микроскопии стал использоваться фикоэритрин — белок, выделенный из красных водорослей. В настоящее время лишь небольшое число стандартных лабораторных микроскопов оборудуется светофильтрами, рассчитанными на это вещество. (Более подробная информация о применяемых светофильтрах приведена в гл. 6.)

Таблица 4.6. Мечение иммуноглобулинов флуоресцеином

1.Растворить 10 мг IgG в 2 мл 0,5 М карбонатно-бикарбонатного буфера, рН 9,5.

2.Добавить 10 мг флуоресцеинизотиоцианата, адсорбированного на Celite (Sigma), и механически встряхивать в течение 4 часов при комнатной температуре.

3.Удалить Celite при помощи центрифугирования.

4.Пропустить супернатант через маленькую (7 мм в диаметре, 150 мм длиной) колонку с Sephadex G25 (Pharmacia), уравновешенную 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,8). Собрать фракции в пустую посуду.

5.Трижды провести диализ против фосфатного буфера (2 литра, рН 7,8) в течение по крайней мере 48 часов.

6.Измерить оптическую плотность при 280 и 495 нм.

7.Вычислить соотношение флуоресцеина и белка.

8.Хранить при 4 °С.

Преимуществом использования метода флуоресцентных меток является его быстрота. Результат можно получить сразу после того, как препарат был проинкубирован с мечеными антителами и заключен под покровное стекло. К недостаткам метода относится прежде всего необходимость использования специального оборудования, а также то, что исследователю приходится работать буквально в темноте. Кроме того, при помощи данного метода не выявляются архитектура ткани и морфология клеток. Хотя раньше в иммуногистохимии использовались антитела, меченные флуоресцеином, в настоящее время эта техника вытесняется методами с использованием ферментов, за исключением тех случаев, когда необходимо на одном и том же срезе выявить два различных антигена.

4.2. Ферментные метки

Когда в качестве метки используются ферменты, то визуализация обусловлена образованием в ходе реакции нерастворимых окрашенных продуктов. Идеальная ферментная метка должна иметь низкий молекулярный вес (для того, чтобы легко связываться с Ig) и высокую скорость оборота ферментативного цикла (для большего выхода продуктов реакции). Этот фермент должен отсутствовать в нормальной ткани и давать продукты реакции, нерастворимые в воде, этаноле и ксилоле (чтобы покровное стекло можно было смонтировать так, как требуется по методике).

4.2.1. Пероксидаза хрена

Пероксидаза хрена была первым ферментом, использованным в качестве метки, она остается популярной и в настоящее время. Пероксидаза хрена удовлетворяет всем перечисленным выше условиям за исключением того, что этот фермент обнаруживается в нормальной ткани, в частности в гранулоцитах, эритроцитах и клетках миелоидного ряда. Обычно необходимо блокировать активность эндогенного фермента ткани. Субстратом является перекись водорода, а продукт реакции вызывает окисление хромогена. В качестве последнего чаще всего используется ДАВ, который образует коричневый осадок (преципитат) в месте реакции. Преимуществом данного красителя во всех случаях является его устойчивость. Необходимо следить за тем, чтобы не спутать продукт реакции с эндогенным пигментом коричневого цвета.

4.2.2. Щелочная фосфатаза

Субстратом для этого фермента обычно является нафтол-фосфат в сочетании с солью диазония. Фосфатаза высвобождает нафтол, который, соединяясь с солью диазония, образует преципитат. При связывании его с быстрым красным образуется осадок красного цвета, растворимый в спирте и ксилоле, так что для заключения препарата под покровное стекло должна использоваться водорастворимая среда. Щелочная фосфатаза обнаруживается в ряде тканей, включая костный мозг, эндотелий, почку, плаценту и кишечник. Изофермент щелочной фосфатазы, обнаруживаемый в кишечнике, отличается повышенной устойчивостью. Он выдерживает многие воздействия, приводящие к разрушению этого фермента в других местах. Красный цвет хорошо улавливается глазом, и, как мы установили, эта метка особенно удобна, если требуется обнаружить единичные клетки, например микрометастазы в мазках костного мозга [8]. Недостатком метода является постепенное обесцвечивание продуктов реакции в течение нескольких месяцев.

4.2.3. Глюкозооксидаза

Глюкозооксидаза обнаружена в клетках бактерий и отсутствует в тканях млекопитающих. Субстрат реакции окисляется в присутствии соли тетразолия и акцептора водорода — феназин-метасульфата. В результате

77