- •В ведение
- •Глава 1 гели для электрофореза полиакриламидныи гель (пааг) Исходные материалы
- •Процесс полимеризации пааг
- •Выбор концентраций мономеров
- •Агароза
- •Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная пааг
- •Глава 2 техника приготовления гелей и аппаратура
- •Вертикально расположенные трубки
- •Вертикально расположенные пластины
- •Горизонтально расположенные пластины
- •Глава 3 электрофорез белков
- •Замечания общего характера Миграция белков в геле
- •Напряженность электрического поля (н)
- •Выбор буфера рабочего геля
- •Выделение тепла при электрофорезе
- •Загрузка геля. Ширина белковых зон
- •Введение мочевины и -меркаптоэтанола. Некоторые артефакты
- •Лидирующие красители
- •Разделение белков по размерам и заряду
- •Выбор рабочего буфера
- •Использование мочевины
- •Загрузка геля и подготовка препарата
- •Некоторые примеры
- •Фракционирование гистонов и других щелочных белков.
- •Разделение белков по размеру с использованием ддс-Na Существо метода
- •Выбор пористости геля
- •Присутствие мочевины и неионных детергентов
- •Выбор рабочего буфера геля
- •Подготовка белкового препарата
- •Проведение электрофореза
- •Окрашивание и элюция белков
- •Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis)
- •Градиент пористости пааг
- •Двумерный электрофорез в пааг
- •Электрофорез с использованием тритона х-100 и цетавлона Тритон х-100
- •Цетавлон
- •Окрашивание белков в пааг
- •Кислые красители
- •Другие красители и методы окрашивания
- •Флюоресцентные красители
- •Локализация ферментов после электрофореза
- •Локализация белковых полос осаждением ддс-Na
- •Элюция белков из геля
- •Определение радиоактивности белков после электрофореза в пааг
- •Счет радиоактивности в элюатах белка
- •Растворение пааг
- •Импрегнирование сцинтиллятора в гель
- •Авторадиография
- •Флюорография
- •Препаративныи электрофорез белков
- •Оглавление
- •Глава 1
- •Глава 2
- •Глава 3
- •Глава 4
- •Глава 1 . Основные понятия теории седиментации ............ 175
- •Глава 2 Ультрацентрифуга ..................... 177
- •Глава 3 Роторы и пробирки .................... 182
- •Глава 4 Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199
- •Глава 5
Проведение электрофореза
Что касается режима электрофореза, т. е. выбора рабочего напряжения, силы тока и продолжительности разделения, то здесь остаются в силе все те соображения, которые были приве- дены в предыдущем разделе. Вкладом ДДС-Na в электропро- водность рабочего буфера можно при этом пренебречь. Электро- форез не следует вести на холоду, так как это может повлечь за собой выпадение ДДС-Na в осадок (его растворимость очень сильно зависит от температуры). При длительном электрофоре- зе электродные буферы следует обновлять.
Для белков с молекулярной массой менее 12000 определение ее электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na становится ненадежным даже при высокой концентрации геля. В этом случае локальные различия в составе и заряде белков, влияющие на их взаимо- действие с ДДС-Na, уже не усредняются. Степень надежности определения молекулярной массы малых белков и олигопепти- дов увеличивается, как было указано, при введении в буфер 8 М мочевины, а также при увеличении степени сшивки геля. В 12,5%-ном ПААГ с 0,1% ДДС-Na в присутствии 8 М мочеви- ны при электрофорезе малых (данзилированных) олигопептидов с диапазоном М от 1 до 12 тыс. дальтон наблюдалась хорошая линейная зависимость lg M от Rf [Kato et al., 1975], однако точки для инсулина (М=5782) и глюкагона (M = 3483) из графика этой зависимости выпадали.
Разделение улучшается в случае малых исходных количеств белка (1 — 5 мкг) и длинных гелей с расстоянием миграции око- ло 15 см. При определении молекулярной массы неизвестного белка лучше начать подбор условий с 7,5%-ного ПААГ и соот- ветствующего набора стандартных маркеров. Затем следует поварьировать условия — и, в частности, сопоставить значения молекулярной массы исследуемого белка, получающиеся в ге- лях с различным содержанием акриламида.
В цитированной выше работе Вебера и др. приведен список около 40 стабильных белков, которые можно использовать в ка-
63
честве стандартных маркеров в интервале М 12 — 200 тыс. даль- тон. Однако молекулярные массы продажных белков, особенно при М > 70 тыс., далеко не всегда надежно известны, поэтому фирма BDH при разработке своих стандартных наборов марке- ров пошла по другому пути. Она готовит каждый из наборов на основе только одного белка с хорошо известным значением М, сшивая его в димеры, тримеры и далее вплоть до гексамеров обработкой глутаровым альдегидом. Аналогичный подход в свое время был описан и в лабораторной практике [Inouye, 1971]. Кстати, автор цитируемой работы проводил одновременно и дан- зилирование своих маркерных белков, что позволяло ему фик- сировать их положение при УФ-освещении без окраски геля.
При определении молекулярной массы коллагена использо- вание глобулярных белков в качестве маркеров возможно в том случае, если строить график зависимости от расстояния мигра- ции. не самой молекулярной массы белка, а длины его полипеп- тидной цепи (логарифма числа аминокислотных остатков). Ско- рость миграции зависит именно от размера молекулы белка — переход к молекулярной массе предполагает некое среднее ее значение, приходящееся на один остаток. Между тем, в состав коллагенов входит необычно много легких аминокислот: глици- на, аланина, пролина [Noelken et al., 1981].