Методическое пособие биохимия человека

Указания к составлению отчета: полученные данные необходимо оформить в виде таблицы, в которой указать название простетической группы и химическую структуру её компонентов.

Вопросы для самоконтроля:

1.Дайте определение сложного белка.

2.Что такое нуклеопротеиды и из каких компонентов они состоят?

3.Какие простые белки входят в состав нуклеопротеидов и какова особенность их аминокислотного состава?

4.Какими качественными реакциями можно открыть продукты гидролиза нуклеиновых кислот?

5.Какие продукты образуются при гидролизе углеводной части гликопротеидов?

6.Что такое фосфопротеиды и с помощью какой реакции можно открыть их фосфорную кислоту?

41

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

ФЕРМЕНТЫ.

Теоретическая часть.

Ферменты или энзимы — специфические белки, которые играют роль биологических катализаторов. Они входят в состав клеток и тканей живых организмов. Благодаря ферментам обмен веществ протекает с большой скоростью при обычной температуре тела и без участия сильнодействующих химических реагентов.

Белковую часть сложных белков ферментов; называют апоферментом, а небелковую часть — кофактором. Кофактор условно разделяют на кофермент (коэнзим), легкодиссоциирующую и простетическую группу, труднодиссоциирующую. Кофермент легко присоединяется к различным апоферментам, а простетическая группа соединяется только с одним и тем же апоферментом.

Функции и свойства апофермента и кофактора следующие. Апофермент термолабилен, определяет специфичность фермента, участвует в соединении фермента с субстратом [S], активирует кофактор. Кофактор термостабилен, стабилизирует апофермент, участвует в катализе.

В роли кофактора могут выступать ионы металлов (Na+, К+, Mg+2, Са+2, Fe+2) и микроэлементы (Mn2+, Cu2+, Zn2+ и др.). Коферменты

часто бывают представлены веществами органической природы — нуклеотидами, витаминами и др.

Согласно современным представлениям, ферменты увеличивают скорость химических реакций, снижая энергетический барьер данной реакции. Это положение лежит в основе теории Михаэлиса—Ментен

— теории образования фермент—субстратного комплекса. По этой теории ферментативное действие зависит от скорости образования комплекса фермента с субстратом и скорости последующего распада этого комплекса с образованием продукта реакции и освобождением фермента.

Для каждого фермента можно определить константу Михаэлиса

(Km):

Km [S]*(Vmax 1)

V

где Кm — константа Михаэлиса, [S] – концентрация субстрата, V mах — максимальная скорость реакции (при насыщении фермента субстратом), V — скорость реакции в условиях опыта.

Исходя из уравнения Михаэлиса-Ментен Кm также можно определить графически (рис. а)

42

-термолабильность и температурный оптимум действия ферментов;

-влияние на активность ферментов различных веществ — активаторов и ингибиторов.

Практическая часть.

1. Влияние реакции среды на активность амилазы.

Принцип метода. Каталитическая активность ферментов зависит от рН среды. С изменением величины рН меняется структура фермента. Для каждого фермента характерен определенный оптимум рН. От рН зависит степень ионизации фермента.

Зависимость ферментативной активности от рН среды изучается в работе на примере α— амилазы, субстратом которой является крахмал (полисахарид, состоящий из глюкозы). Фермент α- амилаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза) содержится в слюне и катализирует гидролиз α- глюказидной связи α-1,4-крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы. Кроме того, в слюне имеется Фермент мальтаза, расщепляющая мальтозу до глюкозы.

Гидролиз крахмала под действием α- амилазы проходит до стадии образования декстринов. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, декстрины в зависимости от размера дают с йодом окрашивание: амилодекстрины — фиолетовое, эритродекстрины — красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза — желтое (цвет йода в воде, т.е. окрашивание с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — имеют свободные альдегидные группы и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно— восстановительная реакция. При этом альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь — гидрат окиси меди (голубого цвета) восстанавливается в гидрат закиси меди желтого цвета. При дальнейшем нагревании гидрат закиси меди переходит в красную закись меди.

44

Реактивы: амилаза слюны (прополаскивают рот, затем набирают 10—15 мл дистиллированной воды и держат ее во рту в течение минуты, после чего сливают в стаканчик); крахмал, 0,1 % раствор на 0,3 % растворе хлорида натрия; раствор Люголя; едкий натр, 0,1 Н раствор; HCl, 0,1 Н раствор.

Ход работы: Активность амилазы слюны неодинакова у разных людей и даже меняется в течение дня у одного и того же человека. Поэтому необходимо подобрать подходящее разведение раствора слюны так, чтобы гидролиз 1 мл раствора крахмала при комнатной температуре и нейтральной реакции среды под влиянием 1 мл раствора слюны проходил на 5—8 минут. Для этого в пробирке смешивают 1 мл раствора крахмала и 1 мл раствора слюны. Сразу же после смешивания каплю смеси помешают в чистую пробирку, добавляют каплю раствора Люголя и отмечают окраску. В дальнейшем пробы берут с интервалом в полминуты. Реакция считается законченной, когда цвет раствора Люголя не изменяется. Если гидролиз крахмала происходит быстро, то слюну разводят и снова определяют время расщепления крахмала. Если гидролиз крахмала идет медленнее, чем 10 минут, то к раствору фермента добавляют несколько капель неразведенной слюны и определяют время полного гидролиза крахмала. После подбора нужной активности фермента выполняют основную часть работы по изучению влияния реакции среды на активность амилазы.

Схему построения опыта и получение результатов записывают в таблицу:

Так как оптимум рН для амилазы слюны равен 6,9 –7,0, наблюдение за гидролизом крахмала ведут по пробе № 2 и добавляют раствор Люголя. Как только гидролиз во второй пробе закончится, опыт прекращают добавлением во все три пробы 2-3 капли раствора Люголя.

45

Пробу № 3 перед добавлением раствора Люголя нейтрализуют 0,1н раствором соляной кислоты, так как в щелочной среде реакция с йодом не идет.

Наблюдают отсутствие реакции с йодом во второй пробе и фиксируют оттенок в первой и третьей пробах. Результаты записывают в таблицу, делают выводы о влиянии реакции среды на активность амилазы.

2. Специфичность действия ферментов.

Принцип метода. Специфичность действия ферментов выражается в способности ферментов катализировать реакции одного стереоизомера, одного определенного субстрата или группы сходных по строению субстратов, характеризующихся определенным типом химической связи или наличием в молекуле определенной химической группировки. Это свойство является наиболее характерным среди свойств биологических катализаторов.

Специфичность действия ферментов изучается в работе на примере амилазы слюны и сахаразы, полученной из дрожжей (дрожжи растираются с дистиллированной водой и после центрифугирования надосадочную жидкость используют для опыта). Оба фермента являются глюкозидазами. Амилаза слюны гидролизует крахмал. Об активности процесса судят по реакции с йодом. Сахараза гидролизует дисахарид сахарозу с образованием моносахаридов: глюкозы и Фруктозы. Сахароза не обладает восстанавливающим действием. Но при гидролизе глюкозидной связи в ее молекуле образуется моносахариды, обладающие восстанавливающей способностью, что можно обнаружить по пробе Троммера: в пробирку наливают по 1—2 мл раствора сахара и добавляют равный объем 10 % раствора едкого натрия, затем добавляют по каплям 5 % раствор сернокислой меди до появления неисчезающей мути. Осторожно нагревают верхнюю часть содержимого пробирки. Появление желтого окрашивания — гидролизат закиси меди, переходящего в красное — закись меди — указывает на положительную реакцию.

Гидролиз глюкозидной связи в дисахаридах и полисахаридах может происходить не только ферментативном путем, но и при действии неорганических катализаторов, например, кислот. В задачу настоящей работы входит также сравнение специфического действия ферментов — биологических катализаторов и соляной кислоты и неорганического катализатора необладающего специфичностью действия.

Реактивы: амилаза слюны, раствор; сахараза, раствор; соляная кислота, 10 % раствор; едкий натр, 10 % раствор; медь сернокислая, 5 % раствор; раствор Люголя; крахмал, 0,1 % раствор; сахароза, 1 % раствор.

46

4. Активность α-амилазы слюны (количественное определение).

Принцип метода. Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в миллилитрах, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при температуре 38°С в течение 30 минут. В норме амилазная активность слюны равна 160—320. Амилазная активность обозначается А 380/30’. Этот метод широко используется для определения амилазной активности крови и мочи.

Реактивы: крахмал 0,1% раствор; раствор Люголя; слюна в разведении 1:9.

Ход работы: В 10 пробирок наливают по 1 мл воды и в первую из них добавляют 1 мл разведенной в 10 раз слюны. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью и т.д. до 10-ой пробирки. Из 10-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. Во все пробирки наливают 1 мл воды и по 2 мл 0,1% раствора крахмала, перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при 380С на 30 минут, после инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой, добавляют по 1 капле раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. Отмечают последнюю пробирку с желтоватой окраской, где гидролиз крахмала прошёл полностью. И делают расчёт, полученные данные заносят в таблицу.

Расчёт. Отметив пробирку, где гидролиз крахмала прошёл полностью при наименьшем количестве фермента, по количеству не разведенной слюны в данной пробирке рассчитывают амилазную активность слюны по следующей пропорции:

А мл слюны расщепило 2 мл 0,1% раствора крахмала,

48

1 мл слюны расщепил Х мл 0,1 % раствора крахмала, где А – количество неразведенной слюны.

Например, желтоватая окраска появляется в 4-й пробирке, где слюна была разведена в 160 раз; 1/160 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала; 1 мл неразведенной слюны расщепил Х мл 0,1% раствора крахмала: Х=2*1*160/1=320 мл 0,1% раствора крахмала.

Следовательно, амилазная активность слюны А 380/30’ равна 320.

Вопросы для самоконтроля:

1.Какие вещества называются ферментами? Каковы их химическая природа и свойства?

2.Что такое специфичность действия ферментов и как она определяется?

3.Как зависит активность ферментов от температуры и величины рН среды?

4.Какие вещества называют активаторами и ингибиторами ферментов? Приведите примеры.

5.Какие качественные и количественные методы используют для изучения действия ферментов?

6.Какую реакцию катализирует амилаза, сахараза?

7.Единицы ферментативной активности. Каким способом выражается активность амилазы в данной работе?

49

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7

ВИТАМИНЫ.

Теоретическая часть.

Витамины — органические низкомолекулярные вещества, имеющие разнообразную химическую природу. Они необходимы организму в очень малых количествах, поступают с пищей и являются незаменимыми факторами питания. При отсутствии витаминов в пище развиваются тяжелые заболевания — авитаминозы, а при недостаточном содержании витаминов — гиповитаминозы (рахит, цинга, бери-бери, пеллагра, анемия и др.).

Функция витаминов в организме связана с обеспечением нормального протекания обменных процессов, поскольку многие из них входят в состав коферментов (простетических групп) ферментов. В составе коферментов находятся водорастворимые витамины; роль жирорастворимых витаминов в процессе обмена веществ изучена в меньшей степени. Витамины не используются как строительный материал клеток и как источник энергии; суточная их потребность измеряется миллиили микрограммами.

Витамины принято подразделять на две большие группы: витамины, растворимые в воде, и витамины, растворимые в жирах и жирорастворителях. К первой группе относятся витамины группы В (витамины В1, В2, РР, В12, аминобензойная кислота, пантотеновая, фолиевая кислоты, биотин), витамины С и Р. К жирорастворимым витаминам относятся А, Д, Е, К. Многие витамины содержатся в продуктах животного происхождения и поступают в организм в виде провитаминов, являющихся исходными продуктами для образования витаминов. Некоторые витамины способны синтезироваться микрофлорой кишечника человека или в организме, например витамин РР — из аминокислоты триптофана. Введение отдельных лекарственных веществ может отрицательно сказаться на синтезе витаминов микрофлорой кишечника. Суточная потребность в витаминах возрастает при различных заболеваниях, беременности, лактации и при нарушении всасывания жирорастворимых витаминов в случае недостаточного поступления желчи в кишечник при заболевании печени.

Структурные аналоги витаминов, близкие к ним по строению, называют антивитаминами. Эти вещества встречаются в природе или могут быть синтезированы. Антивитамины способны соединяться с белковой частью фермента вместо витаминов и вызывать изменения активности ферментов и обменных процессов.

Для обнаружения витаминов в различных веществах или в биологических жидкостях и определения их количества существуют

50