1.3. Сопряженные плоскости при освещении по Кёлеру

В процессе установки освещения по Кёлеру вы могли заметить серию плоскостей, содержащих изображения нити лампы или самого препарата. Еще одна плоскость может быть обнаружена, если поместить кусочек бумаги под прямым углом к окуляру в нескольких миллиметрах от глазной линзы. На бумаге будет виден маленький (около 3 мм) светлый кружочек-диск Рамсдена. Именно в этой точке следует расположить зрачок глаза, чтобы весь свет, проходящий через диск Рамсдена, попадал в него. Если убрать бумагу, то с помощью увеличительного стекла в диске можно увидеть изображения нити лампы, апертурной диафрагмы и з. ф. п. объектива.

Для того чтобы успешно работать с микроскопом, используя все способы наблюдения, необходимо разобраться в системе сопряженных плоскостей. При освещении по Кёлеру существуют два ряда сопряженных плоскостей, расположенных перпендикулярно главной оптической оси микроскопа. Плоскости именуются в соответствии с их положением на пути лучей (см. рис. 1.1). Плоскости называются сопряженными, если изображение, имеющееся на предыдущей, повторяется на последующей. Так, например, плоскость, содержащая нить лампы (или источник света), сопряжена с плоскостью конденсорной диафрагмы, определяющей апертуру конденсора. Последняя плоскость сопряжена с плоскостью, в которой располагается задний фокус объектива, и наконец с плоскостью, в которой расположен диск Рамсдена. Таким образом, все неоднородности яркости, например нити лампы, будут видны в плоскости диафрагмы конденсора, а также в з. ф. п. объектива и на диске Рамсдена. В процессе фокусировки изображение нити лампы точно фокусируется на диафрагме конденсора. В свою очередь фокусировка конденсора на образце непременно приводит к тому, что передняя апертура конденсора оказывается сопряженной с з. ф. п. объектива.

Аналогичным образом имеются серии сопряженных плоскостей, среди которых находится плоскость образца. Предельно близко к источнику света находится плоскость полевой диафрагмы. Изображение диафрагмы фокусируется при помощи конденсора на препарате, поэтому эти плоскости сопряжены. Обе они видны резко в плоскости первичного изображения и на сетчатке глаза. Следовательно, они также сопряжены. При фотомикрографии фотоэмульсионный слой должен находиться в плоскости, относящейся к этой серии сопряженных плоскостей. На рис. 1.1 и в табл. 1.1 две серии сопряженных плоскостей обозначены А и Б.

Практическое значение этих двух отдельных серий состоит в том, что дефекты в источнике света не появляются в плоскости изображения и поэтому не воспринимаются глазом и не фиксируются на пленке. На первых порах достаточно просто запомнить серии плоскостей и разобраться с их приблизительным местонахождением в микроскопе, так как эти термины могут использоваться для краткой записи и интерпретации результатов. Разберитесь в рис. 1.1, который можно относительно просто воспроизвести, если вы запомните следующие моменты:

1.Свет, проходящий через фокус с одной стороны линзы, выходит с другой ее стороны параллельно оси линзы.

2.Луч света, входящий в линзу параллельно ее главной оси, проходит через фокус с другой стороны линзы.

3.Лучи, проходящие, например, через образец, пересекутся с другой стороны объектива. В месте их пересечения будет находиться изображение.

Измерительные сетки размещены обычно в плоскости первичного изображения, но могут быть расположены в плоскости полевой диафрагмы. Их использование будет обсуждаться в гл. 7.

2. Взаимодействия света с веществом и использование их в световой микроскопии

Все виды взаимодействий света с веществом могут быть разделены на семь категорий: преломление, отражение, поглощение, пропускание, флуоресценция, поляризация и дифракция.

2.1. Преломление

Преломление есть изменение скорости света, когда он входит в среду. Так, свет движется медленнее в стекле, чем в воздухе, и отношение двух скоростей, а более точно, отношение скорости света в вакууме к его скорости в стекле есть число, которое называется коэффициентом преломления (п) стекла.

Во всех системах линз микроскопов свойство преломления стекла используется для фокусировки света и корректировки аберраций в линзах, а также для того, чтобы передать увеличенное изображение препарата в глаз. Коэффициент преломления зависит от длины волны света (Я). Он возрастает с уменьшением длины волны (синий свет) и убывает с увеличением длины волны (красный свет). Это различие в зависимости от длины волны света имеет большое значение. Белый свет, проходя через линзу, сфокусируется в серии фокусов, в соответствии с длинами волн составляющих цветов, причем синие лучи окажутся ближе к линзе (для них фокусное расстояние короче), чем красные (их фокусное расстояние длиннее). Расстояние между этими фокусами есть величина хроматической аберрации линзы. Распределение коэффициентов преломления-света в зависимости от длины волны называется дисперсией к является характеристикой материала линзы. Стекла с различной дисперсией используются для коррекции аберраций в системах линз. Явление дисперсии можно использовать для исследования некоторых образцов — например для выявления в препарате волокон асбеста.

7

Угол, под которым луч света преломляется в веществе, зависит от угла падения. Так, луч света, падающий на стекло перпендикулярно его поверхности, не преломляется, в то время как луч, падающий под острым углом, отклоняется от своего направления в плоскости, перпендикулярной поверхности стекла (называемой нормалью). В случае линзы такой луч пройдет через фокус на другой стороне линзы. Различие в фокусных расстояниях для лучей, проходящих вблизи оси линзы и вблизи ее краев, есть величина сферической аберрации линзы. Линза для объектива выбирается таким образом, чтобы она имела минимальную хроматическую и минимальную сферическую аберрации.

Рис. 1.2. Покровное стекло, преломление света и числовая апертура А. В левой части нет покровного стекла. Краевой луч идет под углом (а); NA=sin α. В правой части есть покровное стекло; лучи преломляются на границе стекло— воздух. Б. Слева — граница раздела стекло — воздух для сухого объектива. Справа — граница раздела стекло — масло для гомогенной иммерсии, при которой NA гораздо больше, чем в случае сухого объектива. В. Пунктирная линия указывает на видимое положение краевых лучей, идущих из препарата при двух различных по толщине покровных стеклах. Следует отметить, что препарат, заключенный в заливочную среду, может влиять на эффективность конуса света, попадающего на него из конденсора.

Угол, под которым свет падает на стекло, важен для объяснения концепции критического угла. Если свет падает под слишком острым углом, то он полностью отражается и не входит в стекло, а свет, выходящий из стекла в воздух, может в этих условиях отразиться внутрь и остаться в стекле (рис. 1.2, Л). Обе эти возможности могут реализоваться, когда свет собирается от препарата объективом и при освещении препарата через конденсор. В некоторых случаях конус света может быть полностью использован только в том случае, когда с целью избежать влияния границы раздела стекло — воздух используют иммерсионное масло, имеющее тот же показатель преломления, что и стекло (рис. 1.2, Б). Так, например, иммерсионное масло иногда необходимо наносить между фронтальной поверхностью линзы конденсора и нижней поверхностью предметного стекла, но более часто масляную иммерсию используют для объективов. Для некоторых линз применяются другие иммерсионные жидкости, например вода в случае флуоресцентных или интерференционных объективов.

2.1.1. Числовая апертура

На рис. 1.2 изображен угол между крайними лучами пучка света, входящего в линзу объектива. Половина этого угла обозначена как а. Величина данного угла, как можно видеть, зависит от расстояния между линзой и препаратом и от размера линзы. Эти соотношения обычно объединяют и выражают как sin a.

На рис. 1.2, Л справа пространство между линзой и образцом заполнено воздухом (n = 1). Таким образом, sin a есть числовая апертура (NA) объектива. Для сухих систем величина NA ограничена критическим углом конуса световых лучей, выходящего из покровного стекла препарата. Как правило, ее величина для сухих систем не превосходит 0,95. Если между объективом и препаратом находится иммерсионное масло, за счет чего система, через которую проходит свет, становится гомогенной, то может быть использован значительно более широкий пучок света (рис. 1.2, Б). Величина светособирающей способности системы обозначается попрежнему как NA, но теперь она представляет собой произведение показателя преломления иммерсионной среды на sin a. В современных объективах максимальная величина NA обычно составляет 1,3. Конденсоры также имеют определенную величину NA, которая служит характеристикой максимального угла для пучка света, выходящего из верхней линзы конденсора на препарат. Конденсоры с большой NA дают широкий пучок света.

Большая числовая апертура, отсутствие сферической и хроматической аберраций и плоское поле зрения — вот цели, к которым стремятся изготовители объективов. Эти свойства определяют в основном стоимость последних. Сухие объективы с большой числовой апертурой весьма тщательно исправлены от аберраций, и для работы с ними требуются покровные стекла строго определенной толщины. Разъяснения к этому представлены на рис, 1.2,5. Для слишком толстых покровных стекол объектив будет недоисправлен, а для слишком тонких — переисправлен. Некоторые объективы имеют коррекционную оправу для установки на различную толщину покровного стекла, но другие требуют строго определенной толщины его, в соответствии со своей NA и увеличением. Дальнейшие подробности будут рассмотрены в разд. 5.2.3 гл. 3.

Для того чтобы определить возможности вашего микроскопа, проведите проверку, предлагаемую в табл. 1.2.

8