской спирали, и одной синтезированной цепи. Процесс репликации начинается с того, что инициирующие белки связываются с молекулой ДНК. «Расплетаются» ее комплементарные связи, разрывая водородные связи между основаниями нуклеотидов цепи ДНК. Единство всех водородных мостов делает двойную спираль ДНК очень стабильной, но каждый отдельный «водородный мост» сам по себе слаб. В местах «начала репликации» обнаруживаются пары А-Т, так как они образуют только две водородные связи и быстрее отделяются друг от друга. Благодаря репликации потомство имеет стабильную генетическую информацию о развитии, функционировании и поведении.
Процесс репликации ДНК идет с участием большого количества белков. Точка начала репликации у прокариот называется «oris». Известно, что в этих местах находятся высококонсервативные последовательности, расположенные тандемами. Эти последовательности узнаются ферментами репликации. С этой точки новая ДНК образуется с одинаковой скоростью в обоих направлениях до тех пор, пока ДНК не станет полностью удвоенной.
Репликация у эукариот начинается в нескольких точках. Эти точки называются ARS(Autonomously Replicating Sequence). В хромосомах эукариот существует большое количество ARS. Структура, у которой происходит репликация, получила название репликационной вилки. Репликационная вилка движется последовательно по ДНК от ее стартовой точки. По ходу процесса соседние репликационные вилки сливаются. Иногда насчитывают сотни репликонов, репликация идет в обоих направлениях от каждого репликона до слияния с соседним репликоном и полного удвоения ДНК. Синтез ДНК происходит в периоде инфтерфазы клеточного цикла.
По ходу процесса соседние репликоны могут сливаться, а когда вилка достигает конца молекулы образуется характерная промежуточная У-образная конфигурация. Когда репликация заканчивается, из одной линейной родительской молекулы образуются двойные дочерние, каждая из которых, так же, как и родительская представляет двойную спираль.
Ведущим ферментом репликации является ДНК- полимераза. У прокариот E.coli в настоящее время известны 5 типов ДНК-полимеразы. В разных комбинациях они отвечают за репарацию и репликацию. У эукариот известны семь типов ДНК-полимераз. В разных комбинация эти семь ДНК-полимераз отвечают за репликацию и репарацию в ядре, митохондриях, пластидах. После расплетания и разделения родительских цепей синтез дочерних цепей осуществляется ДНК-полимеразой, использующей в качетсве субстрата дезоксирибонуклеозидтрифосфаты(дАТФ, дТТФ, дЦТФ). Цепи ДНК антипараллельны, т.е. в области репликативной вилки присутствуют 3’ и 5’- концы синтезируемых цепей. Поскольку ДНК-полимераза способна наращивать полинуклеотидные цепи только в направлении 5’ - 3’, то из двух растущих цепей ДНК лишь одна может синтезироваться непрерывно. Синтез другой цепи ДНК, идущей в направлении 5’-3’, осуществляется короткими одноцепочечными фрагментами длиной около 1000-2000нм у прокариот и 100- 200 нм – у эукариот. Они получили название фрагментов Оказаки. Синтез каждого из этих фрагментов, кА же, как ведущей цепочки ДНК, начинается с РНК- затравки, или праймера. Ведущая цепь нуждается только в одном акте инициации, а для синтеза отстающей цепи должно произойти несколько актов инициации. На стадии инициации репликации фермент РНК - праймаза синтезирует короткую РНК- затравку. Синтез затравки необходим,так как фермент ДНК-полимераза модет работать толко пр наличии свободного 3’-OH конца, присоединяя к нему нуклеотиды. Тогда как РНК-полимераза работает в отстутствие 3’-OH группы на одноцепочечной молекуле ДНК. Фермент праймаза отличается от РНК- полимераз, синтезирующих разнообразные РНК-клетки. После того как будет синтезировани РНК-праймер, подключается ДНК-полимераза и продолжает наращивать цепь. РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После реализации своей функции для инициации репликации они удаляются за счет проявления 5’-3’ – эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы. После удаления РНК-затравки и ее заполнения на фрагменте ДНК, инициация синтеза которого происходила на следующей РНК-затравке, расположенной ближе к области репликативной вилки, между двумя синтезированными фрагментами ДНК остается разрыв. Этот разрыв устраняется при участии фрагмента- ДНК-лигазы, - направляющей образование фосфодиэфирной связи.
Синтез ведущей и отстающей цепей происходит по мере движения репликативной вилки вдоль двойной спирали, и образования двух матричных цепей ДНК происходит при участии трех разных типов белков и сопровождается значительными энергетическими затратами.
Для того чтобы двойная спираль ДНК раскрылась, необходимы сосбые белки- ДНК-хеликазы.
ДНК-хеликазы «садятся» на ДНК с помощью специальных инициаторных белков, связывающихся с точками начала репликации, раскручивают двойную спираль, разрывая водородные связи между основаниями, используя энергию гидролиза АТФ. Белок хеликаза, осуществляет собственно расплетание спирали, энергия необходимая для этого поставляется за счет гидролиза.
Белок второго типа (SSB) – дестабилизирующий спираль белок специфически связывается с одноцепочечной ДНК, не позволяя ей сомкнуться. При этом они не закрывают оснований ДНК. Расплетение спирали родительской ДНК без вращения приводит к образованию дополнительных витков, или узлов, на учатсках ДНК впереди репликативной вилки.
Белок третьего типа, топоизомераща, способствует ослаблению на сверхскрученных участках ДНК, внося одноцепочечные разрывы фосфодиэфирных связей и раскручивая узлы в области родительской двойной спирали перед репликативной вилкой. После раскручивания и снятия напряжения, связанного с обласьбю дополнительных витков спирали, топоизомераза вновь замыкает разорванные фосфодиэфирные связи и восстанавливает целостность родительской ДНК. Таким образом, синтез ДНК является полунепрерывным процессом.
11 t+ — доминантный аллель гена.