Окрашивание и элюция белков

Эти вопросы рассмотрены ниже в специальных параграфах, но все же имеет смысл несколько замечаний, связанных с ис- пользованием ДДС-Na, сделать именно здесь

После электрофореза в присутствии ДДС-Na гель окрашива- ют, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ R-250 (см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% мета- нола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и добавкой ионообменника AG 501  8 для связывания красителя. Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Од- нако следует иметь в виду, что ДДС-Na является эффективным детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и фиксации белков. Для малых белков фиксация при окрашива- нии может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать пред- варительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло- те (ТХУ). ДДС-Na, находясь в комплексе с белком, еще и пре- пятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания. 10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Na. Еще лучше это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Na, по- этому его целесообразно включить в фиксирующий белки рас- твор.

Можно окрашивать белки в геле, вымачивая его прямо в 0,05%-ном растворе СВВ R-250 в 10%-ной ТХУ. Краситель до-

64

вольно плохо растворим в ТХУ, поэтому происходит его распре- деление между жидкой фазой и белками в пользу последних. Белковые полосы проявляются очень быстро, и гель можно от красителя не отмывать. Однако чувствительность окраски не- сколько снижена по сравнению со стандартной процедурой. Ни- же будут оценены возможности повышения ее чувствительности с помощью таких флюоресцентных красителей, как данзилхло- рид, флюоресцамин, ортофталевый альдегид и др. Здесь умест- но отметить, что их присоединение к белкам исходного препара- та не влияет на электрофоретическую подвижность этих белков.

Белок из неокрашенного геля можно извлекать одним из под- робно рассмотренных ниже способов, в частности повторной элюцией из кусочков геля встряхиванием в течение 6 — 12 ч при 37° с четырехкратным объемом 0,01 М бикарбоната аммония с 0,1% ДДС-Na. Объединенные элюаты лиофилизируют, удаляя бикарбонат, и растворяют в воде до 0,1 исходного объема. За- тем для удаления ДДС-Na добавляют 9 объемов (по отношению к воде) ацетона, лучше подкисленного, так как в нем хорошо растворяется ДДС-Na. Белок осаждают центрифугированием и промывают 90%-ным ацетоном. В случае необходимости более полного освобождения белков от ДДС-Na лиофилизированный, как указано выше, элюат из геля растворяют снова в 0,1 объе- ма, но не воды, а 0,05 М раствора бикарбоната аммония с 6 М мочевиной (для предотвращения неспецифической сорбции бел- ка на смоле). Раствор пропускают через микроколонку с Do- wex 1  2 (200 — 400 МЕШ), уравновешенную тем же буфером. Мочевину затем удаляют диализом.

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na сейчас в подав- ляющем большинстве случаев ведут в системе, предложенной Лэммли [Laemmli, 1970]. В этой системе обработка белка ДДС-Na совмещена с использованием описанной ниже схемы ступенчатого электрофореза. Такое усложнение не кажется всегда оправданным, поскольку достаточно хорошее сужение исходной белковой полосы можно получить просто за счет раз- бавления буфера, в котором вносится препарат. Больший инте- рес, по-видимому, представляет сочетание обработки белка ДДС-Na с использованием градиента пористости геля. Этот при- ем будет рассмотрен ниже.

Электрофорез белков в комплексе с ДДС-Na был успешно использован для фракционирования белков хроматина без их предварительной очистки. Хроматин диализовали в течение 12 ч против 0,01 М Na-фосфата с 1% ДДС-Na и 1% -меркаптоэта- нола при комнатной температуре, а затем еще 12 ч — против свежей порции такого же раствора при 37°. Только после этого его прогревали в течение 3 мин при 100° и диализовали еще 2 раза по 12 ч против того же буфера, но содержащего вдесяте- ро меньше ДДС-Na и (-меркаптоэтанола. При такой обработке ДНК отделяется от белка и не мешает протеканию последующе- го электрофореза белков хроматина [Elgin, 1975].

65