Методическое пособие биохимия человека

качественные реакции, основанные на цветных реакциях, характерных для той или иной другой группировки, входящей в витамин.

Практическая часть.

1. Качественная реакция на витамин В2.

изоаллоксазиновое ядро

кофермент ФАД

витамин В2 (рибофлавин)

Рибофлавин состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола:

Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов — флавопротеидов в виде коферментов флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флавинаденинмононуклеотида (ФМН). Флавопротеиды активируют реакции дегидрирования, т. е. отщепления протонов и электронов от субстратов. Они участвуют в окислении D-аминокислот, оксикетокислот, НАДН (Н+), в биологическом окислении и др. Биологическое действие флавиновых ферментов связано с наличием в изоаллоксазиновом кольце двойных связей: флавиновый фермент отнимает от окисляемой молекулы два электрона, присоединяя их к азоту по месту двойных связей, и два протона. При недостатке в организме витамина В2 могут возникнуть, например, катаракта (помутнение хрусталика) и другие заболевания.

Принцип метода. Окисленная форма витамина В2 представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витании В2 основана на способности его легко восстанавливаться; при этом раствор витамина В2, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет

51

образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, так как восстановленная форма витамина В2 бесцветна.

Реактивы: хлористоводородная кислота концентрированная; цинк металлический; витамин В2, 0,025% раствор (перед определением раствор можно развести в 5 раз).

Ход работы: В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В2, добавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и опускают зернышко металлического цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается.

2. Качественная реакция на витамин РР.

Витамин РР является производным пиридинового ядра. Антипеллагрической активностью, помимо никотиновой кислоты, обладает и ее амид:

(никотинамиддинуклеотид)

В организме человека и животных витамин РР находится в основном в связанном с белками состоянии. Из витамина РР образуется два кофермента: никотинамидадениндинуклеотид — НАД+ и никотинамидадениндинуклеотидфосфат — НАДФ+. Эти коферменты входят в состав ферментов дегидрогеназ и участвуют во многих окислительно — восстановительных реакциях. НАД+ и НАДФ+ присоединяют к себе протоны и электроны от окисляемых субстратов; при этом в их молекулах восстанавливается остаток ниацина. Отсутствие витамина РР в пище вызывает пеллагру.

Принцип метода. Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди образует синий осадок медной соли никотиновой кислоты плохо растворимый.

Реактивы: ацетат меди, 5% раствор; витамин РР, 3% раствор в 10% растворе уксусной кислоты.

Ход работы: Перед определением 3% раствор витамина РР следует тщательно взболтать. Затем набирают в пробирку 20 капель его и нагревают до кипения, при этом мутный раствор становится прозрачным. Взболтав 5% раствор ацетата меди, приливают 20 капель его к нагретому раствору витамина РР. Затем содержимое пробирки доводят до кипения и сразу охлаждают ее под струей холодной воды, на дне пробирки выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.

52

3. Качественная реакция на витамин В6.

Группа витамина В6: пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин, являющиеся производными пиридина и носящие общее название пиридоксина, обладают активностью витамина В6:

В организме каждое соединение может подвергнуться фосфорилированию при участии АТФ с образованием коферментов фосфопиридоксаля, фосфопиридоксамина. Эти коферменты входят в состав ферментов, участвующих в белковом обмене в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования аминокислот, десульфирования, дегидратирования аминокислот, в образовании витамина РР из триптофана и в некоторых других реакциях. При

недостатке витамина В6 в питании у животных, прежде всего, нарушается обмен, белков; у человека недостаточность этого витамина встречается редко.

Принцип метода. Витамин В6 при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета.

Реактивы: хлорное железо, 1 % раствор; витамин В6, 1 % раствор.

Ход работы: К 5 каплям 1% раствора витамина В6 приливают равное количество 1% раствора хлорного железа и перемешивают. Развивается красное окрашивание.

4. Качественная реакция на витамин С.

Биологическая роль аскорбиновой кислоты в организме многообразна. Она принимает участие в окислительновосстановительных процессах и связана с системой глютатиона. Аскорбиновая кислота участвует в синтезе стероидных гормонов в коре надпочечников и катехоламинов в мозговом слое надпочечников и необходима для процесса гидроксилирования как кофактор для проявления ферментов гидроксилаз. Она участвует в образовании тетрагидрофолиевой кислоты из фолиевой кислоты, в гидроксилировании лизина в оксилизин, пролина в оксипролин, необходимых для образования коллагеновых волокон; ускоряет всасывание железа, активирует фермент желудочного сока пепсиноген, что особенно важно при недостатке соляной кислоты в желудочном соке.

53

Характерной особенностью витамина С является его способность обратимо окисляться и восстанавливаться, благодаря чему он играет важную роль в процессах, протекающих в организме. При окислении аскорбиновой кислоты образуется дегидроаскорбиновая кислота.

Дегидроаскорбиновая кислота может при наличии подходящих условий вновь восстанавливаться в аскорбиновую кислоту. Если же таких условий нет, то она может окисляться дальше до щавелевой и треоновой кислот.

кислота

Принцип метода. Окисляясь, аскорбиновая кислота легко восстанавливает многие соединения: 2,6-дихлорфенолиннофенол, метиленовую синь, йод, хлорное железо, азотнокислое серебро. Первые три из названных соединений при восстановлении обесцвечиваются, а восстановление хлорного железа в хлористое можно легко обнаружить по реакции с железосинеродистым калием. Реакции аскорбиновой кислоты с 2,6-дихлорфенолиндофенолом и йодом лежат в основе методов количественного определения витамина С.

Реактивы: 2,6-дихлорфенолиндофенол, 0,01% раствор; метиленовая синь, 0,01% раствор; хлорное железо, 1% раствор; раствор Люголя; углекислый натрий, 10% раствор; азотнокислое серебро, 1% раствор; калий железосинеродистый, 2% раствор; аскорбиновая кислота, 0,05%.

Ход работы:

1) В пробирке смешивают по 2 капли раствора 2,6- дихлорфенолиндофенола и аскорбиновой кислоты. Отмечают

54

обесцвечивание 2,6-дихлорфенолимдофенола. Уравнение реакции представлено выше.

2)В пробирку вносят 2 капли раствора аскорбиновой кислоты и раствора Люголя. Отмечают обесцвечивание. Зная, что йод восстанавливается до йодистоводородной кислоты, записывают уравнение реакции.

3)В пробирке к 3 каплям раствора аскорбиновой кислоты добавляют 1 каплю раствора азотнокислого серебра. Выпадает темный осадок металлического серебра. В отличие от углеводов аскорбиновая кислота восстанавливает серебро без добавления щелочи. Записывают уравнение реакции.

4)В пробирке смешивают по 1-2 капли растворов аскорбиновой кислоты и хлорного железа. Добавляют в ту же пробирку 1 каплю раствора железосинеродистого калия и отмечают появление зеленовато-синей окраски. Записывают уравнение реакции: сначала восстановления хлорного железа в хлористое, а затем реакции взаимодействия хлористого железа с железосинеродистым калием. Образующиеся при том соединение синего цвета имеет состав Fe3[Fe

(CN)6]2.

5. Качественная реакция на викасол (жирорастворимые витамины).

Известны два природных витамина — К1 и К2, являющиеся производными нафтохинона. Витамин К1 — филлохинон, желтоватая маслянистая жидкость, К2 представляет собой желтые кристаллы. Витамин К входит в состав простетической группы фермента, участвующего в биосинтезе протромбина. Протромбин — необходимый компонент в процессе свертывания крови. Витамин К содержится в митохондриях и регулирует процессы фосфорилирования. У здорового человека витамин К постоянно синтезируется кишечной микрофлорой. Витамин К — антигеморрагический витамин. Викасол – искусственно синтезированный аналог витамина К1, обладает биологической активностью витамина. Дневная лечебная доза викасола составляет

0,015г.

Принцип метода. Викасол в присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в лимонно-желтый цвет.

Реактивы: викасол; 0,05% раствор; цистеин, 0,025% раствор; едкий натр, 10% раствор.

Ход работы: В пробирку вносят 5 капель раствора викасола, добавляют 5 капель раствора цистеина и 1 каплю 10% раствора едкого натра. Появляется лимонно-желтое окрашивание.

55

ONa

O S

H O

C C

HC H CH3

HC CH

C

H

O

производное викасола

Вопросы для самоконтроля:

1.Что такое витамины и почему они так называются?

2.Как классифицируют витамины?

3.Что такое авитаминозы и гиповитаминоы и каковы причины их возникновения?

4.Какие вы знаете качественные реакции на витамины? Приведите примеры.

5.На чем основаны качественные реакции, проводимые в данной работе?

6.Какова связь между витаминами и ферментами?

56

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 8

ЛИПИДЫ.

Теоретическая часть.

К липидам относят различные по своей химической природе вещества, содержащиеся в живых клетках, не образующие в воде истинных растворов, которые могут быть экстрагированы из клеток при помощи органических растворителей хлороформа, эфира, бензола. В организме животных и растений липиды выполняют несколько различных функций: а) выступают в качестве метаболического топлива; б) служат основной формой, в которой это топливо депонируется; в) являются структурными компонентами клеток; г) выполняют защитную роль.

Существует несколько как простых, так и более сложных классификаций липидов, ниже приведена одна из них.

-жирные кислоты

-нейтральные липиды

-фосфолипиды

а) глицерофосфолипиды б) сфингофосфолипиды

- гликолипиды а) цереброзиды

б) ганглиозиды

-воска

-стероиды

-терпены

-жирорастворимые витамины

-простагландины

Кратко охарактеризуем наиболее важные из приведенных классов липидов.

Жирные кислоты. В биомедицинской тематике существует термин свободные жирные кислоты (СЖК). Содержатся в большинстве клеток в следовых количествах, однако играют важную биологическую роль, выступая в качестве строительных блоков нескольких классов липидов таких как нейтральные липиды, фосфоглицериды, гликолипиды, эфиры холестерина и некоторых восков. Их молекулы представляют собой длинные углеводородные цепи, оканчивающиеся карбоксильной группой. Углеводородная цепь может содержать в своем составе одну или несколько двойных связей. Жирные кислоты, выделенные из клеток высших растений и животных, характеризуются рядом общих свойств. Подавляющее большинство из них содержит четное количество атомов углерода, от 14 до 22; наиболее часто встречаются кислоты, содержащие 16 или 18 атомов углерода. В составе липидов как правило, преобладают ненасыщенные жирные

57

кислоты. Двойная связь в жирных кислотах высших организмов находится, как правило, между 9-м и 10-м углеродным атомом, дополнительные двойные связи находятся между 10-м атомом углерода и метильным концом цепи. Как правило, двойные связи не являются сопряженными и находятся в цис-конфигурации.

Нейтральные липиды или ацилглицеролы. Являются основными запасными питательными веществами, особенно в клетках позвоночных. Представляют собой высококонцентрированные источники метаболической энергии. По химической структуре являются сложными эфирами трехатомного спирта глицерина и жирных кислот. Возможна этерификация глицерина жирными кислотами по одному, двум и трем положениям при этом образуются соответственно моно-, ди-, и триацилглицеролы. Если ацилглицерол этерифицирован одинаковыми остатками жирных кислот, то его относят к простым, если разными, то к сложным. При кипячении с кислотами или основаниями ацилглицеролы подвергаются гидролизу; к такому же результату приводит действие липаз, присутствующих в соке поджелудочной железы (см. ниже).

Фосфолипиды подразделяются на два больших подкласса глицерофосфолипиды и сфингофосфолипиды. В глицерофосфолипидах две гидроксильные группы глицерина этерифицированы остатками жирных кислот, а третье положение - остатком фосфорной кислоты. Простейшим глицерофосфолипидом является фосфатидная кислота. В клетках этот липид содержится в незначительных количествах, однако имеет большое значение в качестве промежуточного продукта синтеза более сложных фосфолипидов. Усложнение молекул фосфолипидов происходит в результате присоединения к молекуле фосфатидной кислоты разнообразных полярных группировок (этаноламин, холин, серин, инозит, глицерин) посредством их взаимодействия с остатком фосфорной кислоты. Это ведет к образованию семейств глицерофосфолипидов: фосфатидилэтаноламины, фосфатидилхолины (лецитин) и др. Молекулы сфингофосфолипидов строятся на основе соединения, называемого церамидом, которое образуется в результате взаимодействия С18 мононенасыщенного аминоспирта сфингозина и какой-либо длинноцепочечной жирной кислоты. В положение С1 сфингозина присоединяется остаток фосфорной кислоты и далее к нему остаток холина. В результате образуется типичный представитель сфингофосфолипидов – сфингомиелин.

Гликолипиды. Наиболее простые гликолипиды представляют собой гликозилдиацилглицерины, присутствующие у растений и микроорганизмов. Другая группа - цереброзиды или гликозилцерамиды - может быть отнесена как сфинголипидам, так и к гликолипидам, поскольку в своем составе содержит одновременно

58

остаток углевода и сфингозин. Цереброзиды являются сравнительно простыми по структуре гликолипидами; в качестве полярной группы чаще всего выступает галактоза, реже глюкоза. Наиболее типичные и широко распространенные представители - моногалактозилцерамид, дигалактозилцерамид.

Еще одна группа гликолипидов - ганглиозиды - напротив, представляет собой наиболее сложные липиды, несущие массивные сахарные головы, состоящие из моносахаридов и остатков сиаловых кислот (также являются производными углеводов; N- ацетилнейраминовая и N-гликоилнейраминовая кислоты представляют собой продукт конденсации маннозамина и пирувата, несущие соответственно остаток ацетата либо глицина). Название ганглиозидов связано с тем, что первоначально они были выделены из ганглиев беспозвоночных. Наиболее распространены в нервной системе, где выполняют ряд специфических функций, в частности, являются компонентами рецепторных комплексов, играют большую роль в электрогенности мембран нейронов.

Стероиды выступают в качестве производных пергидроциклопентанфенантренового ядра, содержащего в своем составе три конденсированных циклогексановых кольца. Важными стероидами являются желчные кислоты, половые гормоны, гормоны коры надпочечников и др. В клетках стероиды присутствуют в основном в небольших количествах за исключением одного класса стероидов – стерины, которыми клетки очень богаты. Стерины содержат спиртовую группу при С3 и разветвленную алифатическую цепь при С17. Существуют они как в свободном виде, так и в виде эфиров, у которых спиртовая группа этерифицирована длинноцепочечной жирной кислотой. Наиболее распространенный стерин животных тканей – холестерин, содержащийся в организме как в свободной таки этерифицированной форме. У растений холестерин не показан, однако, они содержат в своем составе другие стероиды.

Практическая часть.

1. Растворимость и эмульгирование жиров.

Реактивы: подсолнечное масло; хлороформ; вода; едкий калий, 1% раствор; карбонат натрия, 10%раствор; раствор мыла; спирт.

Ход работы: Для определения растворимости жиров берут 6 пробирок, во все наливают по несколько капель подсолнечного масла и приливают по 1-2 мл в каждую одной из следующих жидкостей: хлороформа; воды; 1% раствора едкого калия; карбоната натрия, 10%раствора; мыла и спирта. Тщательно размешивают содержимое пробирок и наблюдают растворение жира и образование устойчивых эмульсий. Результаты опыта и их объяснение записывают.

2. Гидролиз (омыление) жира.

Реактивы: масло; едкий калий, 40% спиртовой раствор; вода.

59

Ход работы: В пробирку наливают около 2 мл масла и добавляют равный объем 40% спиртового раствора калия едкого. Пробирку помещают в кипящую водяную баню и держат там до образования однородного раствора мыла. Результат опыта и уравнение реакции записывают. Далее в пробирку наливают примерно 8-10 мл воды и взбалтывают. Полученный раствор используют для определения составных частей жира.

В клетках гидролиз триацилглицеролов осуществляется по действием ферментов липаз. Активность липазы в жировых клетках находится под эндокринным контролем. Адреналин, норадреналин, глюкагон и адренокортикотропный гормон стимулируют аденилатциклазу жировых клеток. Повышенное содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) приводит далее к стимуляции протеинкиназы, которая активирует липазу путем ее фосфорилирования. Таким образом адреналин, норадреналин, глюкагон и адренокортикотропный гормон активируют липолиз. цАМФ играет роль вторичного посредника в активации липолиза в жировых клетках, которая аналогична его роли в распаде гликогена. В отличие от перечисленных гормонов инсулин ингибирует липолиз.

3. Открытие в гидролизате составных частей жира.

Реактивы: гидролизат масла; серная кислота, 10% раствор; едкий натрий, 10% раствор; сернокислая медь, 2% раствор; глицерин, 5% раствор.

Ход работы:

Открытие жирных кислот. В пробирку наливают часть полученного во втором опыте гидролизата и добавляют равное количество 10% раствора серной кислоты. Пробирку опускают в кипящую банку до образования на поверхности жидкости жирного слоя.

Открытие глицерина. В пробирку наливают примерно 2 мл гидролизата, добавляют 8-10 капель 10% раствора едкого натрия и несколько капель 2% раствора сернокислой меди. Появляется слабое синее окрашивание, вследствие образования глицерата меди. Для сравнения эту же реакцию проводят с 5% раствором глицерин.

Результаты всех реакций и их уравнения записывают.

В клетках глицерол, образованный в результате липолиза, фосфорилируется и восстанавливается до дигидроксиацетонфосфата, который в свою очередь изомеризуется в глицероальдегид-3-фосфат. Последний служит промежуточным продуктом гликолиза и глюконеогенеза. Следовательно, в печени, содержащей соответствующие ферменты, глицерол может превращаться в пируват или глюкозу. Возможен и обратный процесс – восстановление дигидроксиацетонфосфата в глицерол-3-фосфат, который затем гидролизуется фосфатазой с образованием глицерола.

60