Литература:

Основная:

1.Учебник "Биология" в 2х томах под ред. В.Н. Ярыгина, 2008, т. 1.

2.Учебник «Биология с общей генетикой», А.А. Слюсарев, 2011.

3.Лекции по биологии.

Дополнительная:

1.Чебышев Н.В. Биология, М., 2005.

2.Косых А.А., Родина Н.Е Задачи по общей и медицинской генетике, Киров, 2001.

Методические указания подготовлены: доцентом кафедры, к.б.н. Родиной Н.Е., зав.кафедрой, проф. Косых А.А. ___________________________________________

Методические указания утверждены на заседании кафедры № 10 от «02.04.2012» .

Зав. кафедрой: ________________________

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кировская государственная медицинская академия»

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Кафедра биологии

Методические указания для студентов 1 курса

Специальность лечебное дело

к практическому занятию по дисциплине биология

Тема: Методы изучения генетики человека (продолжение). Этапы и возможности цитогенетических методов в генетике человека.

Цель занятия: Познакомиться с цитогенетическими методами изучения наследственности человека; показать их значение для диагностики, прогнозирования и профилактики наследственных болезней. Ов­ладеть принципами анализа кариотипа.

Задачи:

1.Разобрать принципы и возможности цитогенетических методов в генетике человека.

2.Составить и проанализировать кариотип человека в норме и при патологии.

3. Провести определение полового хроматина в клетках слизистой щеки.

Студент должен знать:

А) до изучения темы:

1. Принципы и возможности использования цитогенетических методов.

2. Цитогенетическую характеристику основных хромосомных синдромов.

Б) после изучения темы:

1. Этапы интерфазного и метафазного цитогенетических методов.

2. Этапы медико-генетического консультирования.

Студент должен уметь:

1.Проводить анализ кариотипа человека по хромосомному набору.

2.Проводить экспресс-анализ по половым хромосомам.

Содержание занятия:

1.Вводный контроль. Проводится в виде тестовых заданий. Тестовые задания включают 10 вариантов по 5 вопросов.

2.Беседа по теме занятия:

1. С какой целью используется цитогенетический метод в генетике человека?

2. Значение интерфазных методов.

3. Этапы и значение метафазных методов в генетике человека.

Практическая работа

Работа 1. Используя таблицы, разобрать принципы и возможности цитогенетических методов исследования в генетике человека.

К цитогенетическим методам исследования относятся:

1. Микроскопическое изучение кариотипа человека в норме и при патоло­гии на стадии метафазы митоза (метафазный метод);

2. Микроскопические методы определения X и У-полового хроматина в интерфазных клетках эпителия слизистой ротовой полости или в нейтрофилах (интерфазный метод).

В первом случае в зависимости от задач исследования материалом для ци-тогенетического метода могут служить лимфоциты периферической крови, клетки костного мозга, фибробласты, клетки эмбриональных тканей, хо­риона, клетки амниотической жидкости. Их выращивают в культуре на специальных питательных средах с добавлением фитогемагглютинина (ФГА), который стимулирует митотическое деление; за 1-2 часа до фикса­ции обрабатывают колхицином, разрушающим ахроматиновое веретено и останавливающим клеточное деление на стадии метафазы; затем помеща­ют в гипотонический раствор, в котором клетки набухают, в результате че­го хромосомы оказываются свободно лежащими в цитоплазме. Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты, наносят на чистые предметные стекла и окрашивают либо рутинно (метод окраски по Гимзе), либо дифференциальными красителями. Фотографирование метафазных пластинок и последующая обработка фотографий с составлением кариограмм, в которых хромосомы распределены по группам, позволяет установить общее число хромосом и обнаружить изменение их числа или структуры в отдельных парах.

Метафазный метод хромосомного анализа применяется:

1. в диагностике хромосомных болезней, связанных с изменением числа и/или структуры хромосом;

2. в дифференциальной диагностике новообразований (лейкозы, солидные опухоли);

3. для изучения хромосомного мутагенеза (учет хромосомных мутаций) при проверке факторов окружающей среды на мутагенность;

4. в пренатальной диагностике (определение нарушений кариотипа у пло­да или пола плода).

В последнем случае используют следующие методические приемы:

• амниоцентез - чрезбрюшинный прокол плодного пузыря на 15-18-ой неделе беременности с целью получения околоплодной жидкости и на­ходящихся в ней слущенных клеток амниона и плода;

• кордоцентез - взятие крови их пуповины на 18-22-ой неделе беремен­ности;

• хорионбиопсия - взятие кусочков ворсин хориона на 7-10-ой неделе бе­ременности. Во всех трех случаях клетки культивируют для получения метафазных пластинок и анализируют кариотип плода.

Интерфазный метод хромосомного анализа используется в экспресс-диагностике численных аномалий по половьм хромосомам.

Для обнаружения У-хромосомы используются специальные флюорес­центные красители, дающие свечение при люминисцентной микроскопии.

Для выявления X-хромосом используется метод определения полового хроматина в клетках слизистой щеки. Метод основан на том, что в интерфазньгх ядрах соматических клеток нормальной женщины одна из двух X хромосом неактивна (гетерохроматинизирована) и при окрашивании выяв­ляется в виде компактной хроматиновой глыбки, называемой половым хроматином или тельцем Барра; в ядрах нормальных мужских клеток по­ловой хроматин, естественно, отсутствует. Если в организме несколько X хромосом, то активна - одна, а остальные обнаруживаются в виде допол­нительных телец Барра. Поэтому по количеству телец Барра можно судить о количестве X хромосом: число X хромосом (Nx) всегда на единицу боль­ше числа телец полового хроматина (Nб): Nx=Nб+1

Работа 2. Определение полового хроматина в ядрах клеток слизи­стой щеки.

Обкусайте слизистую оболочку щёки и сполосните рот водой. Сде­лайте легкий соскоб слизистой оболочки щеки шпателем, после чего из полученного материала приготовьте мазок на предметном стекле. Для фиксации препарата опустите его на 5-10 минут в стеклянный стакан со смесью спирта и эфира. По окончании фиксации покрасьте препарат орсеином, накройте покровным стеклом и рассмотрите под микроскопом с иммерсионным объективом.

В поле зрения увидите эпителиальные клетки слизистой оболочки с хорошо прокрашенными ядрами. В последних можно заметить половой хроматин в виде крупных хроматиновых глыбок, прилегающих к ядерной оболочке и имеющих форму овала, зубчика или диска.

Зарисуйте препарат. На рисунке должны быть обозначены: 1) цито­плазма клетки; 2) ядерная оболочка; 3) половой хроматин (если обнаружен)). Сделайте вывод об общем числе Х-хромосом в своих соматических клетках и запишите кариотип.

Работа 3. Составление и анализ кариотипа человека. Из разрезанных хромосом составьте кариотип человека согласно Денверской системе классификации и сравните его с идиограммой здоро­вого человека.

Алгоритм анализа хромосомного комплекса (кариограммы):

1. Определить общее число хромосом;

2. Определить число аутосом;

3. Определить число половых хромосом и назвать их;

4. Определить пол обследуемого;

5. Дать заключение: норма или наследственная патология (какая). Запишите кариотип.

6. Назвать характерные симптомы данной хромосомной болезни.

При распределении хромосом следует учитывать их размеры, положе­ние центромеры (центромерный индекс), наличие спутников. Распределе­ние хромосом идет в убывающем порядке от крупных к мелким с разделе­нием на 7 групп:

Группа А: 1-3 пары. Крупные метацентрические хромосомы.

Группа В: 4-5 пары. Крупные субметацентрические хромосомы.

Группа С: 6-12 пары. Средние субметацентрические хромосомы.

Группа D: 13-15 пары. Средние акроцентрические хромосомы, имеющие спутников.

Группа Е: 16-18 пары. Мелкие субметацентрические хромосомы; 16-17 пары имеют вторичную перетяжку вблизи центромеры.

Группа F: 19-20 пары. Мелкие метацентрические хромосомы.

Группа G: 21-22 пары. Мелкие акроцентрические хромосомы, на корот­ком плече имеют спутник.

Х-хромосома относится к группе С, сходна с 6-ой и 7-ой парами.

Y-хромосома - маленькая акроцентрическая, сходна по размерам и форме с хромосомами 21-ой и 22-ой пар, но отличается от них отсутствием спутников и наличием вторичной перетяжки в середине длинного плеча.

При работе следует вначале выделить хромосомы, принадлежащие к группам А и В, далее найти хромосомы групп D, G, Е и F. В последнюю очередь следует выделить хромосомы группы С и половые хромосомы.