- •В ведение
- •Глава 1 гели для электрофореза полиакриламидныи гель (пааг) Исходные материалы
- •Процесс полимеризации пааг
- •Выбор концентраций мономеров
- •Агароза
- •Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная пааг
- •Глава 2 техника приготовления гелей и аппаратура
- •Вертикально расположенные трубки
- •Вертикально расположенные пластины
- •Горизонтально расположенные пластины
- •Глава 3 электрофорез белков
- •Замечания общего характера Миграция белков в геле
- •Напряженность электрического поля (н)
- •Выбор буфера рабочего геля
- •Выделение тепла при электрофорезе
- •Загрузка геля. Ширина белковых зон
- •Введение мочевины и -меркаптоэтанола. Некоторые артефакты
- •Лидирующие красители
- •Разделение белков по размерам и заряду
- •Выбор рабочего буфера
- •Использование мочевины
- •Загрузка геля и подготовка препарата
- •Некоторые примеры
- •Фракционирование гистонов и других щелочных белков.
- •Разделение белков по размеру с использованием ддс-Na Существо метода
- •Выбор пористости геля
- •Присутствие мочевины и неионных детергентов
- •Выбор рабочего буфера геля
- •Подготовка белкового препарата
- •Проведение электрофореза
- •Окрашивание и элюция белков
- •Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis)
- •Градиент пористости пааг
- •Двумерный электрофорез в пааг
- •Электрофорез с использованием тритона х-100 и цетавлона Тритон х-100
- •Цетавлон
- •Окрашивание белков в пааг
- •Кислые красители
- •Другие красители и методы окрашивания
- •Флюоресцентные красители
- •Локализация ферментов после электрофореза
- •Локализация белковых полос осаждением ддс-Na
- •Элюция белков из геля
- •Определение радиоактивности белков после электрофореза в пааг
- •Счет радиоактивности в элюатах белка
- •Растворение пааг
- •Импрегнирование сцинтиллятора в гель
- •Авторадиография
- •Флюорография
- •Препаративныи электрофорез белков
- •Оглавление
- •Глава 1
- •Глава 2
- •Глава 3
- •Глава 4
- •Глава 1 . Основные понятия теории седиментации ............ 175
- •Глава 2 Ультрацентрифуга ..................... 177
- •Глава 3 Роторы и пробирки .................... 182
- •Глава 4 Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199
- •Глава 5
Оглавление
Часть первая ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Введение .................. 3
Глава 1
Гели для электрофореза .................. 7
Полиакриламидный гель (ПААГ) ................ 7
Исходные материалы ................... 7
Процесс полимеризации ПААГ ............... 10
Выбор концентраций мономеров .............. 13
Агароза ......................... 16
Смешанный гель (агароза+ПААГ) .............. 20
Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная ПААГ ....... 21
Глава 2
Техника приготовления гелей и аппаратура ........... 21
Вертикально расположенные трубки ....-..........: 21
Вертикально расположенные пластины .............. 26
Горизонтально расположенные пластины ............ 32
Глава 3
Электрофорез белков .................... 37
Замечания общего характера .................. 37
Миграция белков в геле ................. 37
Напряженность электрического поля (H) ......... 38
Выбор буфера рабочего геля ............... 40
Выделение тепла при электрофорезе ............ 42
Загрузка геля. Ширина белковых зон ............ 44
Введение мочевины и (З-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты . 46
Лидирующие красители ................. 47
Разделение белков по размерам и заряду ............ 48
Выбор рабочего буфера ................. 48
Использование мочевины ................. 50
Загрузка геля и подготовка препарата ..;......... 52
Некоторые примеры ................... 53
Разделение белков по размеру с использованием ДДС-Na ..... 56
Существо метода ..................... 56
Выбор пористости геля .................. 59
283
Присутствие мочевины и нейояных детергентов ........ 60
Выбор рабочего буфера геля ............... 61
Подготовка белкового препарата .............. 6в
Проведение электрофореза .........;...... 63
Окрашивание и элюция белков .............. 64
Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis) ......... 66
Градиент пористости ПААГ .................. 73
Двумерный электрофорез в ПААГ ................ 76
Электрофорез с использованием Тритона Х-100 в цетавлона .... 83
Тритон Х-100 ..................... S3
Цетавлон ................. 85
Окрашивание белков в ПААГ ................ 88
Кислые красители ................... 90
Другие красители и методы окрашивания .......... 94
Флюоресцентные красители ................ 97
Локализация ферментов после электрофореза ......... 101
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na . .... . . 104
Элюция белков из геля ............. 105
Определение радиоактивности белков после электрофореза в ПААГ . 109
Счет радиоактивности в элюатах белка ........... 109
Растворение ПААГ .................... 110
Импрегнирование сцинтиллятора в гель ........... 111
Авторадиография .................... 112
Флюорография ..................... 113
Препаративный электрофорез белков .............. 116
Глава 4
Электрофорез нуклеиновых кислот………………………………………………………... 120
Замечания общего характера………………………………………………………………….. 120
Выбор буфера геля и напряженности электрического поля……………………………..120
Выбор характера геля и его пористости…………………………………………………. 121
Влияние вторичной структуры…………………………………………………………… 123
Маркерные молекулы……………………………………………………………………... 125
Лидирующие красители…………………………………………………………………… 126
Электрофорез в мягких условиях……………………………………………………………... 126
Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК…………………………………………126
Фракционирование РНК…………………………………………………………………... 128
Электрофорез в денатурирующих гелях……………………………………………………… 128
Щелочные гели…………………………………………………………………………….. 129
Гели, содержащие мочевину. Секвенирование ДНК и РНК……………………………..131
Денатурирующие гели с формамидом…………………………………………………… 135
Денатурирующие гели с формальдегидом………………………………………………. 138
Гели, содержащие гидроокись метилртути……………………………………………… 140
Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем………………………………………….. 142
Использование градиентов пористости ПААГ………………………………………………. 142
Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов………………………….. 144
Некоторые особые случаи электрофореза нуклеиновых кислот……………………………. 147
Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК—РНК-поли-
мераза—РНК………………………………………………………………………………... 147
284
Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы 148 Использование жидкого (не сшитого) ПААГ……………………………………………….149
Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза ...... 150
Элюция нуклеиновых кислот из гелей ............. 153
Элюция из ПААГ за счет диффузии ............ 153
Элюция из гелей агарозы ................ 154
Электрофоретическая элюция ............... 158
Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры
и диазобумагу ..................... 162
Определение радиоактивности ................ 165
Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот ........ 166
Литература ....................... 168
Часть вторая УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Введение ......................... 174