Препаративное центрифугирование
Заключается в выделении биологического материала для последующих биохимических исследовании. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов.
дифференциальное центрифугирование.
Основано на различиях в скоростях седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал, например, гомогенат ткани, центрифугируют при ступенчатом увеличении центробежного ускорения, которое выбирается так, чтобы на каждом этапе на дно пробирки осаждалась определенная фракция. В конце каждой стадии осадок отделяют от надосадочной жидкости и несколько раз промывают, чтобы в конечном итоге получить чистую осадочную фракцию. К сожалению, получить абсолютно чистый (гомогенный) осадок практически невозможно. Дифференциальное центрифугирование является самым распространенным методом выделения клеточных органелл из гомо-генатов тканей.
зонально-скоростное центрифугирование
Метод заключается в наслаивании исследуемого образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем образец центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос. Применяется для разделения гибридов РНК — ДНК, субъединиц рибосом и других клеточных компонентов.
изопикническое центрифугирование.
При этой методике исследуемые частицы оседают на дно пробирки, а частицы меньшей плотности всплывут на поверхность жидкости. Используется при количественном разделении лизосом, митохондрий и пероксисом, основанном на удалении из гомогенной среды всех частиц с большей, чем у микросом, плотностью и последующем изопикническом центрифугировании выпавших в осадок тяжелых частиц.
равновесное центрифугирование в градиенте плотности.
Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCI, так как ионы цезия обладают большей массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей плотностью. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности является также одним из методов разделения и изучения липопротеинов плазмы крови человека.
Препаративные центрифуги и их применение.
Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги.
Центрифуги общего назначения обычно обеспечивают центрифугирование с максимальной скоростью 8000 об./мин и ОЦУ до 6000 g. Обычно центрифуги этого вида имеют большую емкость — от 4 до 6 дм3, что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10, 50 и 100 см3, но и сосудами емкостью до 1,25 дм3.
Скоростные центрифуги развивают скорость 25000 об/мин и ОЦУ до 89000 g. Камера ротора снабжена системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего вследствие трения при вращении ротора. Как правило, скоростные центрифуги имеют емкость 1,5 дм3.
Препаративные ультрацентрифуги обеспечивают центрифугирование со скоростью до 75000 об./мин и максимальное центробежное ускорение 510000 g.
Центрифуги специального исполнения имеют различные конструктивные варианты исполнения под те или иные специальные задачи или виды исследований. К таким центрифугам относятся рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой и другие.
Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 100 000 об./мин, создавая при этом центробежное ускорение до 500000 g. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в УФ-области спектра. Аналитическое ультрацентрифугирование широко применяется для оценки чистоты препаратов ДНК, вирусов и белков.
Перемешивающие и термостатирующие устройства.
Для поддержания оптимальных условий протекания иммунологических реакций, выполнения требований методик проведения других видов лабораторных анализов существует множество перемешивающих и термостатирующих устройств, имеющих различное конструктивное исполнение в виде как самостоятельных приборов, так и объединенных в единую конструкцию. Кроме этого, термостатирующие и перемешивающие устройства могут входить в качестве блоков в общую структуру автоматических анализаторов.
Термостаты по принципу передачи тепловой энергии подразделяются на жидкостные, суховоздушные, сухие.
В жидкостных термостатах передача тепловой энергии от источника тепла к объекту термостатирования происходит через жидкую среду. В суховоздушных термостатах тепловая энергия передается за счет циркулирующего потока воздуха. В сухих термостатах передача тепловой энергии идет через массивный, как правило, металлический блок (платформу) к объекту регулирования: пробирке, кювете, колбе, планшету. Выбор способа термостатирования и конкретной конструкции термостата во многом определяется назначением, емкостью и формой термостатируемого объекта.
Диапазон температур обычно лежит в пределах 20—70°С, причем может регулироваться достаточно плавно, или диапазон может быть представлен несколькими фиксированными значениями. Чаще всего среди фиксированных значений имеют место температуры 25, 30 и 37°С. Часто термостаты имеют единую конструкцию с перемешивающими устройствами.
Перемешивающие устройства предназначены для перемешивания реакционной смеси с целью ускорения проведения реакции и улучшения воспроизводимости результатов исследования. Перемешивание не должно вызывать появления пены и пузырей, которые могут повлиять на результаты измерения. В автоматических анализаторах перемешивание может осуществляться непосредственно струёй впрыскиваемого в кювету автоматическим дозатором реагента. Виды устройств.
Вибротермостат предназначен для подготовки проб и проведения реакций с использованием планшетов для иммунологических реакций. Вибротермостат позволяет осуществлять одновременное или раздельное перемешивание и термостатирование образцов в широком диапазоне частот и температур.
Шейкеры применяются для создания вращательного движения жидкости в лабораторной посуде различного вида: планшеты, пробирки, колбы с нагрузкой на платформу до 2 кг. Платформа совершает орбитальное движение в горизонтальной плоскости.
Встряхиватель применяется для перемешивания компонентов в любых пробирках. Гнездо прибора совершает орбитальное вращение с амплитудой 2 мм и частотой, регулируемой от 300 до 1800 об./мин.