Методическое пособие биохимия человека

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ И ФОРМОЛОВОЕ ТИТРОВАНИЕ ПО СЕРЕНСЕНУ.

Теоретическая часть.

Согласно современным представлениям белковые молекулы представляют собой гигантские полипептиды, построенные из нескольких десятков, а иногда и сотен остатков постоянно встречающихся в структуре белка аминокислот.

В нативных белках удается обнаружить очень небольшое количество свободных NH2 - и СООН – групп, так как концевые аминокислоты составляют ничтожную долю огромной полипептидной последовательности белка. Разрушение первичной структуры белковых молекул может быть достигнуто в результате гидролиза - распада сложного вещества на более простые составные части, связанного с присоединением воды по месту разрыва связей.

При гидролизе белков идет постепенное высвобождение NH2 - и СООН – групп в строгом соответствии 1:1, т.е. происходит распад пептидных – СО – NН-связей.

При взаимодействии биурета с растворами щелочи и медного купороса развивается сине-фиолетовое окрашивание (реакция на наличие пептидных связей); все белки дают яркую биуретовую реакцию. Как известно, положительную биуретовую реакцию дают пептиды, содержащие минимум две пептидные связи, т.е. если в результате гидролиза образуются дипептиды, то биуретовая реакция

сэтим гидролизатом будет отрицательная.

Взависимости от применяющегося катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.

Гидролиз, проводимый в лабораторных условиях, является важным методом исследования для расшифровки первичной структуры биополимеров. При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин — частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот.

Об увеличении количества свободных NH2 – и СООН-групп в процессе гидролиза можно судить путем сравнительного определения количества свободных карбоксильных групп методом титрования щелочью в присутствии формалина. В качестве индикатора в данном

21

случае может применяться фенолфталеин, который в щелочной среде дает малиновое окрашивание. Затраченная щелочь реагирует в эквивалентных количествах с карбоксильными группами аминокислот с образованием натриевой соли аминокислоты и воды. Как только количество затраченной щелочи превышает количество свободных карбоксильных групп в гидролизате, раствор приобретает малиновый цвет (титровать необходимо до слабо-розового окрашивания).

Практическая часть.

1. Кислотный гидролиз.

При кислотном гидролизе белки распадаются на высокомолекулярные пептиды, низкомолекулярные пептиды, дипептиды и аминокислоты. Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильником в присутствии хлористоводородной или серной кислоты.

Реактивы: хлористоводородная кислота, концентрированная. Ход работы: Белок от 2-х куриных яиц растворяют в 1 литре

воды, фильтруют через 4 слоя марли. Раствор переносят в большую круглодонную колбу с воздушным холодильником и добавляют 250 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят 45 мин от начала кипения, затем фильтруют.

2. Формоловое титрование.

Служит для определения количества карбоксильных групп, которое увеличивается вследствие разрыва пептидных связей в процессе гидролиза. В водных растворах аминокислоты образуют внутримолекулярные соли, например глицин:

Поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные — группы аминокислот щелочью невозможно.

Принцип метода. В процессе реакции формальдегид блокирует α-аминогруппу. Образующееся метиленовое соединение (метиленаминокислота) оттитровывается щелочью с образованием:

Определяя количество карбоксильных групп титрованием, одновременно можно судить и о содержании аминных групп, так как

22

количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучить действие протеолитических ферментов. При полном гидролизе белка количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестает увеличиваться, и биуретовая реакция становится отрицательной.

Реактивы: раствор яичного белка; гидролизат белка; формалин нейтральный, 20% раствор; фенолфталеин, 0,5% раствор; едкий натр, 0,05 н раствор (готовят из 0,1 н NаОН обязательно ех temporae); едкий натр, 1% и 10%, растворы; уксусная кислота, 1% раствор.

Ход работы:

1. Титрование карбоксильных групп в растворе белка до гидролиза. Отмеривают в колбочку 1мл раствора яичного белка, приливают 5 капель 20% нейтрального раствора формалина и 3 капли 0,5% раствора фенолфталеина. Титруют из микробюретки 0,025н раствором едкого натра до устойчивой бледно-розовой окраски.

2. Титрование карбоксильных групп в гидролизате. Отмеривают в колбочку 1,25мл гидролизата, добавляют 3 капли фенолфталеина и нейтрализуют 10% раствором едкого натра из микробюретки (шприц) до слабо-розовой окраски. Щелочь используется для нейтрализации соляной кислоты, поэтому количество щелочи не учитывается. Если при нейтрализации окраска делается ярко красной, то добавляют до обесцвечивания по каплям 1% раствор уксусной кислоты, избыток которой нейтрализуют 1% раствором едкого натра до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального 20% раствора формалина и обесцвеченный раствор титруют 0,025н раствором NаОН до бледно-розового цвета и точно отмечают количество затраченной щелочи. Производят расчет азота аминогрупп по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности. Нормальному раствору щелочи соответствует 14г азота в одном литре или 14мг в 1мл; 1 мл 0,025н раствора соответствует 0,033 мг азота.

3. Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате при помощи биуретовой реакции. В пробирку наливают 5 капель гидролизата белка и нейтрализуют 10% раствором щелочи. После нейтрализации гидролизата проводят биуретовую реакцию, прибавляя 2 капли CuSO4. Появляется фиолетово-розовое окрашивание. При полном гидролизе белка до аминокислот биуретовая реакция с гидролизатом отрицательная.

Вопросы для самоконтроля:

1.Что такое гидролиз белка, какие виды гидролиза вы знаете?

2.Каково практическое значение гидролиза белков?

3.Чем отличаются полный и неполный гидролиз?

4.Для чего служит метод формолового титрования? На чем он основан?

5.О чем говорит розовое окрашивание гидролизата белка?

23

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ.

Теоретическая часть.

Белки, выделенные из биологических систем, в обязательном порядке отвечают за выполнение какой-то специфической функции в клетке или за ее пределами. Функции некоторых выделенных и очищенных белков до сих пор не установлены, в частности это относится к ряду белков нервной системы. Однако это не означает, что данные молекулы не обладают биологической активностью или «смыслом». По современным представлениям клетка не может позволить себе синтез «бессмысленных» белков, поскольку это чревато большими необоснованными затратами энергии. В свою очередь, биологические свойства белков и полипептидов неотделимы от их пространственной структуры, которая возникает в результате реализации химических и физических свойств входящих в них аминокислот.

Химические свойства белков чрезвычайно разнообразны. Обладая многочисленными боковыми радикалами аминокислот различной химической природы, белковые молекулы способны давать широкий круг реакций. Особо важную роль в обеспечении определенных структурных особенностей белков и ряда их биологических свойств имеют реакции между радикалами аминокислотных остатков в пределах одной и той же молекулы. При этом выявляется особая зависимость третичной структуры от ряда внешних условий: рН среды, концентрации солей в растворе, окислительно-восстановительного режима клетки и др.

К физическим свойствам относят молекулярную массу, двойное лучепреломление, подвижность в электрическом поле. Помимо этого, для белков характерны оптические свойства, заключающиеся в способности вращать плоскость поляризации света (оптическая активность), рассеивать световые лучи ввиду значительных размеров белковых частиц и поглощать ультрафиолетовые лучи. Оптические свойства используют при количественном определении белков, измерении молекулярной массы и т.п. Одним из характерных физических свойств белков является их способность адсорбировать на поверхности молекул низкомолекулярные органические соединения и ионы. Благодаря этому белки выполняют в организме транспортную функцию, также это может быть использовано при их осаждении. Существует большое количество разнообразных реакций осаждения белков. Они делятся на обратимые и необратимые.

Значение реакций осаждения белков в том, что они дают возможность:1) изучить свойства белков, 2) освободить жидкость от присутствия белка, что бывает необходимо при некоторых

24

исследованиях, 3) установить наличие белка, например в моче при различных патологических состояниях. Реакции осаждения белков с помощью различных концентраций сернокислого аммония или других нейтральных солей позволяют разделить отдельные белковые фракции: альбумины и глобулины.

Помимо реакций осаждения существуют и другие методы разделения смесей белковых молекул, в которых широко применяются знания об их физико-химической природе, среди них кратко можно привести следующие.

Метод электрофореза. Основан на способности различных белков перемещаться под действием электрического поля с неодинаковой скоростью в растворе на влажной фильтровальной бумаге или другой твердой опорной среде. Наибольшее применение среди таких сред к настоящему времени нашел полиакриламидный гель. Вследствие предварительной обработки молекулы белка приобретают высокий суммарный отрицательный заряд и движутся в электрическом поле к аноду. Скорость передвижения белковых молекул является функцией электрического заряда, молекулярной массы и формы молекул, ионной силы, рН состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Сочетание перечисленных факторов всегда специфично для каждого индивидуального белка, и естественно, что разные белки обладают различной электрофоретической подвижностью. Полученные электрофореграммы прокрашивают при помощи специфических красителей – кумасси бриллиантовый голубой, нитрат серебра и др.

Метод изоэлектрического фокусирования позволяет фракционировать смеси белковых молекул еще в большей степени, вплоть до выделения индивидуальных белков. Производится путем электрофореза белков в поддерживающих средах с градиентом рН.

Хроматографический метод разделения белковых смесей заключается в пропускании подлежащей фракционированию смеси белков через колонку, заполненную адсорбентом (более подробно смотрите в лабораторной работе «Хроматографический метод разделения аминокислот»).

Практическая часть.

1. Осаждение белков при кипячении.

Принцип метода: Присутствие белков открывается кипячением, поскольку почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах раствор белка при кипячении не коагулирует и может дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-нибудь нейтральной соли (NаС1). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения положительного заряда в случае сильно кислой среды и усиления отрицательного — в щелочной среде.

25

Полное и быстрое осаждение белков происходит при достижении изоэлектрической точки. Изоэлектрической точкой называется такое значение рН, при котором частицы белка не передвигаются в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду, и, следовательно, суммарный электрический заряд их равен нулю. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН около 5), за исключением протаминов и гистонов, имеющих изоэлектрическую точку в щелочной среде (рН около 8). Это объясняется тем, что протамины и гистоны в отличие от других белков содержат избыток диаминомонокарбоновых кислот — аргинина, лизина, гистидина, обуславливающих щелочной характер белка.

Итак, важную роль в свертывании белков при нагревании играет концентрация водородных ионов, т.е. реакция среды, и присутствие солей.

Реактивы: раствор яичного белка; уксусная кислота, 1% раствор; едкий натр, 10% раствор; хлористый натрий, насыщенный раствор.

Ход работы: Эта работа проводиться с целью выяснения значения рН для растворимости белков при нагревании. Сравнивают отношение к нагреванию нейтральных, слабокислых и сильнокислых,

атакже щелочных растворов белка.

В5 пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка (без NаС1). В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипения. Жидкость мутнеет, т.е. наблюдается опалесценция, поскольку разрушаются водные оболочки вокруг белка, и происходит укрупнение взвешенных его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во второй пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют 1каплю 1% раствора уксусной кислоты для слабого подкисления. При стоянии выпадает хлопьевидный осадок белка. Частицы белка теряют заряд, так как приближаются к изоэлектрическому состоянию.

Втретью пробирку добавляют 5 капель 1% раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые частицы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

Вчетвёртую пробирку приливают 5 капель 1% раствора уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок белка, так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами NaС1.

Впятую пробирку добавляют 2 капли 10% раствора едкого натра, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

26

Указания к составлению отчета. Отметить положительный результат осаждения плюсом, а отрицательный — минусом. Записать в таблицу результаты осаждения белков при кипячении в различных средах и указать в каждом случае причины появления или отсутствия осадка белка.

Осаждение белка при кипячении при различных реакциях среды.

2. Реакции осаждения белков при комнатной температуре нейтральными солями — высаливание.

Принцип метода: Метод фракционирования белков солевыми растворами основан на том, что каждый индивидуальный белок разделяемой смесиосаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора по действием соли называют высаливанием. При дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белок и, таким образом, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки. К настоящему времени в соответствующей справочной литературе приведены концентрации солей, при которых в осадок выпадают те или иные белки. Глобулины осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, а альбумины — в насыщенном растворе этой же соли. Высаливание белков является обратимой реакцией, так как осадок белка может вновь растворяться после уменьшения концентрации солей диализом или разведением водой.

При высаливании белок обычно почти не теряет своих естественных свойств, он может, например, вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить фракции при получении гормональных и ферментных препаратов.

Реактивы: раствор яичного белка для высаливания с хлористым натрием (белок 3-х куриных яиц смешивают с 700 мл дистиллированной воды и с 300 мл насыщенного раствора хлористого натрия и фильтруют через несколько слоев марли); хлористый натрий, кристаллический в виде тонко измельченного порошка; сернокислый аммоний, насыщенный раствор; сернокислый аммоний, кристаллический, тонко измельченный порошок; уксусная кислота, 1% раствор; едкий натр, 10% раствор; сернокислая медь, 1% раствор.

Ход работы:

1. Высаливание белков хлористым натрием.

27

В пробирку наливают 20 капель раствора белка и прибавляют тонко измельченного порошка хлористого натрия до полного насыщения раствора. Через несколько минут появляется осадок глобулинов. Содержимое пробирки отфильтровывают. В фильтре остается альбумин. Затем к фильтрату прибавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и кипятят; в слабокислой среде альбумин выпадает в осадок. Через несколько минут альбумин отфильтровывают и проверяют фильтрат на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции.

2. Высаливание белков сернокислым аммонием.

К 15 каплям раствора белка добавляют 15 капель насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сернокислого аммония, в котором выпадает осадок глобулинов. Через 5 минут отфильтровывают содержимое пробирки. В фильтрате остается другой белок – альбумин. К фильтрату добавляют тонко измельченный порошок сернокислого аммония до полного насыщения. Выпадает осадок яичного альбумина. Альбумин отфильтровывают. Проверяют фильтрат на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

Указания к составлению отчета. Отметить положительный результат осаждения белков плюсом, а отрицательный — минусом и результаты работы занести в таблицу.

Осаждение белков высаливанием.

3. Диализ белка.

Принцип метода: Удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей, например, избытка солей после высаливания, является диализ. Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Очистка белков методом диализа состоит в длительном, в течение нескольких суток, пропускании воды через сосуд в который погружен диализный мешок. Его готовят из материалов, хорошо проницаемых для низкомолекулярных соединений и ионов, но не пропускающих относительно крупные молекулы белков. Хорошим материалом для полупроницаемых

28

мембран служит целлофан, размер пор которого можно изменять в широких пределах обработкой раствором ZnCl2.

Реактивы: раствор яичного белка; NaCl, насыщенный раствор; АgNO3; NаОН, 10% раствор; СuSO4, 1% раствор.

Ход работы: В стаканчик на 100 мл наливают 30 мл дистиллированной воды и опускают трубку для диализа, в которую предварительно был налит раствор белка куриного яйца (2мл) и добавлено 3 капли NaCl насыщенного раствора. По истечении 5-10 минут берут воду из стаканчика на анализ: проводят биуретовую реакцию на обнаружение белка и качественную реакцию на присутствие хлоридов с помощью AgNO3.

Примечание: раствор белка в трубке для диализа по уровню должен быть ниже жидкости в стакане.

4. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Принцип метода: К необратимым реакциям осаждения белков помимо реакции осаждения при кипячении, относятся реакции осаждения солями тяжелых металлов. В отличие от высаливания осаждение белков солями тяжелых металлов происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют, образуя с ними соли и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей азотной кислого серебра и хлористой ртути), но нерастворимые в воде.

Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие появления одноименного положительного заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых в воде осадков используется при отравлении солями ртути, меди, свинца и др., пока эти соли еще не успели всосаться. В качестве противоядия применяют белки молока, яиц.

Реактивы: раствор яичного белка для высаливания; сернокислая медь, 1% раствор; уксуснокислый свинец, 5-10% раствор.

Ход работы:

1) Осаждение белков медным купоросом. К 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 1-2 капли 1% раствора сернокислой меди,

29

образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка приливают вначале1-2 капли 1% раствора сернокислой меди, а затем еще 5-10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.

2) Осаждение белков уксуснокислым свинцом. К 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 2 капли; 5% раствора уксуснокислого свинца. Образуется осадок, также не растворимый в воде, но легко растворяющийся в избытке осадителя.

5. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Принцип метода: Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белковых частиц с образованием комплексных солей из белка и кислот. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В осадке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. В связи с этим реакция осаждения белков азотной кислотой особенно распространена при клинических исследованиях мочи (проба Геллера).

Реактивы: раствор яичного белка для высаливания; азотная кислота концентрированная; серная кислота концентрированная.

Ход работы:

1)Осаждение азотной кислотой (проба Геллера). К 5 каплям концентрированной азотной кислоты приливают равный объем раствора белка осторожно по стенкам пробирки, наклонив ее под углом так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты, осадок не растворяется.

2)Осаждение серной кислотой. Проводится аналогично реакции с азотной кислотой. Однако в этом случае осадок растворяется в избытке серной кислоты.

6.Осаждение белков органическими кислотами.

Принцип метода: Органические кислоты также вызывают

необратимое осаждение белков. Большое практическое применение получили трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты, обладающие высокой чувствительностью по отношению к белку. Помимо белков, сульфосалициловая кислота осаждает также продукты их распада высокомолекулярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки. После осаждения белков трихлоруксусная кислота удаляется путем кипячения фильтрата.

Реактивы: раствор яичного белка для высаливания; трихлоруксусная кислота, 10% раствор; сульфосалициловая кислота, 20% раствор.

30