2.3 Выделение чистых культур микроорганизмов.

Чистой культурой микроорганизмов называется культура, в которой присутствуют клетки лишь одного вида (или штамма) микроорганизмов.

При выделении чистой культуры из объектов окружающей среды, техногенных потоков, при расчистке загрязненных культур следует учитывать, что однократный пересев микроорганизмов из выросшей колонии на другую среду не всегда гарантирует чистоту культуры. Чистые культуры микроорганизмов выделяют, как правило, на поверхности или внутри агаризованной питательной среды. Наилучшая очистка достигается на полноценной питательной среде, например, ГРМ-агаре. Но даже в этом случае пересевать следует из оформившихся колоний, так как возможно присутствие медленно растущих контаминантов.

Существует несколько методов получения чистых культур.

1. Метод разбавлений Пастера. Из суспензии, содержащей смесь микроорганизмов, делается ряд последовательных десятикратных разведений в стерильной жидкой питательной среде, в физиологическом растворе или в стерильной воде. С каждым разведением количество микроорганизмов, попадаю­щих в пробирку, будет уменьшаться в 10 раз, и можно таким образом получить такие разведения, когда в объеме среды в пробирке будет находиться только одна клетка, из которой и разовьется чистая культура.

2. Метод выделения чистой культуры с помощью агаризованных сред (метод Коха).

Для получения изолированных колоний на твердой среде исследуемый материал высевают на поверхность твердой питательной среды, наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Рассев проводят либо методом истощающего мазка, либо методом истощающего штриха. В первом случае шпателем равномерно распределяют нанесенную каплю по поверхности твердой среды. Тем же шпателем делают посев на поверхность второй пластинки и затем третьей, т. е. перенося последовательно на твердую среду клетки микроорганизмов, которые остались на шпателе. Таким образом, количество микроорганизмов, вносимых последовательно на пластинки (агаризованную среду), будет уменьшаться: на вторую – меньше, чем на первую; на третью – ещё меньше, чем на вторую и т. д.

Задание:

1. Приготовить агаризованную ПС типа ГРМ-агар для посева бактериальных культур в чашки Петри и в пробирки на скошенную ПС (по 1 чашке Петри и 1 пробирке на каждого студента).

2. Приготовить жидкую ПС типа ГРМ-бульон для посева бактериальных культур в пробирки (по 1 пробирке на каждого студента).

3. Приготовить для стерилизации чашки Петри, пробирки, закрыть их ватно-марлевыми пробками и простерилизовать.

4. Произвести посев бактериальных культур на скошенную агаризованную среду и в чашки Петри на поверхность агаризованной среды – штрихом и в жидкую ПС в пробирки.

3 Культуральные и морфологические признаки микроорганизмов.

Культуральные признаки

К культуральным или макроморфологическим свойствам относят характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

На поверхности плотных питательных сред микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Образование поверхностных колоний – наиболее существенная особенность роста многих микроорганизмов на плотном субстрате. Такие колонии отличаются большим разнообразием. При их описании учитывают следующие признаки:

• форму – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.;

• размер (диаметр) – измеряют в миллиметрах, если размеры не превышают 1 мм, то их называют точечными;

• поверхность – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

• профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный и т.д.;

• блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

• цвет – бесцветная или пигментированная – белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная и т.д., отмечают выделение пигмента в субстат;

• край – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;

• структуру – однородная, мелко- или крупнозернистая и т.д.;

• консистенцию определяют, прикасаясь к поверхности колонии петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипать к петле), тягучей, иметь вид пленки (снимается целиком), быть хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей).

Глубинные колонии чаще всего они по виду похожи на сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Лишь не у многих бактерий глубинные колонии напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом питательной среды.

Донные колонии разных микроорганизмов обычно имеют вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Размеры и многие другие особенности колонии могут изменяться с возрастом и зависят от состава среды. Поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию.

Рост микроорганимов на жидких питательных средах более однообразен и сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост микроорганизмов в жидкой среде, отмечают степень помутнения – слабая умеренная или сильная, особенности пленки – тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, а при образовании осадка указывают – скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный. Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков, а также с помощью «поплавков» - маленьких запаянных с одного конца трубочек.

Морфологические признаки

Морфологическая характеристика и организация клеток микроорганизмов включает такие признаки, как форма и размеры клеток, их подвижность, наличие жгутиков и тип жгутикования, способность к спорообразованию, септированность мицелия, тип спороносцев, форма спор и т.п.