Методическое пособие биохимия человека

Ход работы: К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок белка.

К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

7. Осаждение белков органическими растворителями.

Принцип метода: В органических растворителях, таких как спирт, ацетон, эфир и др., белки не растворяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка требуются различные концентрации спирта. Спирт связывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. Реакция осаждения белка спиртов обратима при кратковременном действии спирта на холоде.

Реактивы: раствор белка для высаливания; этиловый спирт или ацетон; хлористый натрий, насыщенный раствор;

Ход работы: К 5 каплям раствора белка приливают 15-20 капель этилового спирта или ацетона. Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия, при стоянии выпадает белый осадок белка.

8. Осаждение белков алкалоидными реактивами.

Принцип метода: Осаждение белков алкалоидными реактивами также относится к необратимым реакциям. К группе реактивов на алкалоиды принадлежит танин, также пикриновая кислота, железистосинеродистая кислота, фосфорномолибденовые кислоты и др. Способность белков осаждаться теми же реактивами, что и алкалоиды, объясняется наличием как в белках, так и в аналогичных азотистых гетероциклических группировок: пиррольных, индольных, имидазольных и др. механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. В этом соединении белок является катионом, а алкалоидный реактив – анионом. Реакции осаждения проводят в кислой среде, способствующей появлению положительного заряда на мицелле белка.

Танин — это сложный эфир глюкозы и пяти молекул метадигалловой кислоты (пентадигаллоилглюкоза). При полном гидролизе танина выделяются глюкоза и галловые кислоты.

Реактивы: раствор белка для высаливания; танин, насыщенный раствор; уксусная кислота, 1% раствор.

Ход работы: К 5 каплям раствора белка прибавляют 1-2 капли насыщенного раствора танина и 1-2 капли 1% раствора уксусной кислоты. Выпадает осадок белка желтовато-серого цвета.

9. Определение изоэлектрической точки белка.

Принцип метода. При смешивании раствора белка с буферной смесью, рН которой соответствует изоэлектрической точке белка,

31

частицы белка изменяют свой заряд, становятся электронейтральными и, следовательно, неустойчивыми в растворе. Добавление водоотнимающих средств, например, спирта, ацетона, вызывает дегидратацию белковых частиц и способствует выпадению белка в осадок.

Некоторые белки, как, например, казеин, осаждаются в изоэлектрической точке без добавления водоотнимающих веществ.

Реактивы: 0,2 М раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия; 0,1 М раствор лимонной кислоты; 0,2 М раствор уксуснокислого натрия; 0,2 М раствор уксусной кислоты; 1% раствор желатина или яичного альбумина; 0,1 н. раствор уксусной кислоты; 0,4% раствор казеина; этиловый спирт.

Ход работы.

1. Определение изоэлектрической точки яичного альбумина или желатина.

В 6 пробирок наливают 0,2 М раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 М раствор лимонной кислоты или 0,2 М раствор уксуснокислого натрия и 0,2 М раствор уксусной кислоты в количествах, указанных в таблицах. В каждую пробирку к 1 мл заготовленной буферной смеси приливают по 0,5 мл 1% раствора желатина или яичного альбумина, перемешивают и добавляют по 2 мл этилового спирта. Содержимое пробирок вновь перемешивают и оставляют на 5 минут. Через 5 минут отмечают, в какой пробирке и при каком рН произошло наибольшее помутнение раствора. Отсутствие мути отмечают знаком минус (-), наличие и степень мутности - одним или двумя знаками плюс (+).

Вопросы для самоконтроля:

1.Как ведут себя белки в водном растворе и в присутствии избытка кислоты или щелочи?

32

2.Что такое изоэлектрическая точка белка и как её определяют?

3.От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

4.Каковы общие механизмы осаждения белка из растворов? Какими способами можно осадить белок, не вызывая его денатурацию?

5.Что такое высаливание белков?

6.Что такое денатурация белков? Какие денатурирующие белок агенты вам известны?

7.В чем заключается разница между осаждением и денатурацией белка?

8.Каким образом можно разделить альбумины и глобулины?

33

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 5.

СТРОЕНИЕ СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ.

Теоретическая часть.

По физико-химическим свойствам белки классифицируют на простые (протеины) и сложные (протеиды). Простыми называются такие белки, которые при гидролизе дают только аминокислоты. Сложные белки при гидролизе наряду с аминокислотами дают вещества небелковой природы (углеводы, липиды, фосфорную кислоту, нуклеиновые кислоты и др.). Небелковый компонент сложных белков получил название простетической группы. Классификация белков на простые и сложные во многом условна. Простые белки гистоны могут подвергаться посттрансляционным модификациям (фосфорилированию, метилированию, ацетилированию и др.) и переходить в сложные белки. По всей видимости, следует разделять истинные сложные белки, которые ковалентно связаны с небелковой частью либо образуют с ней нековалентные взаимодействия, но в функциональном плане не отделимы от нее. В других случаях комплексы белков и небелковых компонентов образуются в результате неспецифического связывания различных лигандов, что не придает белкам каких-то дополнительных биологических функций и, следовательно, такие белки не могут считаться сложными. Помимо этого, некоторые простые белки, в силу своих биологических функций, могут связывать соединения небелковой природы. Типичным примером может стать специфическая укладка ДНК для придания ей более компактной структуры в виде нуклеосом. Каждая нуклеосома состоит из так называемого нуклеосомного кора, в состав которого входят белки гистоны (простые белки) классов Н2а, Н2b, Н3 и Н4 по 2 штуки каждого. Вокруг образуемой ими структуры сложным образом уложена небольшая часть молекулы ДНК (по некоторым данным порядка 200 нуклеотидных пар). Образованная структура называется нуклеосомой. Нуклеосомы взаимодействуют между собой благодаря наличию гистона класса Н1, который входит в состав хроматина в половинном количестве. Взаимодействие между ДНК и нуклеосомным кором осуществляется благодаря наличию в первичной структуре гистонов большого количества (до 30%) основных диаминомонокрабоновых аминокислот, которые при физиологическом значении рН несут положительный заряд. ДНК, как известно, представляет собой многоосновную кислоту, которая диссоциирована в широком диапазоне рН, и несет вследствие этого значительный суммарный отрицательный заряд. В определенные этапы клеточного цикла путем сложной укладки нуклеосом относительно друг друга образуются видимые в световой микроскоп продолговатые структуры

– хромосомы, которые по своему составу являются

34

нуклеопротеидными комплексами. Следует отметить, что нуклеосомная организация хроматина легко устраняется (это сопровождается отсоединением нуклеосомного кора от ДНК и диссоциацией его на субъединицы) в процессах репликации и транскрипции и затем быстро восстанавливается вновь. При этом в состав вновь образованных нуклеосом могут входить как те же самые, так и другие гистоновые (из других нуклеосом или вновь синтезированные) единицы. Исходя из выше сказанного можно заключить следующее: а) собственно гистоны являются простыми белками б) в силу своих специфических свойств они обладают высоким сродством к ДНК и вероятно большую часть своего функционально активного периода проводят в виде нуклеосом (нуклеопротеидных комплексов) в) гистоны могут существовать вне нуклеосом без потери своих биологических свойств и включаться в них по мере надобности.

Таким образом, необходимо еще раз подчеркнуть, что понятие сложные белки является в известной мере условным и не представляется возможным провести четкую границу между классами простых и сложных белков.

Учитывая характер предлагаемой лабораторной работы, необходимо также рассмотреть состав небелковой части нуклеопротеидов. Нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК – биополимеры с большой относительной молекулярной массой, построенные из большого количества мононуклеотидов, соединенных друг с другом 3- 5-фосфодиэфирной связью.

Структурной единицей нуклеиновых кислот является мононуклеотид, состоящий в свою очередь из пуринового или пиримидинового основания, углевода (D-рибозы или D- дезоксирибозы) и фосфорной кислоты.

Пуриновые основания представлены аденином и гуанином (производные пурина), а пиримидиновые – цитозином, урацилом и тимином (производные пиримидина):

В состав ДНК входит тимин, а в состав РНК вместо тимина – урацил. Помимо этих оснований обнаружены минорные основания, входящие в состав РНК и ДНК.

Примером мононуклеотида является адениловая кислота. Динуклеотид из адениловой и уридиловой кислот, соединенных 3-5- фосфодиэфирной связью, имеет следующее строение:

35

OH OH

мононуклеотид адениловая кислота

В живых организмах обнаружено два типа нуклеиновых кмслот: рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые (ДНК) кислоты. В состав ДНК входят дезоксирибонуклеозидмонофосфаты, а в состав РНК – рибонуклеозидмонофосфаты.

В живой клетке любого организма содержатся три вида рибонуклеиновых кислот: рибосомная (рРНК, 80%), транспортная (тРНК, 15%) и информационная (иРНК, 5%). Нуклеиновые кислоты имеют первичную, вторичную и третичную структуру. Биологическая роль нуклеопротеидов огромна. Они являются структурными компонентами клетки, её ядра и цитоплазмы, а также выполняют определенные специфические функции в живом организме. Деление клеток, передача наследственной информации, биосинтез белков связаны с нуклеопротеидами, с входящими в их состав нуклеиновыми кислотами.

Кратко рассмотрим другие классы белков, которые помимо белковой части содержат в своем составе небелковый компонент.

Хромопротеиды состоят из простого белка и окрашенной простетической группы в виде производных изоаллоксазина, каротина, порфирина и др. Простетическая группа некоторых хромопротеидов содержит металл. Так, гемоглобин, миоглобин, каталаза, пероксидаза и цитохромы содержат железо, гемоцианин – медь, хлорофилл – магний.

36

Фосфопротеиды – сложные белки, состоящие из белкового компонента и одного или нескольких остатков фосфорной кислоты. Последняя соединена эфирной связью с гидроксильными группами гидроксиаминокислот серина и треонина. Важнейшими представителями этой группы белков являются казеиноген молока, вителлин, вителенин, витин яиц и др. Фосфопротеиды принимают активное участие в обменных процессах, особенно в эмбриональных и быстрорастущих тканях. Фосфорилирование белков играет большую роль в регуляции активности ферментов. Активация или ингибирование в данном случае осуществляется за счет действия ферментов группы протеинкиназ, которые, присоединяя к молекулам белков остатки фосфорной кислоты, переводят фермент в активное или неактивное состояние.

Липопротеиды – группа сложных белков, в состав которых входит белковый и липидный (холестерол, фосфатиды, жиры и др.) компоненты. Липопротеиды растворяются в воде и нерастворимы в органических растворителях (эфире, бензоле, хлороформе и др.). Они являются одним из основных компонентов биологических мембран, а также содержатся в свободном состоянии в плазме крови, лимфе, молоке и др. В виде растворимых липопротеидных комплексов в организме транспортируется много биологически активных веществ. Белок-липидные взаимодействия играют большую роль в формировании надмолекулярных структур, выполняющих в клетках важнейшие биологические функции.

Гликопротеиды – обширная группа углеводно-белковых компонентов. Природные гликопротеиды делятся на истинные (нейтральные) и мукопротеиды (кислые). В состав истинных гликопротеидов наряду с белком входят аминоуглеводы. В структуре мукополисахаридов находится слабосвязанный углеводный (аминоуглеводы, остатки гексуроновых кислот и сульфатов) и белковый компоненты. Полипептидные цепи белкового компонента гликопротеидов соединены с углеводным компонентом главным образом через гидроксильные группы гидроксиаминокислот серина и треонина и через карбоксильную группу аспарагиновой кислоты. Гликопротеиды играют важную функциональную роль. Некоторые из них являются антикоагулянтами; гликопротеид пропердин – природный антибиотик; муцины, устойчивые к действию ферментов, выполняют защитную функцию, предохраняя слизистую от расщепления пищеварительными ферментами. Ряд ферментов и пептидных гормонов имеет гликопротеидную природу.

37

Практическая часть.

1. Гидролиз нуклеопротеидов.

Для изучения химического состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей, поскольку они очень богаты нуклеопротеидами. При непродолжительном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты, а при продолжительном гидролизе белки и нуклеиновые кислоты распадаются на основные компоненты, что можно представить в виде схемы:

нуклеопротеиды

белок (протамины или гистоны) нуклеиновые кислоты(полинуклеотиды)

Специфическими реакциями для каждого вещества открывают продукты гидролиза – полипептиды, пуриновые основания, углевод и фосфорную кислоту.

Реактивы: серная кислота, 10% раствор; едкий натр, 10% раствор; медь сернокислая, 1% раствор; аммиак концентрированный; азотнокислое серебро, 1-2% раствор в аммиаке; молибденовый реактив; концентрированная серная кислота; дрожжи; тимол, 1% спиртовой раствор.

Ход работы: 2,5 г дрожжей помещают в круглодонную колбу на 100 мл, добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение 1-1,5 часов при слабом нагревании. Через 1,5 часа после начала кипения жидкости дают остыть, доводят в цилиндре водой до первоначального объема и фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов.

2. Качественные реакции на открытие составных частей нуклеопротеидов.

Биуретовая реакция на полипептиды. К 5 каплям гидролизата прибавляют 10-15 капель 10% раствора едкого натра и 1 каплю 1% раствора медного купороса. Жидкость окрашивается в розовый или розово-фиолетовый цвет.

Серебряная проба на пуриновые основания. К 10 каплям гидролизата добавляют по каплям крепкий раствор аммиака – приблизительно 10 капель до щелочной реакции, затем добавляют 10

38

капель аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3-5 минут образуется светло-коричневый осадок серебряных солей пуриновых оснований (содержимое пробирки при стоянии перемешивать не надо). Реакция протекает по уравнению:

Качественная реакция на пентозу (Молиша). К 10 каплям гидролизата дрожжей добавляют 3 капли 1% спиртового раствора тимола, перемешивают и по стенке пробирки осторожно приливают 20-30 капель концентрированной серной кислоты. При встряхивании на дне пробирки образуется продукт конденсации фурфурола с тимолом красного цвета.

При взаимодействии концентрированной серной кислоты с гексозами или пентозами происходит их дегидратация: из пентоз образуется фурфурол, а из гексоз – оксиметилфурфурол, которые дают с тимолом продукт конденсации красного цвета:

Качественная реакция на углевод. К 5 каплям гидролизата дрожжей приливают 3 капли 0,2% спиртового раствора α-нафтола и 20 капель концентрированной серной кислоты, появляется розовофиолетовое окрашивание.

фосфорномолибденовокислый аммоний (желтый кристаллический осадок)

Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 10 каплям гидролизата приливают 20 капель молибденового реактива и кипятят. При этом жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет (не осадок). Пробирку сразу охлаждают под струей холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония:

3. Получение кристаллов гемина из гемоглобина.

Реактивы: кровь; ледяная уксусная кислота.

39

Ход работы: Каплю свежей крови, взятой из пальца, помещают на предметное стекло и дают ей высохнуть на воздухе. К подсушенной крови прибавляют 2-3 капли ледяной уксусной кислоты и стеклянной палочкой тщательно перемешивают сухую кровь с уксусной кислотой. Смесь накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до появления пузырьков, т.е. до начала кипения. Предметное стекло следует держать высоко над пламенем горелки, чтобы избежать быстрого выкипания жидкости. По охлаждении препарат рассматривают под микроскопом. Кристаллы гемина, образовавшиеся при разрушении гемоглобина, имеют вид мельчайших ромбоидальных пластинок, окрашенных в бурый цвет, иногда сложенных в виде звездочек, чаще разбросанных в виде палочек. Если обнаружить кристаллы не удается, то следует приподнять покровное стекло, добавить 2-3 капли ледяной уксусной кислоты, продолжить нагревание и по охлаждении исследовать под микроскопом.

4. Выделение муцина из слюны.

Реактивы: слюна; концентрированная уксусная кислота.

Ход работы. В пробирку собирают около 2 мл слюны и по каплям (4-5 капель) прибавляют концентрированную уксусную кислоту. Выделяется осадок муцина, трудно растворимый в избытке уксусной кислоты. Сгусток вынимают стеклянной палочкой, помещают в чистую пробирку и проделывают с ним реакцию Подобедова-Молиша.

5.Нафтоловая проба на углеводную группировку муцина (Подобедова-Молиша).

Принцип метода. Если к сгустку муцина добавить спиртовой раствор α-нафтола и смесь подслоить концентрированной серной кислотой, то на границе двух слоев жидкости появляется фиолетовое кольцо.

Реакция обусловлена присутствием в муцине углеводной простетической группы. При действии концентрированной серной кислотой из глюкозы образуется оксиметилфурфурол. Последний, конденсируясь с α-нафтолом, превращается в окрашенное соединение.

Реактивы: муцин; α-нафтол, 1% спиртовой раствор; концентрированная серая кислота.

Ход работы. К сгустку муцина добавляют 1-2 капли 1%. спиртового раствора α-нафтола, перемешивают и по стенке осторожно спускают 10-20 капель концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости постепенно появляется фиолетовокрасное кольцо, хорошо заметное на белом фоне. Если вместо α- нафтола взять 1% раствор тимола, образуется более отчетливое красное кольцо.

40