3. Микробиота воздуха и методы изучения микробиоты воздуха.

Воздух является неблагоприятной средой для размножения микроорганизмов.

Микрофлору воздуха условно разделяют на постоянную (автохтонную) и транзитную или временную (аллохтонную).

К представителям резидентной (автохтонной) микрофлоры, которая в основном формируется за счет микроорганизмов почвы, относят пигментообразующие кокки, бациллы, грибы.

Транзиторная (аллохтонная) микрофлора воздуха формируется преимущественно за счет видов, поступающих с поверхности водоемов и из организма людей и животных. В процессе чихания может образовываться до 40 000 капель. В зависимости от размера капель, скорости движения в воздухе аэрозоль может иметь капельную и пылевую фазы, а также капельные ядрышки.

Капельная фаза представлена мелкими каплями, длительно сохраняющимися в воздухе и высыхающими прежде, чем они успевают осесть.

Пылевая фаза представлена крупными, быстро оседающими, испаряющимися каплями, в результате образуется пыль, способная подниматься в воздушную среду. В бактериальной пыли могут выживать только особо устойчивые виды микроорганизмов: микобактерии туберкулеза (до месяца), спорообразующие бактерии.

Капельные ядрышки - это мелкие капельки аэрозоля, которые остаются в воздухе во взвешенном состоянии и образуют аэродисперсную систему. В них частично сохраняется влага, которая обволакивает клетку возбудителя, поддерживая жизнедеятельность микроорганизмов длительное время (Corynebacterium diphtheriae - в течение суток).

Различают три вида аэрогенного пути передачи инфекционного агента: воздушно-капельный, капельно-ядерный, пылевой. Возможно также попадание микробов в воздух со слущивающимся эпидермисом кожных покровов, с пылью загрязненного постельного белья и зараженной почвы.

Контаминация воздуха закрытых помещений патогенными микроорганизмами происходит в основном воздушно-капельным путем. К ним относятся коклюш, скарлатина, дифтерия, грипп, корь, ветряная оспа, различные ОРВИ.

Санитарно-показательными микроорганизмами воздуха больничных помещений являются β- и α-гемолитические стафилококки и стрептококки. Они могут быть причиной гнойно-воспалительных заболеваний при попадании в открытую рану. Общее количество микроорганизмов в 1,0 м³ воздуха операционных не должно превышать 500 КОЕ, а после операции - 1 000 КОЕ, патогенные стафилококки не должны обнаруживаться в 250,0 л воздуха.

При оценке санитарного состояния закрытых помещений в зависимости от задач исследования определяется общее микробное число, присутствие санитарно-показательных микроорганизмов, а также непосредственно патогенных микроорганизмов. Например, при исследовании воздуха медицинских учреждений определяется присутствие микроорганизмов, относящихся к условно - патогенной флоре (синегнойная палочка, бактерии рода Proteus).

Санитарно-гигиеническое исследование воздуха проводится при помощи седиментационных (основанных на принципе механического оседания микробов) и аспирационных (основанные на активном просасывании воздуха с помощью различных приборов) методов и включает определение общего количества микробов в 1 м³ и выявление патогенных гемолитических стафилококков и стрептококков. С помощью седиментационного метода (метод Коха) можно получить общее представление о встречающихся в воздухе микроорганизмах. Аспирационные методы дают возможность определить не только качественное, но и количественное содержание бактерий в определенном объеме воздуха.

Метод седиментации (метод Коха). Метод является неточным. Его используют только при исследовании воздуха закрытых помещений. Заключается в способности микроорганизмов под действием силы тяжести и под влиянием движения воздуха (вместе с частицами пыли и капельками аэрозоля) оседать на поверхность питательной среды в открытые чашки Петри. Для проведения метода Коха две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 минут, после чего посевы инкубируют в термостате при 37ºС. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках: при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым, 250-500 колоний свидетельствует о загрязнении средней степени, при количестве колонии более 500 — загрязненным. Для обнаружения определенных видов микроорганизмов могут быть использованы специальные питательные среды. Однако метод оседания не дает полного количественного представления о микрофлоре воздуха, так как на открытых чашках плохо улавливаются тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц.

Аспирационный метод основан на принудительном осаждении микроорганизмов из воздуха на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость (мясо-пептонный бульон). Аспирационные методы используют при исследовании воздуха, как закрытых помещений, так и атмосферного. Это более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Для исследования воздуха этим методом применяют аспирационный прибор Кротова. Принцип работы этого аппарата основан на том, что воздух, просасываемый через клиновидную щель в крышке аппарата, ударяется о поверхность питательной среды, при этом частицы пыли и аэрозоля прилипают к среде, а вместе с ними и микроорганизмы, находящиеся в воздухе. Воздух в количестве 50—100 л пропускают со скоростью 25 л в минуту над открытой чашкой с мясо-пептонным агаром или со специальной средой. Вращение столика с чашкой Петри обеспечивает равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды. К концу заданного времени чашку с посевом воздуха снимают, закрывают ее и помещают в термостат. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле: ОМЧ = А х 1000/V, где А– количество выросших колоний на чашке, V — объем пропущенного через прибор воздуха, л, 1000 — стандартный объем воздуха в литрах. Допустим, на чашке при подсчете обнаружено 250 колоний, воздух пропускали 2 минуты со скоростью 25 л в минуту. Всего было пропущено 50 л воздуха. ОМЧ=250 х 1000/50=5000 (дм³).

В помещениях лечебных организаций исследование бактериальной обсемененности воздушной среды на следующие санитарно-микробиологические показатели:

- общее количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество колоний S.aureus в 1 куб. м воздуха (КОЕ/куб. м);

- количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 куб. м воздуха.

4. Микробиота почвы и методы изучения микробиоты почвы.

Почва является основной средой обитания многих микробов. Отсюда они поступают в воду и обсеменяют воздух.

В 1 г почвы насчитывается до 10 млрд микробных тел. На поверхности почвы микроорганизмов относительно мало, т.к. на них губительно действуют УФ-лучи и высушивание. Наибольшее число микроорганизмов содержится в верхнем слое почвы толщиной 10-30 см.

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв по санитарно-бактериологическим показателям, которые делятся на косвенные и прямые:

1) Косвенные характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это — санитарно-показательные микроорганизмы: бактерии группы кишечной палочки, термофильные и нитрифицирующие бактерии. В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень высока, что наряду с санитарно-химическими показателями (динамика аммиака и нитратов) свидетельствует о неблагополучии и создании повышенного риска инфицирования. Обнаружение энтерококков всегда свидетельствует о свежем фекальном загрязнении, каковы бы ни были другие показатели.

2) Прямые санитарно-бактериологические показатели эпидемической опасности почвы — обнаружение возбудителей кишечных инфекций (патогенные энтеробактерии, энтеровирусы). О возможности загрязнения почвы патогенными энтеробактериями свидетельствует индекс санитарно-показательных микроорганизмов БГКП (колиформ) и энтерококков 10 и более клеток/г почвы.

При необходимости углубленной оценки санитарного состояния почвы и способности ее к самоочищению исследуются показатели биологической активности почвы. Основными интегральными показателями биологической активности почвы являются: общая микробная численность (ОМЧ), клостридии, термофильные бактерии.

Отбор проб почвы. Места отбора проб предварительно отмечаются на картосхеме, отражающей структуру городского ландшафта. Пробная площадка — часть исследуемой территории, характеризующаяся сходными условиями. Пробная площадка должна располагаться на типичном для изучаемой территории месте. На площади 100 кв. м закладывается одна пробная площадка размером 25 м.

Точечная проба — материал, взятый из одного слоя почвенного профиля. Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев методом конверта (4 точки – прямоугольник, 5 точка – центр прямоугольника). Точечные пробы отбирают ножом, шпателем. Объединенную пробу составляют путем смешивания точечных проб, отобранных на одной пробной площадке.

Для бактериологического анализа с одной пробной площадки составляют 10 объединенных проб. Каждую объединенную пробу составляют из трех точечных проб массой от 200 до 250 г каждая, отобранных послойно с глубины до 5 см и от 5 до 20 см.

Пробы почвы отбирают стерильными инструментами, перемешивают на стерильной поверхности, помещая в стерильную тару. Время от отбора проб до начала их исследования не должно превышать 1 суток.

Отобранные пробы необходимо пронумеровать и зарегистрировать в журнале, указав следующие данные: порядковый номер и место взятия пробы, рельеф местности, тип почвы, дату отбора. Пробы подписать.

Для приготовления среднего образца почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный, плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают твердые предметы. Затем почву распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг почвы. Перед посевом почву просевают через сито диаметром 3 мм.

Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемой степени загрязнения почвы и планируемых определений. Для учета почвенных микроорганизмов достаточно навески от 1 до 10 г. В навеску почвы добавляют небольшое количество стерильной воды до получения пастообразного состояния почвы. Из суспензии делают раститровку. Первое разведение навески почвы (1:10) делают в стерильной посуде, добавляя к суспензии стерильную водопроводную воду в соотношении 1:9 к весу почвы (10 г почвы и 90,0 мл воды и т.д.). Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды, а также для учета численности микроорганизмов методом прямой микроскопии.

Определение общей численности почвенных микроорганизмов (ОМЧ). После титрования исследуемой почвы, из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 0,1 или 0,2 мл на поверхность почвенного агара, разлитого в стерильные чашки Петри, и равномерно шпателем растирают по всей поверхности чашки. Термостатирование засеянных чашек ведут при 28-30 °C в течение 72 ч. Учет результата: количество колоний на обеих чашках суммируют, делят на два и умножают на степень разведения. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г.

Определение коли-индекса. Если предполагается невысокая степень фекального загрязнения, БГКП в почве определяют бродильным методом или методом мембранных фильтров; при высокой степени — прямым посевом почвенной суспензии в разведении 1:10 на среду Эндо.

Метод мембранных фильтров проводят также как и при исследовании воды. Предварительно почвенную суспензию 1:10 центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, затем 5-10 мл суспензии фильтруют через мембранные фильтры.

При титрационном методе из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы в питательную среду Кесслера (1% пептона, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый). Из разведения 1:10 10 мл засевают во флакон с 50 мл среды, что соответствует 1 г почвы. Для посева меньших количеств (0,1 и 0,01 г почвы) делают разведение 1:100 и по 1 мл из разведений 1:10 и 1:100 соответственно засевают в пробирки с 9 мл среды. Далее методика соответствует определению коли-индекса воды.

Определение перфрингенс-титра. Перфрингенс-титр почвы - минимальное количество почвы, в котором еще определяются Clostridium perfringens. Из приготовленных 10-кратных разведений почвенной суспензии по 1 мл переносят в два параллельных ряда пробирок. Один ряд прогревают при 80°С 15 мин для уничтожения вегетативных форм. Далее пробирки заливают свежеприготовленной средой Вильсона-Блера. Посевы инкубируют при 43°С в течение 24-48 часов, после чего учитывают результаты по образованию черных колоний. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму и обнаруживают типичные грамположительные палочки.

Определение термофильных бактерий. Число термофильных бактерий определяют глубинным посевом различных разведений на плотные среды (МПА) с инкубированием при 60°С в течение суток. Из каждого разведения рекомендуется засевать по 2-3 параллельные чашки.

Определение нитрифицирующих бактерий. Титр нитрифицирующих бактерий определяют посевом из 10-кратных разведений почвенной суспензии на жидкую синтетическую среду Виноградского. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14-15 суток. На 5-7 день можно проверить образование азотистой или азотной кислоты при помощи дифениламина. Для этого на стеклянную пластину помещают каплю среды и добавляют несколько капель дифениламина (в концентрированной серной кислоте), синее окрашивание свидетельствует о присутствии нитратов.

Кроме того, в почве проводят определение энтерококков. Энтерококки - грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые, располагающиеся в виде диплококков или коротких цепочек, реже одиночными кокками. При росте на жидких средах вызывают диффузное помутнение и образование осадка.

В почве также определяют количество актиномицетов и грибов.

Определение аммонификаторов в почве. Аммонифицирующие микроорганизмы принимают участие в расщеплении белковых соединений до аммиака. Их учитывают на МПА, а при необходимости на жидких пептонных средах (МПБ, пептонная вода) с индикаторными бумажками, определяющими аммиак. Для определения выделяющегося аммиака над средой в пробирке подвешивают красную лакмусовую бумажку (при выделении аммиака она синеет).

Определение патогенных энтеробактерий родов Salmonella и Shigella в 1 г почвы. Сущность определения шигелл и сальмонелл заключается в использовании методов накопления патогенных бактерий в средах обогащения с последующим пересевом на плотные селективные и дифференциальные среды.