прежде всего аналитическим методом, позволяющим либо подтвердить, либо опровергнуть предполагаемую структуру синтезированного соединения. Особенность метода ЯМР состоит в том, что по положению резонансных линий в спектрах можно судить о взаимном расположении отдельных атомов или групп атомов, причем это удается сделать даже для эквивалентных атомов.

Кроме этой области применения, ориентированной на химические приложения метода, можно получить также информацию о пространственном расположении атомов, конфигурации биологически важных молекул и молекулярных комплексов. Такая информация позволяет внести существенный вклад в выяснение механизмов ферментативных превращений и путей прохождения биохимических реакций. В таблице 1 перечислены основные применения ЯМР при исследовании малых молекул, где отнесение резонансных линий и необходимое разрешение в спектрах достигаетсяотносительно просто, и макромолекул, для которых это достаточно сложная задача.

В простейшем случае анализ с помощью ЯМР заключается в сопоставлении линий спектров стандартного образца известной структуры со спектром образца неизвестной структуры – совпадение спектров позволяет провести идентификацию последнего. На основании такого сопоставления можно дать и количественную оценку концентрации веществ, содержащихся в образце. Правда, этот способ оценки справедлив лишь тогда, когда оба сравниваемых спектра получены при идентичных условиях. Реальный спектр, соответствующий определенному

Таблица 1

Применение ЯМР-спектроскопии в биохимии

Структура активного центра ферментов, пространственное

расположение боковых цепей относительно субстрата,

ЯМР ионизация функциональных групп макромолекул Определение временных характеристик (времени корреляции) и

характера движения при локальных и глобальных конформационных изменениях

Взаимодействие между молекулами фермент-субстрат, протеин-

протеин, протеин-нуклеиновая кислота

Определение вторичной структуры в растворе

Определение третичнойструктуры в растворе

веществу, существенно зависит от условий его регистрации. Вид спектра определяется не только факторами, которые экспериментатор может контролировать самостоятельно (температура в датчике ЯМР, напряженность поля, применяемая импульсная последовательность), но и используемым растворителем. Несмотря на это, все же удается провести идентификацию неизвестного вещества путем сравнения характерных особенностей спектров.

Как отмечалось ранее, химический сдвиг можно понимать как усиление или ослабление внешнего магнитного поля в точке расположения исследуемого ядра. Основной вклад в величину этого локального изменения поля дают электронные оболочки рассматриваемых молекул, которые отражают их структуру. В то же время для большинства молекул в растворе их конформация при комнатной температуре не является жесткой – конформационное равновесие зависит от растворителя, температуры и давления, а также от способности образовывать относительно стабильные комплексы. В общем же случае значения химических сдвигов характеристичны при условии, что влияние заместителей является аддитивной поправкой к величине сдвига.

Далее, химический сдвиг приводится относительно некоторой резонансной частоты (сигнала) вещества-стандарта, которое добавляется в исследуемый раствор (внутренний стандарт) или помещается в капилляр (внешний стандарт). Химический сдвиг определяется через резонансную частоту стандарта и имеет смысл тогда, когдастандарт указан. Значение сдвигаотносительно одного стандарта всегда можно пересчитать в значение относительно общепринятого стандарта. Как внешний, так и внутренний стандарты обладают рядом преимуществ и недостатков. Внутренний стандарт может вступать во взаимодействие с другими молекулами, присутствующими в растворе, что приводит к сдвигу сигнала стандарта, т.е. к сдвигу нулевой точки. Взаимодействие стандарта с исследуемым веществом также может привести к изменению вида его спектра. Поэтому основным требованием, предъявляемым к внутреннему стандарту, является уменьшение этого эффекта.

Внешний стандарт, как правило, запаивают в капилляр и помещают в измерительную ампулу. Очевидным преимуществом использования внешнего стандарта является то, что молекулы стандартного вещества и исследуемого не взаимодействуют. Однако здесь возникает другая проблема, связанная с тем, что магнитные восприимчивости растворителя внутри капилляра и в образе различаются. Величина магнитного поля в точке расположения ядра определяется не только экранирующим влиянием электронных оболочек, но и внешним магнитным полем, величина которого зависит от магнитной восприимчивости окружения. Если используется внутренний стандарт, то изменение магнитного поля за счет восприимчивости окружения одинаково и для молекул стандарта, и для молекул исследуемого вещества. При использовании внешнего стандарта это условие не выполняется, более того различие магнитных полей определяется не только магнитными восприимчивостями исследуемого вещества ивещества-стандарта, но и геометрическими факторами. В ЯМР высокого разрешения образец и стандарт помещают в цилиндрические ампулы-капилляры,

оси которых параллельны внешнему магнитному полю H0 . Различие в значениях