СТРУКТУРА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ И МЕТОДЫ ЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии являются прокариотами и существенно отли­чаются от клеток растений и животных (эукариотов). Они относятся к одноклеточным организмам и состоят из клеточной стенки, цито-плазматической мембраны, цитоплазмы, нуклеоида (обязательных компонентов бактериальной клетки). Некоторые бактерии могут иметь жгутики, капсулы, споры (необязательные компоненты бакте­риальной клетки).

Клеточная стенка

Клеточная стенка представляет собой внешнюю структуру бактерий толщиной 30-35 нм, главным компонентом которой яв­ляется пептидогликан (муреин). Пептидогликан это структур­ный полимер, состоящий из чередующихся субъединиц Ы-ацетилглюкозамина и К-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями (рис. 2).Параллельно расположенные полисахаридные (гликановые) це­пи скреплены между собой поперечными пептидными мостиками (рис. 3).Полисахаридный каркас легко разрушается лизоцимом - анти-(жотиком животного происхождения. Пептидные связи являются мишенью для пенициллина, который ингибирует их синтез и пре­пятствует формированию клеточной стенки. Количественное содер­жание пептидогликана влияет на способность бактерий окрашивать­ся по Граму. Бактерии, имеющие значительную толщину муреино-ного слоя (90-95%), стойко окрашиваются генцианвиолетом в сине-фиолетовый цвет и носят название грамположительных бактерий. I рамотрицательные бактерии с тонким слоем пептидогликана (5— 10%) в клеточной стенке после действия спирта утрачивают генци-аппиолет и дополнительно окрашиваются фуксином в розовый цвет. Клеточные стенки у грамположительных и грамотрицательных про-кариот резко различаются как по химическому составу (табл. 1), так и по ультраструктуре (рис. 4).

Кроме пептидогликана, в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся теихоевые кислоты (ТК), в меньшем количест­ве липиды, полисахариды, белки. Теихоевые кислоты (полифосфатные соединения) делят на два класса: 1) стеночные, связанные с пептидогликаном клеточной стен­ки; 2) мембранные (липотейхоевые), соединенные с гликолипидом цитоплазматической мембраны. ТК могут связываться с клеточными мембранами животных клеток и осуществлять процесс адгезии, не­обходимый для бактериальной колонизации, которая является пер­вой стадией большинства инфекций. Особый интерес представляет изучение явления индукции тейхоевыми кислотами воспалительных процессов, цитотоксичности и иммуносупрессии.

На поверхности клеточной стенки грамположительных бактерий могут присутствовать белковые молекулы, не образующие структур определенной формы (белок А стафилококков, М-протеин стрепто­кокков). Они обладают высокой биологической активностью, вызы­вают агглютинацию эритроцитов, являются иммунодепрессантами, угнетают фагоцитоз, комплемент, препятствуют трансформации лимфоцитов, способствуют адгезии бактерий на клетках эпителия слизистых оболочек.

Грамотринательные прокариоты имеют наружную мембрану, в состав которой входят липиды (22%), белки, полисахариды, липо-п роте иды,

Липополисахариды (ЛПС) - гстерополимеры с комплексной структурой, обладающие разнообразной биологической активно­стью. Липоидный комплекс обусловливает токсичность (воспали­тельные реакции, лихорадка, эпдотоксиновый шок), полисахарид-ньтй компонент ответственен за О-антигекспецифичность. ЛПС ин­дуцирует синтез 1« М-аитител, в иммунологии используется в каче­стве адью ванта и поликлонального активатора В-клеток.

Клеточная стенка у бактерий выполняет в основном формообра-зующую и защитную функции, обеспечивает ригидность, формирует капсулу, определяет способность клеток к адсорбции фагов.

Методика окраски по Граму

1. На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карбо­ловый раствор гепцианового фиолетового на 1-2 мин.

2. Снимают бумагу, сливают краситель и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 мин.

3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30 с.

4. Промывают водой.

5. Красят 1-2 мин водным раствором фуксина.

6. Промывают водой и высушивают.

В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Различают шаровидные (кокки), палочковидные и извитые фор­мы бактерий (рис. 5).

Шаровидные бактерии в зависимости от расположения подраз­деляют на микрококки (расположенные беспорядочно), диплококки (парное расположение), стрептококки (расположенные цепочками),стафилококки (гроздьевидные) и сарцины (формирующие пакеты). Палочковидные бактерии располагаются часто беспорядочно (эше-рихии), попарно (клебсиеллы), под углом (коринебактерии дифте­рии), цепочками (возбудитель сибирской язвы). Извитые бактерии могут быть в виде запятой (холерный вибрион) и спиралей с од­ним - тремя витками (спириллы).

Для микобактерий и нокардий характерна усложненная структу­ра клеточной стенки. Основу у них, так же как и у грамположитель­ных бактерий, составляет муреиновый каркас, однако последний связан с полисахаридами и липидами. Липиды представлены мико-ловыми кислотами, которые придают клеточной поверхности гид-рофобностъ. Гидрофобность, с одной стороны, делает клетку устой­чивой к действию различных химических веществ (такие бактерии называются кислотоустойчивыми), с другой - тормозит обмен клет­ки с окружающей средой и замедляет ее рост. Поэтому в питатель­ные среды для культивирования микобактерий туберкулеза добав­ляют поверхностно-активные вещества. Кислотоустойчивость мико­бактерий является важным диагностическим признаком, для ее оп­ределения пользуются окраской по Цилю - Нильсену.

Методика окраски кислотоустойчивых бактерий по Цилю - Нильсену

1. На фиксированный мазок помещают фильтровальную бумагу, наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на го­релке до появления паров. Операцию повторяют 2-3 раза.

2. Когда препарат остынет, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают препарат водой.

3. Препарат погружают 2-3 раза в стакан с 5% серной кислотой па 1-2 с.

4. Тщательно промывают препарат водой и докрашивают ще­лочным метиленовым синим 3-5 мин.

5. Промывают водой и подсушивают.

Кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются серной ки­слотой и сохраняют красный цвет, некислотоустойчивые теряют краситель и докрашиваются метиленовым синим в голубой цвет.

Цитоплазматическая мембрана

Цитоплазма бактериальной клетки ограничена от клеточной стенки тонкой полупроницаемой структурой толщиной 5-10 нм, называемой чшпопяазматической мембраной (ЦПМ). ЦПМ состоит из двойного слоя фосфолипидов, пронизанных белковыми молекулами (рис. 6).

С ЦПМ связаны многие ферменты и белки, участвующие в транслокации питательных веществ, а также ферменты И переносчики электронов конечных стадий биологического окисления (дегидроге-назы, цитохромная система, АТФаза). На ЦМП локализуются фермен­ты, катализирующие синтез пептидогликана, белков клеточной стенки, собственных структур. Мембрана является также местом превращения энергии при фотосинтезе, окислительном фосфорилировании.

Периплазматическое пространство

Периплазматическое пространство (периплазма) представляет собой зону между клеточной стенкой и ЦПМ. Толщина периплазмы составляет около 10 нм, объем зависит от условий среды и прежде всего от осмотических свойств раствора. Периплазма может вклю­чать до 20% всей находящейся в клетке воды, в ней локализуются некоторые ферменты (фосфатазы, пермеазы, нуклеазы и др.) и транспортные белки - переносчики соответствующих субстратов.

Мезосомы

Мезосомы представляют собой мембранные структуры, обра­зуемые при закручивании ЦПМ. Морфологически мезосомы выгля­дят как ламеллярные стопки или спирально упакованные ламеллы,. везикулярные или тубулярные структуры, а также смешанные мем­бранные системы, образованные трубочками, пузырьками и ламел-лами (рис. 7). По расположению в клетке различают: мезосомы, об-

разующиеся в зоне клеточного деления и формирования клеточной перегородки (септальные мезосомы), и мезосомы, сформированные и результате инвагинации периферических участков ЦПМ (лате­ральные мезосомы).

Рис. 7. Типы строения истинных мезосом: /- ламеллярный; 2—4 - тубулярные (Бирюзова, Поглазова, 1977)

Предполагается, что мезосомы полифункциональны, содержат различные ферментные системы и играют определенную роль в энергетическом метаболизме. Считают, что они являются сайтом для формирования клеточной стенки бактерий и прикрепления нук-лсоида в процессе репликации ДНК. Септальные мезосомы участ-иуют в построении поперечной перегородки при делении бактерий.

Цитоплазма

Содержимое клетки, окруженное ЦПМ, составляет цитоплазму бактерий. Та часть цитоплазмы, которая имеет гомогенную колло­идную консистенцию и содержит растворимые РНК, ферменты, субстраты и продукты обмена веществ, обозначается как цитозоль. Другая часть цитоплазмы представлена различными структурными элементами: мезосомами, рибосомами, включениями, нуклеоидом, млазмидами.

Рибосомы - субмикроскопические рибонуклеопротеидные гра­нулы диаметром 15-20 нм. В рибосомах находится примерно 80-К5% всей бактериальной РНК. Рибосомы прокариот имеют констан­ту седиментации 70 8. Они построены из двух частиц: 30 3 (малая субъединица) и 50 8 (большая субъединица) (рис. 8). 20

Рибосомы служат местом синтеза белка.Некоторые бактерии способны накапливать фосфорную кислоту в виде гранул полифосфата (зерна волютина, метахроматические зерна, зерна Бабеша - Эрнста). Они играют роль фосфатных депо и регулярно выявляются у коринебактерий, микобактерий и спирилл в виде плотных, хорошо контурированных образований в форме шара или эллипса, располагающихся в основном у полюсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.

Наличие зерен волютина у бактерий определяют методом Нейссера.

Метод окраски по НеЙссеру

1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 4 мин, затем сливают краску.

2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 с.

3. Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.

4. Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.

Нуклеоид

Нуклеоид - ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она циркулярно замкну­та, располагается в ядерной вакуоли, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны и митотического аппарата.

С ДНК связано небольшое количество РНК- и РНК-полимеразы. ДИК свернута вокруг центрального стержня, состоящего из РНК, и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах (1-3)-10 , константу седиментации 1300-2000 3. Молекула ДНК включает 1,6-10 нуклеотидных пар. Различия в генетическом .нитрате прокариотных и эукариотных клеток обусловливают его шгшание: у первых - нуклеоид (образование, подобное ядру), в от-ничис от ядра у вторых.

И нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная ин­формация, которая реализуется в синтезе специфических белковых молекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы реплика­ции, репарации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид в прокариотной клетке может быть выявлен в окра­шенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа. Для окрашивания ядерного вещества используется кра­ситель Фельгена, который специфически окрашивает ДНК.

Метод окраски ДНК по Фельгену

1. Мазок из культуры бактерий фиксируют 2-3 мин метиловым спиртом и помещают в холодную 1% НС1 на ! мин.

2. Подвергают гидролизу при 60 °С в 1% НС1 5-10 мин и спо-иискивают дистиллированной водой.

3. Помещают мазок в реактив Шиффа на 40-60 мин, промывают ч иодопроводной воде 2 мин.

В результате взаимодействия свободных альдегидных групп с ьгсцветной фуксинсернистой кислотой появляется фиолетовая окра-' к и, свойственная основному фуксину.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомныс генетические элементы - плазмиды. Они представляют собой замк­нуто в кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500—40 000 пар пуклеотидов и содержащие до 100 генов.

Плазмиды могут существовать в клетке и в интегрированном со-' I пинии с бактериальной хромосомой, сохраняя при этом способ-пчггь переходить к автономии.

Капсула

Капсула — слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоя­щий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла I нОирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макро­капсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебси-еллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патоген­ных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусствен­ных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов им­мунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краси­тель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативно­го контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри - Гинса

1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.

2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кро­вяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.

3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным во­дой 1:3.

4. Осторожно промывают водой, высушивают. Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Жгутики

Жгутики выполняют роль органа движения, позволяющего бакте­риям передвигаться со скоростью 20-60 мкм/с. Бактерии могут иметь один (монотрихи) или несколько жгутиков, располагающихся по всей поверхности тела (перитрихи) либо собранных в пучки (лофотрихи).

Перитрихиальное расположение жгутиков характерно для энте-робактерий, возбудителей анаэробной инфекции, столбняка, боту­лизма; монотрихом является холерный вибрион, лофотрихом -псевдомонас. У некоторых видов спирилл различают амфитрихи-альное расположение жгутиков. Толщина жгутиков в среднем со­ставляет 10-30 нм, а длина достигает 10-20 мкм.Основу жгутика составляет длинная спиральная нить (фибрил­ла), которая у поверхности клеточной стенки переходит в утолщен­ную изогнутую структуру- крюк и прикрепляется к базальной гра­нуле, вмонтированной в клеточную стенку и ЦПМ (рис. 9).Базальное тельце 1'ш', ^с). Схематическая модель базального конца жгутика Е. со!), основанная на чимсгронных микрофотографиях выделенной органеллы (Стейниер Р. и др., 1979)

Назальные гранулы имеют диаметр около 40 нм и состоят из не-• нпльких колец (одна пара у грамположительных бактерий, четыре -V грамотрицательных прокариот). Удаление пептидогликанового I ппи клеточной стенки ведет к потере способности бактерий к дви­жению, хотя жгутики при этом остаются неповрежденными.

Жгутики почти полностью состоят из белка флагеллина с неко-|п|н.1м содержанием углеводов и РНК.Под микроскопом жгутики можно увидеть лишь после специ-1ИП.ПЫХ методов протравливания и импрегнации солями серебра и (пут с последующей окраской метиленовой синью (метод Леффле-1>|1) При этом необходимо учитывать, что жгутики очень чувстви-ими.ны к различным механическим возде24фазово-контрастном микроскопах либо при светлополъной мик­роскопии при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Окраска жгутиков по Леффлеру

В основе выявления жгутиков лежит осаждение на них красите­ля, чем достигается увеличение толщины жгутиков и уменьшение их прозрачности.

1. Препарат готовят из 16-18-часовой культуры, которую вносят в 1-2 мл стерильной водопроводной воды до получения тонкой опа-лесцирующей взвеси.

2. Через 20 мин каплю суспензии наносят на поверхность чисто­го обезжиренного стекла и высушивают на воздухе.

3. Обрабатывают в течение 15 мин протравой следующего со­става: 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 25% водного раствора танина, 5 мл насыщенного водного рас­твора сернокислого железа.

4. Препарат промывают водой.

5. Окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным во­дой в соотношении 1:1, в течение 5 мин при легком подогревании.

6. Промывают водой, высушивают.

При микроскопии готового препарата жгутики видны как тонкие нитевидные структуры.

Ворсинки (фимбрии, пили)

Поверхность энтеробактерий и нескольких других микроорганиз­мов покрыта большим числом (от 10 до нескольких тысяч) ворсинок -нитевидных образований белковой природы. Как и жгутики, они по­строены из одного вида белка - пилина, субъединицы которого орга­низованны в виде полой внутри нити и берут начало от ЦПМ. Они ко­роче и тоньше жгутиков, их ширина 10-12 нм и длина до 12 мкм.

Ворсинки полифункциональны: обеспечивают трансмиссивную передачу генов (конъюгация), являются рецепторами для фагов, ор­ганом прикрепления бактерий к питательному субстрату (адгезия), участвуют в транспорте метаболитов.

У стрептококков имеется наружный слой протеиновых волосков (фимбрии), которые получили название белок М (М-протеин). Этот белок играет важную роль в процессах взаимоотношений бактерий с макроорганизмо

Споры

Некоторые бактерии в конце периода активного роста способны образовывать споры. Этому предшествуют обеднение среды пита­тельными веществами, изменение ее рН, накопление ядовитых про­дуктов метаболизма. Как правило, одна бактериальная клетка обра-чуст одну спору - локализация спор различна (центральная, терми­нальная, субтерминальная) (рис. 10).

Если размеры спор не превышают поперечного размера палоч-мжидной бактерии, то последняя называется бациллой (возбудитель сибирской язвы). Когда диаметр споры больше, бактерии имеют фор­му веретена и носят название клостридий (возбудители анаэробной инфекции). Клостридий столбняка имеют круглую спору и напоми­нают барабанные палочки. Клостридий ботулизма отличаются боль­шими овальными спорами, что придает им вид теннисной ракетки.

По химическому составу отличие спор от вегетативных клеток состоит лишь в количественном содержании химических соедине­ний. Споры содержат меньше воды и больше липидов.

Формирование спор связано с уплотнением и обособлением оп­ределенного участка цитоплазмы вегетативной клетки с последую­щим образованием внутри бактерии круглого или овального тельца,ствиям. О наличии ж! ушков можно косвенно судить по направленному характеру лпила-нмя в «висячей» и «раздавленной» капле в темнопольном и покрытого плотной многослойной оболочкой, которая пропитана большим количеством липидов, кальция, дипиколиновой кислоты (рис. 11).

После полного созревания споры вегетативная часть клетки мо­жет лизироваться. Среди патогенных микробов способностью к спорообразованию обладают только палочковидные грамположи-телъные бактерии. Большинство из них подвижно благодаря перит-рихиально расположенным жгутикам.

В состоянии споры микроорганизмы метаболически неактивны, выдерживают высокую температуру (140-150 °С), воздействие хи­мических дезинфицирующих веществ и длительно сохраняются в окружающей среде. Устойчивость к высокой температуре связана с очень низким содержанием воды и высоким содержанием дипико­линовой кислоты.

Попадая в организм человека и животных, споры прорастают в вегетативные клетки. Процесс прорастания спор включает три ста­дии; активации, начальную стадию и стадию роста. К активирую­щим агентам, нарушающим состояние покоя, относят повышенную гмисратуру, кислую реакцию среды, механические повреждения и ар ('мора начинает поглощать воду, освобождается от дипиколата мни,ция, с помощью гидролитических ферментов разрушает многие гшк'тненные структурные компоненты. После разрушения наруж­ных слоев наступает период формирования вегетативной клетки с ни I шшцирй биосинтеза, заканчивающейся делением клетки.

Окраску спор производят специальным методом, который вклю-Ч1К-1 предварительное прогревание споры, а также воздействие кон-111-111 рированных растворов красок при высокой температуре.

Метод окраски спор по Ожешко

1. Па высушенный мазок наливают 0,5 % раствор хлористоводо-ридмой кислоты и подогревают 1-2 мин.

2. Препарат промывают водой и фиксируют над пламенем го-рглки.

3. Окрашивают по Циля - Нильсену.

Споры прочно удерживают карболовый фуксин и окрашиваются и красный цвет, цитоплазма бактерий обесцвечивается 5% серной ыкмютой и после докрашивания метиленовым синим приобретает I ними цвет.

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают исполь-итлмие для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов - микроскопов. Наиболее часто применяются светлополь-11.И1 микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и нюминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологи­ческих исследований используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

Снетлопольная микроскопия осуществляется с помощью обыч­ного светового микроскопа, основной частью которого является "'"н.ектив. На оправе объективов обозначается увеличение: 8, )0, 20,

•10, 90. При исследовании микробов применяется иммерсионная сис-н-ма (объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кед-роиого масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой ч* коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается ниименыиее рассеивание световых лучей Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, со­стоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются окуляры с увеличением: 7, 10, 15 (рис. 13). Общее увеличение микро­скопа определяется произведением увеличения объектива на увеличе­ние окуляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900-1000 раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его разрешающей способности.Иод этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя тчкпми препарата, при котором они еще четко различимы под мик­роскопом. Разрешающая способность обычных световых микроско­пии с иммерсионной системой равна 0,2 мкм,

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темпом поле зрения основана на следующем принципе (рис. 14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не иоипдоют в глаза наблюдателя, поле зрения остается темным, а объ-гкг па его фоне оказывается светящимся. Это достигается с помо­щью специального конденсора (параболоид) или обычного конден-I ори, прикрытого в центре кружком черной бумаги.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу раз­давленной капли. Исследуемый материал (бактериальная культура в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным. Капля материала заполняет все пространст­во между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых не­окрашенных микроорганизмов.

Фазово-контрастная микроскопия

При прохождении пучка света через неокрашенный объект из­меняется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринима­ется человеческим глазом, Чтобы изображение стало контрастным, необходимо превратить фазовые изменения световой волны в види­мые амплитудные. Это достигается с помощью фазово-коятрастного конденсора и фазового объектива (рис. 15).

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный шн.ектиа с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждо-|«| пГп.ектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, ко-п»1»ун) получают нанесением солей редкоземельных элементов на исн.ектив. Изображение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фнишой пластинки соответствующего объектива.

Фачово-контрастная микроскопия значительно повышает контра-г I иость объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некото­рых иеществ под влиянием падающего на них света испускать лучи 1 чругой (обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Та­ни- нещества называют флюорохромами (акридиновый желтый, ФМТЦ, родамин и др.). Объект, обработанный флюорохромом, при • ч т-щеп и и ультрафиолетовыми лучами приобретает яркий цвет в М-М1ЮМ поле зрения.

Основной частью люминесцентного микроскопа является осве-|Ц ими,, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильт-(«111 к нему (рис. 16). Очень важно использование нефлюоресцентно-1ч иммерсионного масла.Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для индикации и идентификации возбудителей инфек­ционных заболеваний с помощью реакции иммунофлюоресценции.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры которых меньше этой величины, находятся за пределами разре­шающей способности светового микроскопа. В электронном микро­скопе вместо световых волн используются электронные лучи, обла­дающие чрезвычайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью

В качестве источника электронных лучей применяют электрон­ную пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электрическим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пу-ш 'электронов находится электрическое поле высокого напряжения. 'Олектронный поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через объект, части которого имеют различную толщину,

•электроны будут соответственно задерживаться, что проявится нажране участками затемнения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания (пативные препараты), напыления при помощи тяжелых металлов, ультратонких срезов, метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить са­мые мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты размером 0,002 мкм.

МОРФОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ГРУПП ПРОКАРИОТ

Актиномицеты (от греч. - астютусез луч, тукез - гриб) пред­ставляют своеобразную группу бактерий, имеющих вид несептиро-ваиных ветвящихся нитей длиной от 50 до 600 мкм и диаметром от О, 2 до 1-2 мкм, названных гифами. Скопление гифов называют пш-щ'.шем. Мицелий развивается из небольшой почки, которая посте­пенно вытягивается в палочку, а затем в короткую нить с боковыми ответвлениями. Сходство с грибами чисто внешнее, так как актино­мицеты имеют прокариотический тип клетки с наличием клеточной стенки, не содержащей хитина и целлюлозы. В состав пептидогли-кана могут входить галактоза, арабнпоза, ксилоза и другие сахара, не характерные для остальных бактерий и позволяющие дифферен­цировать актиномицеты. Актиномицеты грамположительны, многие формы кислотоустойчивы, некоторые актиномицеты вокруг нитей имеют капсулу. Культуральная форма актиномицетов формирует субстратный мицелии, образующийся в результате врастания мицелия в питаальную среду, и воздушный, растущий на поверхности среды (рис. 18). В пораженных тканях (тканевая форма) актиномицеты мо­гут образовывать друзы-гранулы из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходящих от центра и заканчивающихся колоовидньь ми утолщениями.

Актииомицеты размножаются бесполым путем, образуя конидии или спороносны со спорангиями на концах воздушного мицелия. Спороносны могут быть прямыми, волнистыми, спиральными, спо­ры- овальными, круглыми, цилиндрическими, с гладкой поверхно­стью или шипами, иногда подвижными за счет жгутиков (зооспоры). Споры служат для размножения актиномицетов, они не термостойки, но выдерживают высушивание. Кроме того, возможны почкование и фрагментация мицелия на палочковидные или кокковидпые формы.Актиномицеты широко распространены в природе, обитают в иоде, почве богатой перегноем. Они участвуют в круговороте ве­ществ в природе. Отдельные виды актиномицетов используются как продуценты антибиотиков,.витаминов, липидов, протеаз, аминокис­лот, стероидов.

Актиномицеты, являясь симбионтами человека и животных, присутствуют в строме зубного камня, слюнных железах, криптах миндалин, в камнях мочевых и желчевыводящих путей.

Актиномицеты относятся к порядку АсшютусеЫез, включаю­щему семейства: Ас1тотусе1асеае, МосагсНассае, 81гер1отусе1асеае, МусоЬайепасеае.Патогенные для человека виды встречаются среди представите­лей семейств Асйпотусе1асеае и МосагсИасеае. Первые имеют вид длинных или коротких разветвленных палочек, не образующих воз­душного мицелия. Они являются возбудителями актиномикоза че­ловека и образуют друзы в пораженных тканях.Представители семейства МосакНасеае напоминают микобакте-рии, имеют нитевидную форму клеток и образуют на питательных средах воздушный и субстратный мицелий. Гифы фрагментируются на кокковидные и палочковидные клетки. Патогенные нокардии вызывают нокардиоз.Некоторые представители семейства Зп-ерСотусе1асеае вызыва­ют у человека кожные мицетомы.Семейство МусоЪасСепасеае отличается рядом особенностей от истинных актиномицет. Обычно это тонкие, искривленные палочки 2,5-7,0 мкм в длину, не образующие мицелия и ветвящиеся в моло­дой культуре. Микобактерии кислотоустойчивы в связи с присутст­вием в клеточной стенке миколовых кислот. Вызывают у человека туберкулез.

Методы исследования. Учитывая особен­ности роста актиномицетов, мазки из культуры на плотной среде готовят особым способом. Препаровальной иглой отделяют не­большой участок колонии и помещают в каплю воды на предмет­ное стекло, покрывают вторым предметным стеклом и, слегка прижимая, раздавливают мицелий. Из полученного материала пет­лей обычным способом готовят мазки, окрашивают по Граму и Цилю - Нильсену. Друзу извлекают из патологического материала петлей, помещают в каплю воды на предметное стекло, слегка придавливают покровным, затем вводят под стекло каплю щелочного раствора метиленового синего и микроскопируют с сухим объективом, можно использовать фазовый контраст.

Спирохеты

Спирохеты (креп'а - изгиб, сЬаНе - волосы) - спирально извитые, обладающие активной подвижностью бактерии. Размеры спирохет колеблются в толщину от 0,1 до 0,3 мкм, в длину- от 7 до 500 мкм. Движения разнообразные - от винтообразных до сгибательиых. Элек­тронно-микроскопическое исследование позволило различить у спи­рохет протоплазматический цилиндр (тело клетки), аксиальную (опорную) нить и трехслойную наружную оболочку. Аксиальная нить находится в периллазматическом пространстве между наружной обо­лочкой и протоплазматическим цилиндром и состоит из отдельных фибрилл (эпдофлагелл), число которых у разных видов различно: у трепонем и лептоспир - 3-4; у боррелии - до 30. Каждая из фибрилл (эндожгутиков) закрепляется в области прикрепительных дисков на концах нротоплазматичсского цилиндра и тянется к противополож­ному его концу, обвивал его и заканчиваясь свободно. Химический состав фибрилл аналогичен составу жгутиков (рис. 19).

В протоплазматическом цилиндре содержатся: нуклеоид, рибо-сомы, мезосомы, включения. Наружная оболочка (клеточная стенка) содержит тонкий слой пептидогликана, эластична и не обладает ри­гидностью. Эндоспор, капсул и экзожгутиков эти бактерии не обра­зуют, грамотрицательны, в мазке располагаются беспорядочно.

Спирохеты относятся к порядку Зрп'ОсНаеЫез, семейство 8р1го-спаеШсеае, которое включает три рода:

1. ВоггеНа - имеет 3-10 неравномерных отлогих завитков, концы заострены, длиной 10-30 мкм. Движение толчкообразное, по Рома-чозскому - Гимзе окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (предста­витель ВоггеНа гесиггеп11§ вызывает эпидемический возвратный тиф; ВоггеНа Ьиг§с!ог1-еп вызывает лаймоборрелиоз).

2. Тгеропета - имеет 8-14 туго закрученных, одинаковых по амплитуде завитков длиной 5-15 мкм. Движение плавное, медлен­ное, с вращением вокруг продольной оси. По Романовскому- Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет (представитель Тгеропета раШс1ит - возбудитель сифилиса).

3. Ьерю<;р]га- имеет до двух десятков мелких частых завитков, за­канчивающихся крючком с пуговчатым утолщением, длиной 5-15 мкм. Движение очень активное, поступательное, перемещение вперед, сгибание и вращение вокруг оси. По Романовскому- Гимзе окра­шиваются слабо в розовато-сиреневый цвет (представитель ЬерЮ-1п1егго§ап5 - возбудитель лептоспироза).

Методы исследования. В живом состоянии спирохеты изучают в фазово-контрастном и темнопольном микро­скопах, наблюдая за активным характерным движением спирохет, особенностями их формы.

Готовят препараты по Бурри (па темном фоне препарата стано­вятся видимыми светлые извитые нити спирохет), окрашивают по Романовскому - Гимзе, по методу Морозова.

Микоплазмы

Микоплазмы - самые мелкие прокариоты (125-150 нм), способ­ные самостоятельно размножаться. Полагают, что микоплазмы яв­ляются наиболее близкими потомками исходных прокариотичсских клеток. Геном микоплазм минимален для клетки, он в 5 раз меньше генома кишечной палочки и составляет 0,45 МД. Главная особен­ность микоплазм - отсутствие клеточной стенки. Они окружены капсулоподобным слоем, под которым находится лишь тонкая трех­слойная мембрана толщиной 7,5-10 нм, содержащая в значительном количестве холестерин. Вследствие этого микоплазмы выделяют в особый отдел Тепепсп^ез, класс МоШсте^ («нежная кожа»), порядок Мусор1азта1:а]ез.

Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы (рис. 20) осмо­тически чувствительны и имеют разнообразную форму:

а) мелкие сферические или овоидные клетки размером 0,2 мкм (элементарные тельца), которые фильтруются через бактериальные фильтры;

б) более крупные шаровидные размером до 1,5 мкм;

в) нитевидные, ветвящиеся клетки размером до 150 мкм.

Микоплазмы не образуют спор, жгутиков, некоторые виды об­ладают скользящей подвижностью.

Размножаются путем бинарного деления шаровидных и ните-нидиых клеток, почкования и высвобождения множества элемен-I арных телец, образующихся в нитях.

Для микоплазм характерна уникальная для прокариот потреб­ность в стеролах (холестерине). Холестерин стабилизирует мембра­ну микоплазм. В инфицированных тканях микоплазмы являются па­разитами мембран эукариотических клеток и способны персистиро-нать на них долгое время.

Что касается энергии, то микоплазмы получают ее обычным для факультативных анаэробов способом, ферментируя углеводы или аминокислоты. Вследствие малого генома микоплазмы обладают ограниченными биосинтетическими способностями, и их приходит­ся культивировать на питательных средах, обогащенных липидами, белками, предшественниками нуклеиновых кислот. Растут медлен­но, колонии с плотным, врастающим в среду центром, напоминаю­щие «яичницу-глазунью» (темный центр и более светлая ажурная периферия). Размеры колоний мелкие, не превышающие 600 мкм (рис. 21).

Большинство микоплазм являются безвредными комменсалами слизистых оболочек глаз, дыхательных, пищеварительных и моче­половых путей человека.

В патологии человека наибольшую роль играют несколько пред­ставителей рода Мусор1азта: М. рлсшпошае, М. Ъогшшз, М. атЪпИ-сНк и единственный вид рода 1_)геар1а5та - и. игеа1у11сит (названный так из-за уреазной активности). Патогенные микоплазмы вызывают заболевания (микоплазмозы) дыхательных, мочеполовых путей и суставов с разнообразными клиническими проявлениями. При лече­нии этих заболеваний следует помнить, что микоплазмы не чувстви­тельны к- бета-лактампым антибиотикам и другим лекарственным препаратам, угнетающим синтез клеточной стенки (из-за ее отсутст­вия у возбудителя).

Методы исследования. В световом микроскопе обнаруживаются лишь самые крупные формы микоплазм. В живом состоянии их изучают в темнопольном и фазово-контрастном мик­роскопах, ультраструктурные компоненты выявляют при помощи электронной микроскопии.

Риккетсии

Риккетсии - мелкие (0,35-1,0 мкм) грамотрицательные, поли­морфные бактерии, являющиеся облигатньши внутриклеточными паразитами.

Риккетсии разнообразны по форме, выделяют следующие их тины:

1) кокковидные одпозернистые (до 0,5 мкм);

2) палочковидные двухзсрнистые (1-1,5 мкм);

3) бациллярные трех-четырехзернистые (3-4 мкм);

4) нитевидные многозернистые (1СМЮ мкм).

Зерна (нуклеопротеиды) обнаруживаются при окраске по Рома­новскому - Гимзе. Все формы взаимообратимы. Структурно имеют все компоненты бактериальной клетки: клеточную стенку, липоид-пуго капсулу, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, пили. Риккетсии со­держат как ДНК, так и РНК, большое количество фосфолипидов, содержание углеводов невелико.

В большинстве случаев (кроме вида ЯоспаНтаеа цшпШпа) кусственных питательных средах риккетсии не растут. Жизненный цикл риккетсии зависит от жизнедеятельности клетки-хозяина и складывается из двух стадий: вегетативной и покоящейся (элемен­тарные тельца). Риккетсии, находящиеся в вегетативной стадии

активно размножаются путем бинарного деления и обла­даю! активной подвижностью, по-видимому обусловленной жгути-ноными структурами. Риккетсии покоящейся стадии (элементарные кмьца) имеют сферическую форму и неактивны,

Риккетсии способны к биосинтезу белка, но не могут самостоя­тельно получать макроэргические соединения, поэтому их можно назвать «энергетическими паразитами» клеток-эукариотов. В связи с 1тим для культивирования риккетсии обычно заражают куриные эм­брионы в желточный мешок (метод Кокса), культуры клеток, в ко-юрых немногие виды риккетсии образуют, как и вирусы, тельца включений. Реже заражают чувствительных лабораторных живот­ных - морских свинок, белых мышей.

Порядок КлскеП51а1ез включает виды патогенные для теплокров­ных животных и человека, переносчиками служат вши, блохи, кле­щи. Заболевания называются риккетсисшми. Большинство болезне­творных для человека видов риккетсий входит в состав семейства ЯюкеЫасеае, роды Шскеп^а, КосИаНтаеа, Сох1е11а, вызывая эпи­демический сыпной тиф (КлскеПз1а рго\уагекн), Ку-лихорадку (Сох1е11а ЪигпеШ), волынскую лихорадку (КоспаНтаеа дянтапа), ли­хорадку цуцугамуши (ЯгсЬеНзта 15и15и§ати5Ы) и др. Паразитирую­щие виды ассоциированы с ретикулоэндотелиальными клетками и клетками эндотелия сосудов или эритроцитами.

Методы исследования. Риккетсий хорошо ок­рашиваются по Романовскому- Гимзе в сиреневый цвет, по Моро-зову (методом серебрения) - в черный цвет.

Для дифференциации риккетсий применяется метод окраски, предложенный П.Ф. Здродовским:

1. Тонкие фиксированные мазки окрашивают водным карбол-фуксином (из расчета 10 кап. карболового фуксина Циля на 10 мл фосфатного буфера рН - 7,4) в течение 5 мин.

2. Мазок промывают водой и обрабатывают 0,5% раствором ли­монной кислоты (1-3 с).

3. Хорошо промывают водой и докрашивают 10 с 0,5% водным раствором метиленового синего.

4. Промывают водой и высушивают.

Риккетсий окрашиваются в рубиново-красный цвет и легко об­наруживаются на фоне голубой цитоплазмы и синего ядра клеток.

Хламидии

Хламидии - неподвижные, облигатно паразитические, кокко-видные бактерии. Размножаются только внутри связанных с мем­браной вакуолей в цитоплазме клеток человека, млекопитающих, птиц. Членистоногие не служат хозяевами или переносчиками. Раз­множение происходит в ходе уникального цикла развития. Основ­ными стадиями жизненного цикла хламидий являются:

1) элементарные тельца - мелкие (0,2-0,5 мкм) электронно-плотные шаровидные структуры, лишенные метаболитной активно­сти, имеющие компактный нуклеоид и ригидную клеточную стенку, которые фильтруются через бактериальные фильтры. Они являются инфекционным началом хламидий, обеспечивают их выживание во внеклеточной среде и заражение новых клеток;

2) ретикулярные тельца - более крупные (0,8-1,5 мкм) сфериче-» кис образования, имеющие сетчатую структуру с тонкой клеточной 1 гсмкой и фибриллярным нуклеоидом. Они вырастают из элементар­ных телец внутри клеток, лишены инфекционности и, подвергаясь де-ш'пию, обеспечивают репродукцию хламидий. Отсюда другое (исто­рически первое) название ретикулярных телец - «инициальное тело». Ретикулярные тельца являются вегетативной формой хламидий;

3) промежуточные тельца - промежуточная стадия между эле­ментарными и ретикулярными тельцами.

Жизненный цикл хламидий начинается с того, что элементарные кчп.ца фагоцитируются клеткой-хозяином, а затем в течение не­скольких часов реорганизуются, увеличиваются в размерах и пре-ирашаются в ретикулярные формы, которые размножаются путем поперечного деления. Жизненный цикл заканчивается, когда возни-ыпощие промежуточные формы уплотняются, уменьшаются в раз­мерах и превращаются в элементарные тельца. Размножаясь внутри ннгоплазматических вакуолей, хламидий образуют микроколонии включения), окруженные мембраной. В составе микроколоний об­наруживаются все три стадии развития хламидий. После разрыва » н'нки вакуоли (везикулы) и мембраны клетки-хозяина вновь обра-нншшиеся хламидий высвобождаются и элементарные тельца, ин­фицируя другие клетки, повторяют цикл развития. В оптимальных условиях роста в эукариотических клетках жизненный цикл хлами-Н1111 составляет 17-40 ч (рис. 23).

Хламидии хорошо размножаются в желточном мешке куриного «мОриона при температуре от 33 до 44 °С, а также в культурах кле-нпс различных позвоночных. Зависимость хламидий от клеток-•укариотов объясняется их неспособностью аккумулировать и ис-Иош.човать энергию, так как они не могут синтезировать АТФ, В мом отношении хламидий похожи на риккетсий, в связи с чем эти микроорганизмы также называют энергетическими паразитами.9-10 ч 20чСвоеобразие хламидий проявляется и в строении их клеточной стенки. Она лишена пегттидогликана и представляет собой двух­слойную мембрану, ригидность которой определяют пептиды, пере­крестно сшитые дисульфидными мостиками. В остальном хламидий напоминают грамотрицательные бактерии, так как содержат глико-липиды, сходные с липополисахаридами Порядок СЫаптусНа1е5 включает одно семейство СЫатуоласеае с единственным родом СЫатуШа. Для человека патогенны виды С. Ц-асЬотайз, С. рзйГаЫ, С. рпеитошае. Хламидий вызывают у людей заболевания глаз, дыхательной и мочеполовой систем и объединя­ются под общим названием «хламидиозы».Методы исследования. Для микроскопиче­ского обнаружения телец включений (микроколоний) хламидий в инфицированных клетках (тканях) применяют различные методы окрашивания: Романовского- Гимзы, Маккиавелло и др. При окра-тиканий по Романовскому- Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Кроме того, хламидий хорошо видны и в неокра­шенном состоянии при микроскопии влажных препаратов под стек-ном с помощью фазово-контрастпой оптической системы. В послед-иге время наиболее часто используется прямая реакция иммуиоф-июоресценции, окраска - акридиновым оранжевым.

Грибы

Грибы (тип Мусора, МусеТез, РипеО представлены одноклеточ­ными или многоклеточными эукариотами, которые по наличию хи-мша в оболочке, стеролов в цитоплазматической мембране и глико-м-па в цитоплазме напоминают клетки животного происхождения, а мп наличию клеточной стенки, состоящей из гтолисахаридов, близ­ких к целлюлозе, способности к неограниченному росту, размноже­нию спорами, неподвижностью в вегетативном состоянии - растения.

У грибов существует два типа роста: гифальный (гифомицеты) и пцижжевой (бластомицеты). Обычно вегетативное тело гифомице-|пи состоит из нитей толщиной около 5 мкм, сильно разветвленных и называемых гифами. Гифы либо не имеют поперечных перегоро-шч( (у низших грибов), либо разделены перегородками (септами) на метки (у высших грибов). Стенка клеток может быть различной мниципы, часто хорошо видна двухконтурность; среди включений в цитоплазме наиболее характерны зерна волютина, гликогена, пиг­мента меланина. Зрелые старые клетки грибов богаты липидами. Ядро содержит ядрышко и хроматиновую сеть, клетки могут быть мппгоядерными. Совокупность гифов образует мицелий (грибницу). Мицелий может быть субстратный, образующийся в результате мрлстания гифов в питательную среду, и воздушный, растущий на ппперхности среды. Мицелий представляет собой ветвящиеся труб­ки, петвленис осуществляется боковыми выростами гиф. Перепле-ыющиеся гифы с толстыми оболочками образуют склероции - ок-рупше или неправильной формы скопления размером от долей миллиметра до нескольких сантиметров, предназначенные для вы-'мшнния в неблагоприятных условиях. Концевые нити некоторых грибов образуют обильные ветвления, по внешнему сходству на­званные «рогами оленя», «канделябрами», «булавами», «спираля­ми», «дубинками». По ходу мицелия встречаются узловатые органы различного размера и формы - результат сплетения первичных и вторичных ветвей вокруг материнской ветви. Мицеальные нити иногда располагаются параллельными рядами, тесно прилегая друг к другу и напоминая фитиль, отсюда и название «коремии» (у дер-матофитов).

У большинства грибов, имеющих медицинское значение, обна­руживаются разнообразные конидии (экзоспоры), являющиеся фор­мами бесполого размножения (рис. 25). Они могут образовываться на специальных конидиофорах (конидиеносцы), а также по бокам и на концах обычных септированных гиф. Мелкие одноклеточные ко­нидии называются микроконидиями, а крупные, нередко многокле­точные- макроконидиями. Наиболее частыми типами конидий яв­ляются следующие типы спор:

1) бластоспоры - образуются в результате почкования, путем от­деления почки от родительской клетки, наблюдаются у дрожжевых и дрожжеподобньтх грибов;

2) хламидоспоры - гифальные клетки увеличиваются, у них об­разуется толстая оболочка;

3) артроспоры - образуются в результате фрагментации гиф на отдельные клетки, встречаются у дерматофитов, дрожжеподобных грибов, возбудителя кокцидиоза;

4) конидиоспоры - возникают на дифференцированных кони­диофорах (конидиеносцах) или располагаются по бокам и на концах любой ветви грибницы, прикрепляясь к ней непосредственно или тонкой ножкой (споротрихумь.1). Конидиеносцы состоят из веточек первичного, вторичного или третичного порядка. На продолговатом или расширенном конце конидиеносца располагаются более корот­кие столбики (стеригмы), от которых отпочковываются характерные для данного вида конидии, располагающиеся цепочками, придавая конидиеносцу вид кисточки. Форма конидий круглая или овальная, реже грушевидная, стенка бесцветная или темноокрашенная. Кони­дии развиваются на воздушном мицелии, который за счет этого ста­новится мучнистым и пигментированным. Конидиоспоры характер­ны для аскомицетов;

5) спорангиоспоры - располагаются на вершине спорангиеносца в специальных органах (спорангиях). Они являются эндоспорами и при разрыве стенки спорангия, попадая в благоприятные условия,

прорастают, образуя мицелий. Спорангиоспоры наблюдаются у му-кпровых грибов.

Половое размножение обнаружено у патогенных грибов классов ЛкеотусеШз и 2у§отусе1ез (рис. 26), при этом образуются следую­щие разновидности спор:

1)аскоспоры - возникают в сумках (асках), развивающихся в специальных плодовых телах - аскокарпах дисковидной (апотеции) ими сферической формы (клсйстотеции). Количество аскоспор в сумке варьирует от 4 до 16 и больше. Размеры аскоспор составляют п! 2 до 50 мкм. Они имеют цилиндрическую, веретенообразную, гш монообразную или чечевицеподобную форму. Свойственны сум­ма гым грибам - аскомицетам;

2) зигоспоры - у некоторых зигомицетов верхушки расположен­ных близко к друг другу гиф сливаются, происходит мейоз и обра­зуются крупные зигоспоры с толстыми стенками;

3) базидиоспоры - после мейоза на поверхности особой клетки, называемой базидйумом, на вершине каждой из четырех стеригм развивается по одной круглой или удлиненной базидиоспоре, что характерно для базидиомицетов.

Рис. 26. Половые споры грибов: 1 - зигоспоры; 2 - аскоспоры; „? - базидиоспоры (Катким Н.П., 1 979)

Как уже отмечалось, кроме гифальных форм грибов существуют и бластомицеты (дрожжевые и дрожжеподобные грибы). Они пред­ставляют собой сферические, овоидные или грушевидные формы размером 3-15 мкм. Эти клетки содержат включения гликогена, во-лютина, липиды, они способны к почкованию, бинарному делению, в результате которого клетки не распадаются, а образуют псевдоми-целии.

Для многих видов грибов может быть характерен диморфизм, то есть гифальная форма роста может переходить в дрожжеподобную, что чаще наблюдается в пораженных тканях человека (например, возбудители гистоплазмоза и бластомикоза).

Ни один из описанных выше морфологических элементов не яв­ляется характерным для того или иного гриба. Комплексом разно­образных клеточных элементов определяется большой полимор­физм грибов в культурах на различных питательных средах. Ткане­вые формы грибов обычно представлены довольно однообразными спорами или мицелием, совсем не похожими на культуральные эле­менты грибов.

Классификация грибов разработана недостаточно, в основе ле­жат морфоструктурная организация и способ размножения. Заболе­вания (микозы) у человека вызывают около 500 видов грибов. Их принято называть паразитическими, или патогенными, грибками.

Различают следующие классы, содержащие патогенные формы грибов:

1. 2у§отусеЕез -зигомицеты. Мицелий несептированнный, мно-тядерный. Имеют особый тип полового процесса - зигогамию, представляющую слияние недифференцированных на гаметы кле-тк. Образующаяся зигоспора покрывается толстой оболочкой и прорастает после периода покоя. Бесполое размножение осуществ-ияется спорангиоспорами (эндоспоры) или конидиями (экзоспоры). ('норы формируются в спорангиях на верхушке спороносцев. К порядку Мисога1ек к семейству Мисогасеае относится род Мисог (Мпсог гтшседо), для которого характерны шаровидные спорангии, ('поры гладкие, бесцветные или слабо окрашенные, яйцевидные. Конидии отсутствуют. Головчатая плесень может вызывать у че-иовека поражение легких, среднего уха и общий инфекционный процесс.

2. АзсотусеСез - аскомицеты. Сумчатые грибы с многоклеточ­ным септированным мицелием. При половом процессе размножа­ются аскоспорами (споры развиваются в особых сумках - асках). 1>ссполое размножение осуществляется конидиями. К порядку 1Мео1азса1ез к семейству Лзрег^Шасеае относится род АзрегёШш (Л8рег§П1из т§ег, АзрегдШиз Яауиз). Конидиеносцы прямостоящие, на концах шаровидное вздутие, несущее стеригмы, которые распо­ложены радиально на поверхности всего вздутия (вид струек воды из лейки). «Леечная» плесень у человека вызывает аспергилез лег­ких, уха, глаз и других органов и тканей. Род РешсШшт («кисте-пик») имеет многоклеточные конидиеносцы, которые разветвляются II верхней части и заканчиваются стеригмами, расположенными в ииде кисточек. От стеригм отшнуровываются конидии, одноклеточ-111>ге, круглые или овальные, в массе часто зеленоватого цвета. ('троение кисточки у различных видов пенициллов различно, оно положено в основу систематики рода. К семейству ХаспаготусеШсеае относятся дрожжи (род ЗасЬаготусез) и дрожже­подобные грибы (род СашШа). Дрожжевые клетки имеют округлую, пиальную или вытянутую форму размером 8-10 мкм, двухконтур-муго оболочку. В цитоплазме отмечаются включения в виде гранул гликогена, волютина, липидов. Размножение происходит почкова­нием и аскоспорами. Грибы СапсН<За сходны с истинными дрожжа­ми, отличием служат отсутствие аскоспор и способность к образо-1шшю псевдомицелия. При образовании псевдомицелия клетки вы­тягиваются в длину и соприкасаются узким основанием. Они вызы-пают кандидозы, которые развиваются у больных людей при резком снижении резистентности организма и длительном применении ан­тибиотиков.

3. Класс Пеи1еготусе1:е5 (Рип§1 ппрег&с!!) - несовершенные гри­бы, имеют многоклеточный мицелий. Бесполое размножение осу­ществляется конидиями или оидиями, образующимися в результате распада гиф на отдельные клетки. У некоторых дейтеромицетов ко­нидии отсутствуют, и такие виды образуют склероции. Половой процесс отсутствует, весь жизненный цикл проходит в гаплоидной стадии. У некоторых видов установлена связь с аскомицетами и ба-зидиомицетами. Особый интерес представляют возбудители дерма-томикозов: фавуса, трихофитии, эпидермофитии, микроспории.

Кроме микозов, грибы могут вызывать микотоксикозы. В на­стоящее время изучено около 300 видов микотоксинов (афлотоксин, охратоксин, мускарин, лизергиновая кислота и др.). Микотоксины вызывают у человека сильные пищевые отравления, острые гепати­ты, они обладают нефротоксичностью, многие из них канцерогенны и тератогенны.

В микробиологической промышленности грибы используются как продуценты органических кислот (лимонной - Азрег§Шш пщег), ферментов (амилаз - АзрегдШиз огугае; пектиназ - Азрег§Ши8 ау/апоп; каталазы - РешсШшт уИа1е и др.), липидов, антибиотиков (пенициллина - РешсШшт поМшп; гризеофульвина - РешсШшт §Л5еоги1уит), а также в пищевой промышленности (например, для созревания сыров рокфор и камамбер, получения вина, спирта, при хлебопечении и т.д.).

Методы исследования. Для микроскопическо­го исследования готовят как неокрашенные (нативные), так и ок­рашенные препараты.

Исследование неокрашенных препаратов

Чтобы яснее различить элементы грибка, производят просветле­ние препарата. Для этого патологический материал (корочки, кусоч­ки ногтя, волос, соскобы со слизистых, содержимое гранулематоз-ных очагов) помещают на часовое стекло или чашку Петри, куда на­ливают 10-15 % раствор едкого натрия или калия и ставят в термо­стат при 37 °С на 20-30 мин. Затем материал извлекают и помещают в каплю 50 % раствора глицерина на предметное стекло и закрыва­ют покровным стеклом, исследуют в фазово-контрастном или све­товом микроскопе. Можно использовать другой метод - на патолоноский материал наносят каплю глицерина с добавлением 10% ед­ино калия и микроскопируют 4-5 мин, закрыв покровным стеклом.

Гной из абсцессов, содержимое язв, мокроту разбавляют физио-мотческим раствором, или водно-спиртовым (1:1), или 50% водным рщ-пюром глицерина, готовят препарат «раздавленная капля» и рас­сматривают при увеличении х200, х400, используя фазовый контраст.

Исследование окрашенных препаратов

Из гноя, крови, ликвора, осадка бронхиальных смывов и мочи 10ЮВЯТ тонкие мазки, которые фиксируют в смеси Никифорова, Кпрнуа, спирт-формоле, высушивают и окрашивают.

Окраска пактофуксином, содержащим кислого фуксина 0,1 г, молочной кислоты - 100 мл. Окрашивают в течение 3-5 мин. Фон препарата розовый, мицелий опалесцирует голубым цветом. Хоро­шо окрашиваются грибы при мукормикозе и аспергилезе.

Окраска лактофенолом. Мазок заливают на 30-60 мин смесью, содержащей 2 части глицерина и по 1 части карболовой, молочной кислот и дистиллированной воды. При добавлении 5% раствора 1'ипьки грибки окрашиваются в голубой цвет. При этом мазки фик­сируются и окрашиваются одновременно.

Окраска по Романовскому - Гимзе. Краску, разведенную в дис­тиллированной воде (1-2 капли краски на 1 мл воды), наносят на фиксированный смесью Никифорова мазок и оставляют на 30-60 мин. Промывают водой и высушивают. Окраску применяют при исследовании возбудителей кандидомикоза, гистоплазмоза, крип-нжоккоза. Дрожжевидные клетки окрашиваются в розово-фиолетовый цвет, хроматиновые включения - в красный, волю-тин - в фиолетовый.Кроме того, мазки можно окрашивать по Граму, Цилю- Ниль­сену (модификация Раусона), 1 % водным раствором метиленового синего, гематоксилин-эозином, по Мак-Манусу (Шик-реакция).

Для изучения грибков в тканях проводится патогистологическое исследование. Для этого готовят парафиновые или целлоидиновые срезы (толщиной 1-3 мкм), которые окрашивают, обезвоживают, просветляют и заключают в канадский бальзам.

Простейшие

Простейшие- одноклеточные эукариоты, близкие по строению к клеткам сложно организованных животных. Это целостный орга­низм, выполняющий все функции, которые свойственны живым су­ществам. Большинство простейших имеет размеры от 30 до 150 мкм. Форма может быть грушевидной (трихомонады, лямблии), яйцевидной (балантидий), веретенообразной (трипаносомы, лейшма-нии), могут принимать самую причудливую конфигурацию (амебы) (рис. 27). Клетки простейших, как у всех эукариот, содержат ядро (иногда несколько), цитоплазму, мембрану (оболочку), которая обычно уплотняется, в результате чего образуется пелликула. Кроме органелл общего значения (рибосомьт, митохондрии, лизосомы, эн­доплазм атичес к ая сеть, аппарат Гольджи), имеются специфические • органеллы. Так, у лямблий это две эластичные нити - аксостиль и присасывательный диск; у трихомонад и трипанасом - ундулирую-щая мембрана; у токсоплазм - коноид и система микротрубочск; у балантидия - подобие ротовой полости (цитостом) и анальная пора (цитопрокт), сократительные вакуоли, микропуклеус.

Большинство простейших подвижно и передвижение осуществ­ляет с помощью псевдоподий (амебы, малярийный плазмодий), жгу­тиков (лямблий, лейшмании), ресничек (балантидий).

Псевдоподии - временные выпячивания цитоплазмы, выпуская их, простейшие все время меняют форму тела.

Жгутики — длинные тонкие выросты, состоящие из 1 ] фибрилл, из которых 2 центральные и 9 периферические.

Реснички - по строению сходны со жгутиками, но, в отличие от них, короткие и работают наподобие весел.

Простейшим свойственны определенные жизненные циклы, во время которых при неблагоприятных условиях вегетативные формы превращаются в цисты. Простейшее округляется, теряет подвиж­ность и покрывается двухконтурной плотной оболочкой. Особенно­сти формы и строения цисты имеют диагностическое значение. Так, зрелая циста дизентерийной амебы имеет размер 8-14 мкм, округ­лую форму и 4 ядра; цисты лямблий овальные и четырехядерные, в них виден аксостиль со жгутиками, у балантидия цисты крупные -30-60 мкм, овальные, с бобовидным ядром.

Простейших относят к царству Рго1охоа (ргоЮз- первый , гоа -животные). Медицинское значение имеют;

1. Тип 5агсота5(1§орпога, подтип ЗагсоШпа (саркодовые). Тело их лишено пелликулы, передвигаются с помощью псевдоподий. К этому классу относят различные виды амеб, в том числе дизенте­рийную амебу (Еп^атоеЬа Ыз1;о1упса).

2. Тип 8агсотазп'§орЬога, подтип МакйёорЬога (жгутиконосцы). Имеют тонкую пелликулу и снабжены жгутиками для передвиже­ния. Из паразитических простейших в этот подтип входят трипано­сомы (Тгурапозота §атЫсше), лямблий (СлагсНа 1атЬНа), лейшма-

(Ье1зпташа ёопоуат, Ье1зпташа 1гор1са), вызывающие соответ-| I пенно африканскую сонную болезнь, лямблиоз, лейшманиоз.

.V Тип СПюрЬога (реснитчатые, инфузории). Тело покрыто пел-чикулой со множеством коротких ресничек, при помощи которых инфузории передвигаются. Паразитическим представителем этого киисса является балантидий (Ва1апг1ашт соН), вызывающий балан-шдиаз.

4. Тип Ар1сотр1еха, класс Зрогогоа (споровики). Класс состоит исключительно из паразитических простейших. Передвигаются они при помощи псевдоподий или жгутиков, Последние образуются при половом размножении у микрогамет отрядов гемоспоридий и кок-индий. В состав класса входят 4 вида малярийных плазмодиев (1'ЬмпосНшп у1уах, та!апае, оуа!е, таИс!рашт), вызывающих маля­рию (рис. 28), токсоплазма (Тохор1азта §опсШ), вызывающая токсо-мчазмоз.

Методы исследования. Для изучения про-гк-йших готовят временные (нативные) и постоянные (окрашенные) Р аз д

препараты, Нативные препараты готовят, методом «раздавленной капли» либо «висячей капли» с добавлением теплого физиологиче­ского раствора или витальных прижизненных -красителей: трипано-вого синего (разведение 1:5,000), нейтрального красного (разведе­ние 1:200,000). При микроскопии нативных препаратов обращают внимание на форму, особенности движения про'стейших, наличие включений, при этом используется малое (х8) или большое^увеличе-ние (х40) светлопольного или фазово-контрастного микроскопа. На­ряду с этим из патологического материала (фекалии, отделяемое язв, пунктат костного мозга, селезенки, печени, материал дуоденального зондирования, выделения мочеполовых путей, крови) делают тонкие мазки. Из крови готовят препараты «толстая капля». Для этого па­лец, обработанный эфиром, поворачивают проколом вниз и к вы­ступающим каплям подносят предметное стекло, на которое берут 2-3 кап. крови, и затем иглой или углом другого предметного стекла кровь распределяют, чтобы получить овал около I см, для ускорения высыхания препарата можно поместить в термостат при 35-37 °С.

Из внутренних органов готовят мазки-отпечатки. Препараты фиксируют метиловым спиртом или смесью спирт - эфир (1:1) и ок­рашивают по Романовскому- Гимзе, железным гематоксилином по Гейденгайну или 1% метиленовым синим. При окраске по Романов­скому- Гимзе цитоплазма паразита окрашивается в голубой цвет, яд­ро и жгутики - в красновато-фиолетовый. При использовании желез­ного гематоксилина по Гейденгайну цитоплазма красится в серовато-голубой, а ядерные структуры простейших - в черный цвет.

Для обнаружения цист применяют крепкий раствор Люголя, ок­рашивающий структуры цист в темно-коричневый цвет.

Окраска железным гематоксилином по Гейдеигайну

1. Мазки после фиксации помещают в 2,5% раствор железоам-миачных квасцов на 1 ч.

2. После трехкратного ополаскивания в воде окрашивают краси­телем (0,5 г гематоксилина, 10 мл 96 ° спирта, и после растворения добавляют 90 мл дистиллированной воды) в течение 5-10 мин.

3. Промывают водой и высушивают.

Окраска незаменима в тех случаях, когда нужно выявить тон­чайшие детали строения ядра и цитоплазмы простейших.

иридукшв мсиняшшма из оактериалы-юи клетки в окру­жающую среду так же осуществляется путем неконтролируемой диффузии или при участии |ранспортных систем - в тех случаях, когда в результате процессов брожения, неполного окисления или нарушений метаболизма вещества накапливаются в клетке в коли­чествах, превышающих физиологическую норму.

Для роста и размножения бактерий, а следовательно, и для их питания необходимы различные химические соединения, раство­ренные в воде. По количественному вкладу в построение клетки различают макро- и микроэлементы. К макроэлементам относят 10 элементов таблицы Менделеева: углерод, водород, кислород, азот, серу, калий, кальций, фосфор, магнии, железо. Микроэлементы нужны бактериям в очень малых, следовых, количествах, они пред­ставлены марганцем, молибденом, цинком, медью, кобальтом, ни­келем, хлором, бромом и некоторыми другими металлами и неме­таллами. Большинство из них содержится в виде примесей в макро­элементах или может попадать в питательные среды из стеклянной посуды, воды или воздуха. Некоторые бактерии могут обходиться и без микроэлементов.

По потребности в углероде бактерии делятся на две большие группы: автотрофы, или оргапотрофы, и гетеротрофы, или ли-тотрофы (схема 1).

Бактергш-автотрофы способны получать энергию путем окис­ления неорганических соединений, они, как правило, используют СОт как основной источник, содержащий углерод в наиболее окис­ленной форме. Поэтому при культивировании автотрофов необхо­димо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация СОз в воздухе не превышает 0,03 % и ее поступление в среду за счет диф­фузии недостаточно для роста микроорганизмов. В питательные среды для культивирования автотрофов вносят карбонат кальция (СаСО^) или бикарбонат натрия (№НСО₃). Иногда через питатель­ную среду продувают воздух, обогащенный 1-5% СО₂.

Бактерии-гетсротрофы получают углерод из органических со­единений. В зависимости от индивидуальных особенностей микро­организмов источником углерода могут быть разные органические соединения - спирты, углеводы, ароматические соединения, органи­ческие кислоты.

Гетеротрофы, в свою очередь, разделяют на сапрофиты (ме-татрофы), живущие за счет органических соединений, которые по­ступают в бактериальную клетку из внешней среды, и паразиты

(паратрофы), способные утилизировать только продукты метабо-иизма внутри живой клетки. Паразитизм может быть факультатив­ным и абсолютным, или облигатным.

Для роста микроорганизмов также необходим азот, который иходит в состав органических соединений или солей в разной степе­ни восстановления. Это могут быть соли аммония, нитраты или от­дельные аминокислоты. Для удовлетворения потребности бактерий в азоте используют также продукты неполного расщепления белков животного происхождения- гидролиза™, пептоны и сложные бел­ковые смеси - нативную сыворотку животных, асцитическую жид­кость и др.

Кроме углерода, азота и других химических элементов, многие бактерии нуждаются в факторах роста, к которым относятся вита­мины, основания нуклеиновых кислот и другие биологически ак­тивные вещества. По этому признаку микроорганизмы можно раз­делить на две группы: ауксотрофы, для которых в среде необходи­мо наличие одного или нескольких факторов роста, и прототрофы, они в факторах роста не нуждаются.

В среде обитания бактерий, кроме биосинтстического, должен находиться и энергетический материал. По способу получения энер­гии бактерии также принято делить на две группы: кемотрофы и фототрофы. Хемотрофы используют энергию окисления различ­ных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата среди хе~ мотрофных организмов выделяют хемолшпотрофы и хемооргано-трофы. Фототрофы для удовлетворения энергетических потребно­стей используют энергию света.

Питательные среды

В лабораторных или производственных условиях бактерии вы­ращивают (культивируют) на средах, которые должны удовлетво­рять потребности бактерий в питательных веществах, иметь адек­ватное значение величины рН, изотоничность и быть стерильны­ми, а по возможности и прозрачными. Специфичность большинст­ва питательных сред определяют соединения углерода и азота, но так как конструктивные и энергетические процессы микроорга­низмов разнообразны, неодинаковы и их потребности в питатель­ных веществах.

Питательные среды принято делить на несколько групп: среды которые отличаются по составу и происхождению, физическому состоянию или консистенции и функциональному или целевому на­значению.

По происхождению среды бывают естественными (натураль­ными) и искусственными (синтетическими). К естественным сре­дам относят те, в состав которых входят продукты растительного или животного происхождения. Они содержат все компоненты, не­обходимые для роста и развития бактерий, но имеют непостоянный химический состав, то есть они нестабильны. Поэтому такие пита­тельные среды не пригодны для изучения метаболизма бактерий, а используются в основном для накопления биомассы, поддержания культур бактерий в жизнеспособном состоянии и для диагностиче­ских целей, например для выделений чистых культур бактерий. К естественным средам относятся: молоко, кровь и сыворотка крови, отвары и экстракты из природных субстратов, пептонная и мясная вода, мясопептонные бульон и агар, дрожжевые экстракты, карто­фельные, яичные и желчесодержащие среды.

Синтетические среды имеют определенный химический состав и точное количественное содержание питательных веществ. Их ис­пользуют для изучения метаболизма бактерий, исследования физио­логии и биохимии микроорганизмов. Примером синтетической сре­ды могут служить среды Козера и Симмонса, используемые для изу­чения способности бактерий утилизировать цитраты. В состав этих сред наряду с другими солями входят цитрат натрия и индикатор.

В практике микробиологии, как правило, используются комби­нированные питательные среды, в которых сочетаются естествен­ные компоненты с неорганическими солями. Примерами таких сред являются агар Цейсслера, в состав которого входит МПА, кровь и сахар, среды Гисса, содержащие пептон, агар, один из Сахаров и ин­дикатор, среда Раппопорта, состоящая из желчного бульона, глюко­зы и индикатора.

Среды можно по составу разделить также на простые и слож­ные. К простым относятся мясная и пептонная вода, мясопептонные бульон и агар. Добавление к таким средам одного или нескольких ингредиентов - углеводов, крови, сыворотки и других составляю­щих - делает их сложными.

По физическому состоянию питательные среды могут быть жидкими, полужидкими, плотными или твердыми, сыпучими или сухими. Жидкие среды представлены, как правило, водными раство­рами необходимых для жизни веществ. Их используют для накоп­ления биомассы, обогащения культур бактерий, изучения метабощпма, Полужидкие и плотные питательные среды получают из жидких, добавляя к ним агар или желатину. Концентрация агара для пппужидких сред 0,5-0,7%, а для плотных 1,5-2%.

Полисахарид агар получают из некоторых видов морских водо­рослей, его высушивают и хранят в виде пластин или порошка. Бак-к-рии не используют агар в качестве субстрата, поэтому состав плотной питательной среды зависит от состава жидкой среды, к ко-трой добавлен агар. Агар плавится примерно при температуре 11)0 °С и застывает при 40 °С. Авизированные среды разливают в пробирки или чашки Петри в расплавленном состоянии, а затем ох­лаждают. Для уплотнения сред иногда используют желатину, добав­ляя ее к жидким средам в 10-20% концентрации. Применение жела­тины ограничено тем, что она разжижается протсолитическими ферментами бактерий, и ее используют в основном в питательных средах для диагностических целей. Для уплотнения сред использу­ют, кроме того, селикогель и каррагенан, получаемый из красных морских водорослей. Пластины геля, пропитанные питательной сре­дой, используют для культивирования бактерий-автотрофов.

Сухие питательные среды представляют смеси питательных сред определенного состава. Перед использованием их растворяют в воде и соответствии с инструкцией, указанной на этикетке, устанавлива­ют необходимое •значение рН и стерилизуют. Применение сухих пи­тательных сред облегчает работу по приготовлению сложных сред в лабораториях.

По целевому назначению питательные среды делят на несколько групп:

1) основные, или универсальные, простые среды, например МПА, МПБ; на них могут расти многие виды неприхотливых мик­роорганизмов;

2) специальные, или сложные, среды используют для культиви­рования тех бактерий, которые не могут расти на основных простых средах; в состав специальных сред вводят, например, углеводы для роста стрептококков, желчь для культивирования сальмонелл, де-фибринированную кровь для дифтерийной палочки.

Среди сложных сред можно выделить избирательные, или элективные, среды. Они предназначены для выделения и культиви­рования определенного вида бактерий из материала, содержащего большое количество разных видов микроорганизмов. Например, для выделения возбудителя туберкулеза из мокроты больного исполь­зуют среду Левинштейна - Йенсена, сальмонеллы из испражнений среду Плоскирева. В сложном составе таких сред содержатся веще­ства, ингибирующие рост посторонней микрофлоры, но не влияю­щие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. Такими вещест­вами могут быть анилиновые красители, желчь, хлористый натрий в концентрации выше 1%,

Разновидность элективных - селективные питательные среды. В их состав входят не только вещества, подавляющие рост отдель­ных групп микроорганизмов, по и стимуляторы роста отдельных ви­дов бактерий.

Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации бактерий по биохимическим свойствам. В основе использования этих сред лежат различия в ферментативном составе бактерий и способности ферментов расщеплять тот или иной суб­страт. Существуют среды для определения гликолитической актив­ности бактерий, в их состав входят один (среды Гисса), два (среды Ресселя) или три (среда Клиглера) сахара. Протеолитическую ак­тивность бактерий изучают на МПБ, средах с желатиной, свернутой сыворотке. Возможность ферментировать более простые азотсодер­жащие соединения изучают на питательных средах с аминокислота­ми, бульоне с мочевиной.

Способность бактерий к выделению токсинов и ферментов аг­рессии исследуют на кровяных, желточно-солевом, бессывороточ­ном фосфатном агарах и других подобных средах.

Консервирующие среды используют для транспортировки и хранения в течение длительного времени материала, содержащего бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид натрия и фосфатно-буферные растворы.

Питательные среды стерилизуют в автоклавах при разных ре­жимах, которые зависят от состава среды или, если питательные среды содержат термолабильные компоненты, путем стерилизую­щей фильтрации.

Условия культивирования бактерий

Для роста бактерий, кроме состава питательной среды, имеют значение кислотность среды, аэрация, температура, свет и влаж­ность. Большинство бактерий растет при рН = 6,8-8,0, то есть в ней­тральной среде. Поддержание нейтрального значения рН особенно важно для кислотопродуцирующих бактерий. В процессе промыш­ленного культивирования бактерий в больших объемах рН среды хтулируется автоматически добавлением растворов оикарооната шгрия или щелочей.Газовый состав среды также важен для бактерий. Значительная теть из них нуждается в постоянном притоке молекулярного ки­слорода. Такие микроорганизмы объединены в группу облигатных ачробов. Меньшая часть бактерий - облигатные анаэробы - способ­на развиваться только в отсутствие кислорода. Однако большинство бактерий - факультативные анаэробы, они растут как в присутствии кислорода, так и без него. Для бактерий, культивируемых на плот­ных питательных средах или в небольших объемах жидких сред, достаточно кислорода, присутствующего в атмосфере. Для культи­вирования бактерий-аэробов в промышленных масштабах требуется принудительная аэрация путем продувания кислорода в реактор или ферментё'р с культурой, а для культивирования анаэробов - создание бсскислородных условий. Для этого бактерии засевают уколом в столбик плотной питательной среды, помещают посевы в специаль­ные приборы - анаэростаты, где газовая фаза представлена инерт­ным газом или создан вакуум, а кислород из среды удаляют с помо­щью кипячения или химических методов. Для выделения чистых культур анаэробов используют среду Кита- Тароцци, а также куль­тивирование в стеклянных трубках по методу Виньяля - Вейона.Большинство известных микроорганизмов относится к мезофи-лам, температурный оптимум для которых лежит в интервале 25-37 °С. Термофилы способны расти при 45-90 °С, а психрофилы ос­таются жизнеспособными при 5 - 10 °С. Отклонение температурно­го режима от оптимального неблагоприятно сказывается на жизне­деятельности бактерий. Поэтому культивирование их осуществляют в специальных шкафах - термостатах или термостатированных ком­натах, где поддерживается оптимальная заданная температура.Патогенные для человека бактерии объединены в порядок ско-тобактерий и для жизнедеятельности не нуждаются в освещении.При культивировании бактерий в лабораторных и производст­венных условиях, для получения больших количеств биотехнологи­ческого продукта - вакцин, диагностикумов, биологически актив­ных веществ, используют две различные технологические системы: постоянное, или периодическое, и непрерывное, или проточное, куяьтг жирование.В первом случае размножение бактерий происходит в закрытом сосуде до тех пор, пока плотность клеточной популяции не достиг­нет критической концентрации и не будут исчерпаны запасы питательной среды, а продукты метаболизма не начнут проявлять токси­ческие свойства. В такой культуре размножение бактерий ограниче­но определенным числом популяций. В промышленных условиях часто используют второй вариант - проточное, или непрерывное, культивирование. При этом в реактор или ферментёр непрерывно при перемешивании поступает свежая питательная среда, а продук­ты метаболизма и накопившаяся бактериальная масса автоматиче­ски удаляются. Такое культивирование можно осуществлять в спе­циальных аппаратах - хемостате и турбидостате, где необходимый объем питательной среды поступает автоматически, в зависимости от концентрации бактериальных клеток.Изотоничность питательной среды зависит от содержания неор­ганических солей. Для большинства бактерий изотоничной считает­ся среда, концентрация натрия хлорида в которой составляет 0,5-0,6 %,Время выращивания (культивирования) бактерий зависит от времени очередного деления клеток данной популяции. Периоды генерации большинства патогенных бактерий составляют несколько (4-8) часов. Такие культуры формируются в течение 18-24 ч. Клетки некоторых видов бактерий делятся с большими временными интерва­лами, поэтому увеличение численности популяций таких культур происходит в течение длительного времени, например, лептоспиры вырастают за 8-) 0 сут, микобактерии туберкулеза - за 3—4 ыед.

Дыхание бактерий

Для осуществления биологических синтезов, помимо питатель­ных веществ, бактерии нуждаются в определенном количестве энер­гии. Универсальным аккумулятором химической энергии в клетке является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), которая образуется в результате дыхания, биологического окисления, основанного на окислительно-восстановительных реакциях или брожении. Молеку­лы АТФ синтезируются в результате переноса электрона от первич­ного донора к конечному акцептору. Конечным акцептором элек­тронов чаще всего выступает молекулярный кислород О₂, и тогда осуществляется аэробное дыхание. Если в качестве акцептора элек­тронов выступают неорганические соединения (N02, 8О₄, 8О₃), воз­никает анаэробное дыхание (схема 2).

В том случае, когда продукты органического субстрата служат одновременно и донорами и акцепторами водорода, метаболический процесс называется брожением (ферментацией).

Физиология микроорганизмовПодавляющее большинство патогенных бактерий являются аэ­робами. По потребности в кислороде бактерии можно разделить на пять групп:

1. Строгие (облигатные) аэробы, рост этих микроорганизмов прекращается в отсутствие О₂. К ним относятся, например, менин­гококки.

2. Строгие (облигатные) анаэробы не переносят доступа воздуха, так как образующиеся токсические производные кислорода (пере­кись водорода, супероксидный" и гидроксильный радикалы, синг-летный кислород) губительны для самих же бактерий из-за отсутст­вия у них ферментов (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмута-зы), разрушающих эти токсические продукты. К строгим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, газовой гангрены, не­которые бактероиды. Среди множества патогенных бактерий их ко­личество невелико.

3. Факультативные анаэробы - наиболее обширная группа пато­генных микроорганизмов, которые способны использовать в качест­ве акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и орга­нические соединения, а также переключаться на процесс брожения в отсутствие молекулярного кислорода.

4. Микроаэрофильные бактерии хорошо растут при сниженном парциальном давлении кислорода, но при повышенном содержании СО₂ (представители рода ВшсеПа).

5. Аэрофилы нуждаются в повышенном содержании кислорода (холерный вибрион, возбудители дифтерии, туберкулеза).

Ферменты бактерий

Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необ­ходимые реакции. Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, как и клетки высших орга­низмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппара­том. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.

2. Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.

3. Гидролазы- катализируют разрыв связей в субстратах с при­соединением воды.

4. Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.

З.Изомеразы- катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).

6. Лигазы (синтетазы) - катализируют присоединение двух мо­лекул с использованием энергии фосфатных связей.

Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядочено. Ферменты энергетического об­мена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплаз-матической мембране и ее производных. Ферменты белкового син­теза связаны с рибосомами. Многие ферменты находятся в цито­плазме в растворенном виде.

Ферменты бактерий подразделяются на экдо- и экзоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катали­зируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзофермен­ты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролити­ческие ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.

В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии, например ферменты гликолиза. Ин~ дуцибелъные ферменты синтезируются только в ответ на присутст­вие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соот­ветствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтези­руются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосин­теза являются многие питательные вещества. К индуцибельным от­носится большинство гидролитических ферментов.

Известны также ферменты, которые получили название алло-стерических. Кроме активного центра, у них имеется регуляторный, или аллостерический, центр, который в молекуле фермента про­странственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. аИоз - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению (стеричсски) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Веще­ства, связывающиеся с аллостерическим центром, называют алло-стерическгши эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затруд­няют. Соответственно аллостерические эффекторы называются по­ложительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуля­ции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводит­ся к регуляции интенсивности ферментативных реакций.

Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, раз­рушают ткани и клетки макроорганизма, обусловливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в ин­фицированных тканях. К таким ферментам относятся: плазмокоагу-лаза, нейраминидаза, коллагеназа, лецитиназа, гиалуронидаза и не­которые другие. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщеп­ляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбу­дителей и их токсинов в организме, обусловливая высокую инва-зивность этих бактерий.

Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности ста­филококков, так как участвует в превращении протромбина в тром­бин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фаго­цитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестрикта-зы, нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в ге­нетической инженерии, для получения различных биологически ак­тивных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные анти­тела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.

Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства, поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято де­лить на две большие группы:

1) гидролитические, или сахаролитические, ферменты, субстра­том для которых являются различные сахара, а продуктами их рас­щепления - кислоты, спирты, альдегиды, НЬО и СО?;

2) протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образо-н;ишем полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода.

Для изучения активности ферментов при идентификации микро­организмов широко используют дифференциально-диагностические греды, в состав которых входят определенные субстраты - сахара или белки.

При исследовании гидролитической активности бактерий нашли широкое применение моносубстратные дифференциально-диагностические среды Гисса (пестрый ряд Гисса), лактозосодер-жащие среды Эндо, Левина, Плоскирева, дисубстратные среды Рес-ссля, пол и субстратные среды Клиглера и Олькеницкого. Последние могут служить и для изучения протсолитических свойств бактерий, так как рост микроорганизмов сопровождается высвобождением аммиака. Протеолитические ферменты бактерий определяются так­же по выделению индола, сероводорода, расщеплению некоторых аминокислот, например фенилаланина, лизина, цистина. Протеоли­тические ферменты способны изменять (разжижать) желатину, при­чем разные виды бактерий по-разному изменяют «столбик» желати­ны в пробирке с посевом микроорганизма. Так, при росте холерного вибриона «столбик» желатины принимает форму гвоздя, при росте стафилококка - чулка, при росте синегиойной палочки наблюдается послойное разжижение среды.

Окислительно-восстановительные ферменты, дегидрогеназы, ка-талазу определяют по изменению органического красителя - акцеп­тора водорода. Способность микроорганизмов использовать в каче­стве источника углерода цитрат оценивают в специальных тестах, основанных на работе ферментов.

В практических бактериологических лабораториях широко при­меняют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существу­ет множество тест-систем. Наиболее часто используют систему ин­дикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют собой диски фильт­ровальной бумаги, пропитанные растворами Сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Мик­ротест-системы для изучения идентификации энтеробактерий пред­ставлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитра­ты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенил ал анин и т.д.

Культуральные свойства бактерий

К культуральным, или макроморфологическим, свойствам отно­сятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питатель­ных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного ви­да, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разно­образием, они видоспецифичны, и их изучение используется для оп­ределения видовой принадлежности исследуемой культуры.

При описании колоний учитываются следующие признаки:

1) форма колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, непра­вильная и т.д.;

2) размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средние (3-5 мм) и крупные (более 5 мм);

3) поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчер­ченная;

4) профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кра-терообразный и т.д.;

5) прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, муч­нистая;

6) цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выде­ление пигмента в среду с ее окрашиванием;

7) край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромча­тый и т.д.;

8) структура колонии - однородная, мелко- или крупнозерни­стая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;консистенция колонии - определяют, прикасаясь к поверхно-ни петлей; колония может быть плотной, мягкой, врастающей в ншр, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при (^прикосновении с петлей).

I'дубинные колонии чаще всего похожи на более или менее I плющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда на комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается раз­рывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.

Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок,

I- юлющихся по дну.

Описание роста микроорганизмов при посеве штрихом включает сто особенности: скудный, умеренный, обильный; сплошной с ров­ным или волнистым краем; диффузный; перистый; ризоидный; дре-новидный. Характеризуют цвет, поверхность, консистенцию.

Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зави­сят от состава среды, температуры культивирования.

Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитыва­ют, используя 4-7-суточные культуры, выращенные в стационарных

условиях.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов на­блюдаются помутнение среды, образование пленки или осадка.

1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды характерен для факультативных анаэробов, Степень помутнения может быть слабая, умеренная, сильная.

2. Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного, обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда может быть прозрачной или мутной.

3. Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом

остается прозрачной.

4. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности среды пленки: тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой, влажной, сухой, кольцеобразной, сплошной. Такой рост наблюдается при культивировании аэробных бактерий.

При росте на полужидких (0,5-0,7% агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, непод­вижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.

Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтиловый, уксусноамиловый и др.), индола, меркаптана, се­роводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.

Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральныи налет, если же он раство­рим, окрашивается и питательная среда, Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, по­этому в воздухе так много пигментированных бактерий; кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бак­терии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бакте­риям - фотобактериям - относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бакте­рий - обязательный этап бактериологического исследования в лабо­раторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микроб­ной загрязненности различных объектов окружающей среды и в це­лом при любой работе с микроорганизмами. Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, пе­реносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологиче­ские, культуральные, биохимические, антигенные и другие призна­ки, по совокупности которых определяется видовая и типовая при­надлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (темпе­ратура 48-50 °С) с последующим разливом в чашки Петри, где агар частывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведении, где бактерий становится мало, и в дальнейшем при рос­те на чашках Петри появляются изолированные колонии, образую­щиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пере­севом на свежие среды.

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой куль­туры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсацион­ную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (про­тей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвиж­ные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верх­ние края культуры, можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологи­ческой практике, при этом исследуемый материал разводят в про­бирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпа­телем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев но второй и третьей чашке. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку бакте­рии будут распределяться по поверхности питательной среды от­дельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термо­стате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на треть­ей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопле­ния чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделе­нии чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молеку­лярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведе­ния. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 °С пгаризированной питательной среде. Делают 6-10 последователь­ных разведении, затем среду в пробирках быстро охлаждают и за­ливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной сре­ды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания пере­носят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробир­ках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии были хорошо видны, используют осветленные питательные среды. Для извлече­ния изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика вы­скальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Кита- Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта - для получения изолированных колоний бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (стро­гие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бакте­риями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобо­жденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают рези­новой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изоли­рованные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулято­ра. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специ­альной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях опера­ционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), пере­мещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с мик­ронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследова­тель, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипет­ками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Особенности культивирования отдельных групп прокариот

Спирохеты

Спирохеты - хемоорганотрофные бактерии, являются аэробны­ми, факультативно анаэробными или анаэробными микроорганиз­мами.

Медицинское значение имеют представители родов Тгеропета, ВоггеНа, Ьертозрп'а.

Трепопемы (возбудители сифилиса, фрамбезии и эндемического сифилиса) являются факультативными анаэробами, чрезвычайно прихотливы и не растут на искусственных питательных средах, в куриных эмбрионах или на культурах клеток. Те разновидности их штаммов, которые удается выращивать, являются, вероятно, сапро­фитными трепонемами, близкими к возбудителю сифилиса. Для их культивирования используют МПБ или печеночный бульон с добав­лением кусочков печени и яичек кролика. Можно применять бульон из бычьего сердца с тиогликолятом N3 или МПБ, дополненный кро­личьей, лошадиной сывороткой, асцитической жидкостью, сыворот­ками человека. Посевы культивируются в анаэробных условиях при 35 °С, рост появляется на 3-5-е сут культивирования. Эти штаммы (культуральные трепонемы) используют при изготовлении антиге­нов для серодиагностики сифилиса. Единственным способом выра­щивания патогенных для человека трепонем является заражение кролика в яичко (экспериментальный орхит).

Боррелии, вызывающие у человека эпидемический возвратный тиф, клещевые боррелиозы, в том числе болезнь Лайма, являются микроаэрофилами, растут при 20-37 °С, рН = 7,2-7,4, на специаль­ных средах, содержащих кровь, сыворотку, ткани животного проис­хождения (среды Аристовского - Гельцера, Клиглера - Робертсона), залитых сверху тонким слоем вазелинового масла. Первые генера­ции боррелий появляются на 4, 7, 14-й день выращивания, что обна­руживается при микроскопии мазков. Кроме того, боррелий можно культивировать на хорион-аллантоисной оболочке куриного эм­бриона. Боррелии, вызывающие эндемические возвратные тифы, ак­тивно размножаются в организме белых мышей и морских свинок, вызывая септицемию.

Лептоспиры (возбудители лептоспироза) являются гидробионтами, а по типу дыхания - аэробами. Выращиваются на стерильной дистиллированной воде с добавлением 10% кроличьей сыворотки (среда Уленгута); пептона, поваренной соли и фосфатной буферной смеси (среда Ферворта- Вольфа) или полужидкой агаровой среде с гемолизироваыной кроличьей кровью. Развиваются медленно, на 5-7-й день и позднее при температуре 28-30 °С. Жидкие питательные среды при этом остаются прозрачными, иногда может быть легкая опалесценция. Рост лептоспир контролируют,исследуя препарат «висячая капля»в темиопольном или фазово-контрастном микроско­пе. В полужидких средах образуются колонии округлой формы диа­метром 1-3 мм.

Ми ко плазмы

Микоплазмы являются хемоорганотрофами, факультативными анаэробами, хотя лучше растут в аэробной среде и только немногие виды - в анаэробных условиях. Они прихотливы к условиям культи­вирования; в питательные среды необходимо вносить нативную сы­воротку, холестерин, нуклеиновые кислоты, витамины, различные соли. Питательные среды могут быть полужидкие, жидкие и плот­ные, состоящие из 7 частей основной среды (перевар сердечной мышцы крупного рогатого скота), 1 части 25% экстракта свежих дрожжей и 2 частей непрогретой лошадиной сыворотки (среды, раз­работанные В.Д. Тимаковым, Г.Я. Каган). За рубежом широко ис­пользуются жидкая и плотная питательные среды фирмы «Дифко», а также дифференциальная агаровая среда А-7. Оптимальная тем­пература для роста миколлазм в агаровых культурах 36,5-37 °С, рН = 7,0, при повышении рН до 8 микоплазмы гибнут.

При нанесении капли материала, содержащего микоплазмы, она адсорбируется агаром, образуя уплотнение между его нитями. В ре­зультате размножения микоплазм внутри нитей агара формируется маленькая сферическая колония, которая растет и через 24-28 ч ин­кубации достигает поверхности водной пленки, в результате обра­зуются две зоны роста - мутный гранулярный центр, врастающий в среду, и плоская ажурная полупросвечивающая периферическая зо­на (вид «глазуньи»). Спустя 3-5 сут инкубации колонии могут дос­тигать размера 1,5-2 мм, но чаще они так малы, что их трудно уви­деть невооруженным глазом, и посевы просматривают при малом увеличении микроскопа. Микоплазмы образуют колонии более крупные, чем уреаплазмы (15-60 мкм в диаметре).

На полужидких средах микоплазмы растут по ходупосева уко­лом, формируя крошковатые колонии, на жидких питательных средах вызывают опалесценцию или тонкую жирную пленку, а иногда придонный рост.

Патогенные микоплазмы хорошо размножаются в культурах тканей (Пер-2, НеЬа), вызывая через 72-86 ч резкую дегенерацию клеток - цитопатогенный эффект, сапрофитные виды таким с во ист­цам не обладают. Кроме того, в литературе имеются отдельные со­общения об успешном моделировании экспериментальной уреа-млазменной инфекции на обезьянах при интрауретральном инфици-ровании свежевыделенными штаммами микоплазм человеческого происхождения.

Актиномицеты

Среди актиномицетов встречаются как облигатные, так и фа­культативные анаэробы. Они способны расти при температуре от 3-7 до 40 °С, температурный оптимум 35-37 °С, оптимальная рН от 6,0 до 6,8, для роста требуют СО₂. Цвет и размеры колоний на пита­тельных средах актиномицетов вариабельны и видоспецифичны. Молодые колонии более тонкие, плоские и круглые, легко снимают­ся с поверхности петлей. Зрелые культуры гладкие или исчерчен­ные, складчатые или бугристые, мягкой восковидной или крошко-нидной консистенции, прочно спаяны с питательной средой. ГТо-иерхность колоний у одних гладкая, у других бархатистая, пушистая или мучнистая, это связано с образованием воздушного мицелия и спор. Пигментация колоний- характерный признак актиномицетов: колонии могут быть фиолетового, синего, красного, желтого, зеле­ного, черного, серого, белого цвета.

Актиномицеты растут на обычных бактериологических средах -сывороточном и кровяном агарах и на авизированной среде с сер­дечно-мозговой вытяжкой. Можно использовать среды Сабуро, Ча­пека. Посевы инкубируют как в аэробных, так и в анаэробных усло­виях в течение 1-2 нед. Некоторым медленно растущим штаммам может требоваться инкубация даже до 1 мес. Поэтому питательную среду наливают в чашки Петри толстым слоем, чтобы избежать ее полного высыхания, и помещают во влажную камеру. Ветвящийся мицелий на поверхности агара можно наблюдать в микроскопе уже через 24 ч после посева, видимые невооруженным глазом колонии появляются обычно на 3-4-е сут, а зримый воздушный мицелий со спорами может появиться лишь через 7-14-е сут.

Биологический метод при работе с актиномицетами практически не применяется, хотя известно, что к нокардиям при внутрибрю-шинном заражении восприимчивы морские свинки и кролики.

Риккетсии

Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразита­ми и не размножаются на искусственных питательных средах. Для их культивирования используют живые системы.

1. Эпидермо-мембранный метод (метод А.В. Пшеничного и Б,И. Райхера). Принцип его заключается в том, что с кожи трупа снимают путем термической обработки эпидермальный слои в виде тонкой пленки, то есть тончайшей мембраны. Эпидермальную мем­брану натягивают на кормушку и закрепляют. В кормушке на эпи-дермомембрану высыпают вшей, а под мембрану подводят неболь­шое количество дефибринированной крови, содержащей риккетсии. Кормушку нагревают до 32-37 °С. Вши сосут кровь и заражаются риккетсиями. Размножаясь в эпителиальных клетках кишечника, риккетсии через 8-9 дней накапливаются во вшах. Затем их расти­рают в ступке, и взвесь очищают путем фильтрации и центрифуги­рования (в настоящее время метод имеет историческое значение).

2. Метод Кокса (заражение куриных эмбрионов в полость жел­точного мешка). Для этого используют 6-7-дневные эмбрионы. Ра­бота производится в боксах с тщательным соблюдением стерильно­сти. После дезинфекции 50% спиртом и 5% йодной настойкой скор­лупы тупого конца яйца пробуравливают отверстие над вершиной воздушной камеры и в него вводят шприц, содержащий 0,4-0,5 мл инфицирующего материала. Контролируя положение иглы с помо­щью овоскопа, прокалывают хорион-аллантоисную оболочку, про­ходят аллантоисиую полость и входят в желточный мешок. Отвер­стие в скорлупе закрывают расплавленным стерильным парафином, и зараженные эмбрионы помещают в термостат при 35-37 °С. Мак­симальное накопление риккетсии происходит на 8-10-й день. Рик­кетсии размножаются в ткани стенки желточного мешка и при гибе­ли клеток легко из них освобождаются. При вскрытии зараженных эмбрионов желточный мешок извлекают стерильным пинцетом, и из него готовится суспензия на стерильном физиологическом растворе, которую используют для приготовления риккетсиозных антигенов и вакцин.

3. Метод культуры тканей. Риккетсии можно выращивать в культурах т уйго на многих типах клеток млекопитающих: Нер-2,

НеЬа, Оейчэй-б (костный мозг грудины человека), Ь-мышиных фиб-робластах, фибробластах куриных эмбрионов и др. Метод культуры ткани не нашел широкого применения для выделения и идентифи­кации риккетсии, но позволил выяснить вопросы взаимоотношения возбудителя с клеткой-хозяином. Риккетсии в культуре клеток нака­пливаются медленно и в небольшом количестве, поэтому клеточные культуры нужно поддерживать в течение нескольких недель, прежде чем появятся признаки инфекции. При инфицировании клеток рик­кетсии не остаются в цитоплазме до ее деструкции, а свободно вы­ходят и проникают в соседние клетки. Температурный оптимум -32-35 °С, рН = 7,4-7,8, солевой состав в культуральной среде обес­печивается смесью жидкости Тироде с сывороткой морской свинки или кролика.

4. Метод заражения лабораторных животных (биологический метод). В настоящее время для культивирования риккетсии широко используют морских свинок и белых мышей. Других животных за­ражают редко, только для специальных исследований. Морских свинок заражают внутрибрюшинно или интратестнкулярно (в толщу яичек). У животных развивается лихорадка, а в случае эндемических риккетсиозов - специфический периорхит, сопровождающийся на­коплением риккетсии в мезотелии влагалищных оболочек яичка. Риккетсии выделяют из крови, селезенки, почек, надпочечников, но особенно много их в мозговой ткани животного. Для размножения риккетсии Провачека чаще всего используют белых мышей, заражая их интраназально. Наиболее чувствительны молодые мыши массой 10-15 г. Инфицирование их производится под эфирным наркозом с инсталляцией в ноздри 10 кап риккетсиальной взвеси. При такой до­зе мыши погибают на 4-5-е сут. При вскрытии извлекают легкое, из которого в среднем получают до 20-25 млрд риккетсии.

Хламидии

Хламидии вызывают у человека орнитоз, трахому, бленнорею новорожденных с включениями, болезнь Рейтера, венерическую лимфограпулёму, урогеиитальные инфекции. Хламидии, так же как и риккетсии, культивируются в организме чувствительных живот­ных, в культурах тканей, в желточном мешке куриного эмбриона.

1. Биологический метод. Исследуемым материалом заражают новорожденных морских свинок и белых мышей. Новорожденные мыши погибают при внутримозговом заражении через 5-10 сут от пневмонии. При внутрибрюшинном заражении гибель животных отмечается на 3-4-е сут на фоне пневмонии и перитонита. При мик­роскопическом исследовании клеток пораженных органов обнару­живаются хламидийные включения, наибольшее количество возбу­дителя отмечается в легких, печени, селезенке.

2. Заражение куриных эмбрионов, Наиболее эффективно зара­жение 7-дневных куриных эмбрионов в желточный мешок и 9-11-дневных в полость аллантоиса. Гибель эмбрионов происходит уже на 4-е сут, температура инкубации 36 °С. Препараты - отпечатки и мазки- окрашивают акридиновым оранжевым по Романовскому -Гимзе, Маккиавелло и исследуют под микроскопом для обнаруже­ния включений. При отрицательных результатах делают слепые пассажи, то есть из желточных мешков готовят 20% суспензию на фосфатном буфере, которой вновь заражают партию куриных эмбрионов.

3. Метод культуры тканей, Исследуемым материалом заражают культуры клеток - Ь, Нер-2, НеЬа; линии клеток Мак-Коя. Эффек­тивность заражения клеток хламидиями возрастает при обработке культуры цитостатиками или центрифугировании после внесения инфицированного материала в культуру. Культуры клеток обычно выращивают на покровных стеклах, которые вынимают, фиксируют и красят через 24-28 ч после заражения. Если цитоплазматические включения хламидий не обнаруживаются, культивирование про­должают до 6-10-х сут (температура 35-36 °С). К этому сроку при наличии хламидий в монослое клеток формируются цитолитические бляшки (зоны гибели клеток).

Действие физических факторов на микроорганизмы

Среди физических факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов, наибольшее значение имеет температура. По от­ношению к существованию в различных температурных режимах выделяют мезофильные формы микроорганизов, оптимальная тем­пература для которых составляет 25-40 °С. К мезофилам относится подавляющее большинство как сапрофитных, так и патогенных бак­терий.Среди бактерий, обитателей глубин океанов, тундровых почв, встречаются сапрофитные бактерии - психрофилы, которые раз­множаются при температуре ниже 20 °С. Термофильные микроорга­низмы, заселяющие, например, воды горячих источников, способны размножаться при температуре выше 70 °С.Бактерии-мезофилы в вегетативном состоянии чувствительны к повышению температуры до 50-55 °С. При этом происходит дена­турация ферментных белков бактериальной клетки, что ведет к ги­бели организма. Спорообразующие бактерии - бациллы - более ус­тойчивы к повышению температуры, многие из них способны вы­держивать в течение нескольких часов нагревание до 100-110 °С. Однако чувствительность к повышенной температуре колеблется у бактерий в зависимости от условий культивирования, состава пита­тельной среды, длительности экспозиции температурного влияния и других факторов.При температуре ниже оптимальной па 5-10 °С бактерии не по­гибают, однако их размножение задерживается в связи с торможе­нием обмена веществ. Для сохранения вегетативных форм бактерий при пониженной температуре применяют вещества с высокой вязко­стью, которые предохраняют цитоплазму бактериальной клетки от разрушения кристаллами льда. Такие вещества называют криопро-текторами. К ним относятся желатина, раствор альбумина, глице­рин, 40% раствор сахарозы. Криопротекторы используют для дли­тельного хранения культур бактерий при минусовых температурах, а также при лиофильном высушивании микроорганизмов. Лиофиль-ное высушивание предусматривает переход вещества из заморожен­ного состояния в сухое, минуя жидкую фазу. Это достигается при нагревании замороженных культур бактерий в условиях вакуума и используется при приготовлении иммунобиологических препаратов.

Кроме температурного фактора, на бактерии влияют и факторы осмотического и гидростатиче­ского давления. Бактерии, дрожжи и плесневые гри­бы устойчивы к гидростатическому давлению. Они переносят дав­ление 1000-3000 атм, а спороносные бактерии - до 20 000 атм. При таком высоком давлении снижается активность бактериальных фер­ментов и токсинов. Осмотическое давление отрицательно влияет на биохимическую активность микроорганизмов. Повышение концен­трации солей задерживает развитие многих бактерий, однако есть виды, способные развиваться в присутствии концентрированных растворов солей, такие бактерии называют осмофшьпыми (гаяо-фильиыми). Осмотическое давление в клетке регулирует цитоплаз-матическая мембрана. При высоком осмотическом давлении окру­жающей среды происходит плазмолиз. Плазмолиз - явление обра­тимое, и если понизить осмотическое давление окружающего микроорганизмы раствора, вода поступает внутрь клетки и возникает явление, противоположное плазмолизу, - плазмоптиз.

К физическим факторам, влияющим на микроорганизмы, отно­сят также и влияние лучистой энергии. Большин­ство патогенных бактерий плохо переносит прямой солнечный свет. На этом основано использование ультрафиолетового света с целью обеззараживания (стерилизации) воздуха в помещениях медицин­ских учреждений. Как УФ-свет, так и рентгеновские лучи, и другие виды ионизирующего излучения оказывают на микроорганизмы ле­тальное или мутагенное действие. Наиболее эффективны короткие лучи ультрафиолетового спектра с длиной волны около 280 нм. Та­кие лучи поглощаются нуклеиновыми кислотами клетки, при этом поражаются пиримидиновые основания и клетки погибают в резуль­тате возникновения летальных мутаций. Часть облученных клеток популяции способна к восстановлению, репарации ДНК. Репарация облученных молекул ДНК происходит при фотореактивации клеток, для этого необходимо воздействовать на клетки повторно лучами более длинноволновой области {520-550 нм) или провести «темпо­вую реактивацию».

Радиоактивное излучение также губительным образом действует на микроорганизмы. При этом значение имеют морфологическое и физиологическое состояние микроорганизма, экспозиция, доза об­лучения. Бактерии более чувствительны к ионизирующему облуче­нию, чем вирусы. Механизм действия ионизирующей радиации также связан с изменением нуклеиновых кислот клетки. Ионизи­рующая радиация в отдельных случаях используется в практике здравоохранения для стерилизации лекарственных веществ, хирур­гических материалов.Ультразвуковые волны при частоте коле­баний 1-1,3 мГц в течение 10 мин оказывают бактерицидный эф­фект на клетки микроорганизмов. Ультразвук способствуег разрыву клеточных стенок и мембран, повреждению флагеллина у подвиж­ных форм микроорганизмов. Влияние ультразвука основано на ме­ханическом разрушении микроорганизмов в результате возникнове­ния высокого давления внутри клетки или на появлении гидро-ксильных радикалов и атомарного кислорода в водной среде цито­плазмы. Это позволяет использовать его в качестве стерилизующего агента, а также применять для инактивации и дезинтеграции виру­сов с целью получения антигенов и вирусных вакцин.

Методы стерилизации

Почти все факторы физического воздействия на микроорганиз­мы могут быть использованы с целью стерилизации. Под стерилиза­цией понимают обеспложивание, освобождение материалов, рас­творов, питательных сред от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов. Стерильность - понятие абсолютное, оно означа­ет полное отсутствие микроорганизмов как на поверхности, так и внутри стерильного объекта.

В практике широко используют несколько способов стерилиза­ции: термическую (под действие высоких температур) и холодную (с помощью ультразвука, излучения, фильтрации).

Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в резуль­тате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых струк­тур микроорганизмов. Различают следующие способы тепловой сте­рилизации:

Прокаливание-это самый старый и надежный способ стерили­зации. В пламени горелки прокаливают бактериологические петли, препаровальные иглы, кончики пинцетов и ножниц, предметные стекла. При этом бактерии, грибы и их споры сгорают.

Кипячение- кипящую воду используют для стерилизации ме­таллических инструментов, стеклянных изделий, резиновых трубок, пробок. При 100 °С (температура кипящей воды) вегетативные фор­мы микроорганизмов и большинство вирусов погибают быстро, в течение нескольких минут. Споры (бациллы сибирской язвы, боту­лизма) выдерживают кипячение в течение нескольких часов, вирусы гепатита В - около часа. Стерилизацию осуществляют в специаль­ных металлических сосудах - стерилизаторах, которые могут быть снабжены электронагревом. Существует большое количество типов стерилизаторов, отличающихся по объему и устройству.

Стерилизация сухим жаром - используется чаще всего для стеклянной посуды. Ее проводят в специальных суховоздушных (су-хожарочных) шкафах, имеющих датчики - регуляторы температуры. Режимы стерилизации включают температуру и время. Наиболее час­то используют следующие режимы стерилизации сухим жаром: Температура, °С Время, мин 140 180 150 150 160 120 170 60

При таких режимах погибают как вегетативные формы, так и споры микроорганизмов.

Автоклавирование - стерилизация насыщенным паром под давлением. Проводится при температуре выше точки кипения воды. Это наиболее надежный и распространенный способ стерилизации. Особая эффективность способа достигается при совместном дейст­вии пара и высокой температуры. Стерилизацию паром под давле­нием осуществляют в специальных герметически закрывающихся аппаратах с толстыми стенками - автоклавах.Автоклав состоит из стерилизационной камеры, снабженной краном для выхода воздуха, манометром для измерения давления пара, предохранительным клапаном для выхода пара при повыше­нии давления выше необходимого, термометра для измерения тем­пературы внутри камеры. Имеется паровой котел с нагревателем во­ды. При кипячении воды пар поступает в камеру автоклава. Авто­клав герметически закрывают крышкой или дверью с плотной ре­зиновой прокладкой. Автоклавирование проводит подготовленный специалист, так как обслуживание аппарата, работающего под дав­лением, требует специальных знаний и строгого соблюдения пра­вил техники безопасности.

Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени. Избыточное давление в 1 атм устанавливается при достижении температуры в камере 121 °, в 1,5 атм - 125 °, в 2,0 атм - 134 °, При таких режимах автоклавирова­ния вегетативные формы микроорганизмов погибают в течение не­скольких минут, а споры в течение 20-30 мин. Режим стерилизации выбирают в зависимости от свойств стерилизуемого материала. Так, питательные среды стерилизуют 20-30 мин при I атм, перевязочный материал и резиновые изделия- от 1 до 2 ч при 1,0-1,5 атм.Для контроля режима стерилизации используют вещества с оп­ределенной температурой плавления. Их смешивают с метиленовой синью, помещают в ампулы или небольшие флаконы и раскладыва­ют в автоклаве перед началом автоклавирования. К таким контроли­рующим веществам относятся бензаурин, температура плавления 115°, соответствует - 0,5 атм; бензойная кислота, температура плав­ления 121 °, соответствует - 1,0 атм; мочевина, температура плавле­ния !32 °, соответствует - 2,0 атм; глюкоза, температура плавления 146 °; тиомочевина, температура плавления 180 °. Эти вещества рас­плавляются при достижении в сосуде соответствующей температу­ры и окрашиваются в цвет добавленного красителя.

Стерилизации текучим паром подвергаются те растворы и пи­тательные среды, которые разрушаются при стерилизации под дав­лением. Такую стерилизацию проводят также в автоклавах при из­быточном нулевом давлении и температуре 100 °. Применяют «дробную стерилизацию» - трех- или четырехкратную обработку с интервалом в ! сут, во время которого не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы и погибают от действия пара и температур.

Пастеризация предусматривает уничтожение в материале толь­ко вегетативных форм микроорганизмов и применяется в пищевой промышленности. При этом используют кратковременное нагрева­ние до 90-92 °С в течение 2-5 с или более длительное - в течение 5-10 мин до 70-75 °С. Обработанные таким образом материалы счи­таются пастеризованными, но не стерильными, так как содержат споры.

Холодная стерилизация осуществляется в отношении материа­лов, сред и растворов, которые изменяют свойства при тепловой стерилизации. Стерилизация фильтрованием показана для синтети­ческих сред определенного состава, содержащих термолабильные аминокислоты, витамины, белки, для антибиотиков, ароматических углеводородов. Фильтрование проводится через мелкопористые ма­териалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Диски, изготовленные из асбеста с целлюлозой, называют фильтрами Зейтца. Их помещают в специальный фильт-родержатель и стерилизуют в автоклаве, а затем, смонтировав дер­жатель с колбой или бутылью, под давлением пропускают стерили­зуемый раствор.

Широкое применение нашли мембранные фильтры. Их изготав­ливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Фильтры имеют поры размером от 0,22 до 100 мм. В фильтродержатели мон­тируют фильтры с разной величиной пор, от больших к меньшим, и при фильтрации растворов постепенно «отсеивают» микроорганиз­мы различных размеров. Наиболее широко известны фильтрующие пластины фирм «Миллипор», «Синпор», «Владипор». После стери­лизующей фильтрации среды и растворы обязательно проверяют на стерильность, помещая микропробы простерилизованных растворов в термостат при температуре 37 °С.

Действие химических факторов на микроорганизмы

Известно, что изменение состава и концентрации питательных элементов питательной среды может затормозить, прекратить или стимулировать процессы роста и размножения бактериальной попу­ляции. Следовательно, химические факторы способны влиять на жизнедеятельность микроорганизмов.

Степень воздействия химического агента на микроорганизм мо­жет быть различной. Бактериостатическое действие регистрируется в том случае, если химическое вещество подавляет размножение бактерий, а после его удаления процесс размножения восстанавли­вается. Бактерицидное действие вызывает необратимую гибель мик­роорганизмов. Некоторые химические вещества безразличны для бактерий, другие могут стимулировать процессы их развития. Про­явление различного влияния химических факторов на микроорга­низмы зависит от характера и концентрации веществ, а также от ин­дивидуальных свойств микроорганизма. Химические вещества, спо­собные оказывать бактерицидное действие на разные группы мик­роорганизмов, используют для дезинфекции, то есть для уничтоже­ния возбудителей инфекционных заболеваний в окружающей среде. Дезинфекция с помощью химических веществ в качестве со­ставляющей входит в совокупность мер, направленных на уничто­жение микроорганизмов не только в окружающей среде, но и в макроорганизме, например в ране, и является основой асептики и антисептики.

По химическому составу противомикробные антисептические вещества можно разделить на несколько групп:

1. Галогены - препараты йода и хлора, они нарушают фермента­тивные структуры бактериальной клетки, угнетают гидролитиче­скую и дегидрогеназную активность бактерий, инактивируют такие ферменты, как амилазы и протеазы.

2. Перекись водорода, перманганат калия - как и галогены, об­ладают окислительным действием.

3. Кислоты и их соли, щелочи, спирты и альдегиды повреждают поверхностные структуры бактериальной клетки, клеточную стенку и мембраны, нарушая их избирательную проницаемость и другие функции.

4. Соединения тяжелых металлов обладают антиферментным' механизмом действия на бактериальную клетку, например, они свя­зывают 8Н-группы белковых молекул, при этом изменяется структура дыхательных ферментов и разобщаются процессы окисления и фосфорилирования в митохондриях.

5. Красители - обладают денатурирующим и литическим эф­фектами.

К антисептическим химическим веществам относятся группы производных 8-оксихинолина (хинозол, нитроксалин, хинолон) и нитрофурана (фурацилин, фуразолидон), которые также нарушают биосинтетические и ферментативные процессы в бактериальной клетке.

К наиболее распространенным дезинфицирующим средствам относятся хлорсодержащие, фемольные, перекисные и аммониевые соединения.

ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Микроорганизмы обитают во всех природных средах и являются обязательными компонентами любой экологической системы и био­сферы в целом. Качественный и количественный состав микроорга­низмов, обнаруживаемых в почве, воде, воздухе, на растениях, пи­щевых продуктах, в организме человека и животных, различен.

Выяснение экологии микроорганизмов служит основой для по­нимания явлений паразитизма, природно-очаговых и зоонозных за­болеваний, а также для разработки противопаразитических меро­приятий в борьбе с различными инфекционными болезнями.

Микрофлора почвы

Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, которые принимают участие в процес­сах формирования и очищения почвы, а также круговорота веществ в природе.

Жизнедеятельность микроорганизмов в почве, их качественный и количественный состав определяются почвенными условиями; на­личием питательных веществ, влажностью, аэрацией, реакцией сре­ды, температурой и т.д.

Большое влияние как на общую численность, так и на соотно­шение отдельных систематических групп микроорганизмов оказы­вает тип почвы. Различаясь по физическим и химическим свойст­вам, почва представляет различную среду для жизнедеятельности микроорганизмов. Их больше в увлажненной и обработанной почве (4,2-5,2 млрд/т-), меньше в лесной почве, песках (0,9-1,2 млрд/г). Наиболее обильна микрофлора в верхнем горизонте почвы глубиной 2,5-15 см. В этом слое протекают основные биохимические процес­сы превращения органических веществ, обусловленные жизнедея­тельностью микроорганизмов. На глубине 4-5 м число микроорга­низмов значительно снижается, так как уменьшается количество пи­тательных веществ и ухудшаются условия аэрации.

В составе микрофлоры почвы выделяют следующие группы микроорганизмов:

1)бактерии-аммонификаторы, вызывающие гниение трупов жи­вотных, остатков растений, разложение мочевины с образованием аммиака и других продуктов: аэробные бактерии - В. зиЫШз, В. тезеШепсик, ЗетШатагсезсепз; бактерии рода Рго1еиз; грибы рода Азрег^Шиз, Мисог, РешсШшт; анаэробы - С. зрого§епез, С. ри1гШ-сит; уробактерии - ПгоЪасШиз ра51еип, Загста игеа, расщепляющие мочевину;

2) нитрифицирующие бактерии: Шгозотопаз и МНгоЪас^ег (Мь 1гозотопаз окисляют аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты, ШгоЪас1ег превращают азотистую кислоту в азотную и нитраты);

3) азогфиксирующие бактерии - усваивают из воздуха свобод­ный кислород и в процессе своей жизнедеятельности из молекуляр­ного азота синтезируют белки и другие органические соединения азота, используемые растениями;

4) бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов, - серобактерии, железобактерии и т.д. (серо­бактерии окисляют сероводород до серной кислоты, железобактерии окисляют соединения железа до гидрата окиси железа, фосфорные бактерии способствуют образованию легко растворимых соедине­ний фосфора);

5) бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие брожение (молочнокислые, спиртовые, маслянокислые, уксусные, протионо-вые и др.).

С выделениями человека и животных, с фекально-бытовыми сточными водами в почву могут попадать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (возбудители грибковых заболеваний, ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, бруцелле­за, лептоспироза, кишечных инфекций и др.).

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЫ

При исследовании почвы может проводиться полный или крат­кий анализ.

Полный санитарно-бактериологический анализ почвы проводится: а) для подробной и глубокой характеристики санитарного со­стояния почвы;

6) для определения пригодности почвы при размещении жилья, мест отдыха, детских учреждений и водопроводных сооружений; в) для эпидемиологических исследований.

Краткий анализ рекомендуется при осуществлении текущего са­нитарного надзора и включает определение общего количества са­профитных бактерий, бактерий группы кишечной палочки (БГКП) (коли-титр и коли-индекс), клостридий (перфрингенс-титр), термо­фильных бактерий, нитрифицирующих.

В полный санитарно-бактериологический анализ входит допол­нительно определение актиномицетов, грибов, сальмонелл, шигелл, возбудителей столбняка, ботулизма, бруцеллеза, сибирской язвы.

Подготовка

почвы

Почву освобождают от включений - камней, осколков стекла и др. Крупные агрегаты почвы дробят. Навеску почвы в количестве 30 г заливают стерильной водопроводной водой в соотношении 1:10. Полученную суспензию встряхивают 10 мин и отстаивают 2-5 мин. Из первого разведения 1:10 готовят ряд последующих 10-кратных разведении от 1:10 до 1:1 000 при исследовании чистых почв и до 1:10 000 при исследовании сильно загрязненных почв.

Определение общего количества сапрофитных бактерий (микробное число почвы)

Микробное число почвы - общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.

Посев почвенной суспензии производят на МПА в чашки Петри по 1 мл из каждого разведения. Затем в чашки выливают по 7-10 мл расплавленного и остуженного до 45 °С агара. Посевы инкубируют при 28-30 °С в течение 72 ч и подсчитывают количество выросших колоний. Если на чашке Петри вырастает более 150 колоний, то подсчет ведется на ¹А площади с последующим перерасчетом на всю площадь. Из суммы колоний, подсчитанных на всех чашках Петри, выводят среднее арифметическое и затем определяют количество микроорганизмов в 1 г почвы с учетом разведении.

Определение бактерий группы кишечной палочки Коли-индекс - количество жизнеспособных Е. соН в 1 г почвы.

При анализе малозагрязненных почв используют метод мем­бранных фильтров. При предполагаемой невысокой степени фе­кального загрязнения рекомендуется применение титрационного метода, при высокой степени - метод прямого посева почвенной сус­пензии (1:10) на среду Эндо.

Метод мембранных фильтров. Почвенную суспензию 1:10 центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, затем 5-10 мл суспензии фильтруют через мембранные фильтры №3 в аппарате Зейтца. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии. Чашки Петри инкубируют при 37 °С 24 ч. При на­личии в почве БГКП на фильтрах появляются колонии, типичные для кишечных палочек - темно-красные с металлическим блеском или розовые с красным центром. Из таких колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Для отличия бактерий семейства Еп1егоЬас1е-пасеае от Рзеис1отопао!асеае ставят оксидазный тест. Для этого на культуру микроорганизмов в чашке Петри наносят индикатор - 1% раствор диметилпарафенилендинитролазы. В положительном случае через 15-20 мин появляется темно-синее окрашивание. Колонии учитывают как БГКП, если они образованы грамотрицательными палочками, ферментирующими глюкозу до кислоты и газа и не об­ладающими протеолитической активностью.

Колонии подсчитывают на тех фильтрах, на которых из соответ­ствующего разведения почвенной суспензии выросло не более 30-50 колоний.

Пересчитывают количество выросших колоний на фильтрах на 1 г почвы и определяют коли-индекс.

Коли-титр почвы - наименьшее количество почвы, в котором обнаруживается жизнеспособная Е. соН.

Титрационный метод. Из приготовленных разведении почвен­ной суспензии делают посевы в питательную среду Кесслера (1% пептона, 5% желчи, 0,25% лактозы, генциановый фиолетовый). Из разведении 1:10 10 мл засевают во флакон с 50 мл среды, что соот­ветствует 1 г почвы. Посев меньших количеств (0,1 и 0,01) делают по 1 мл из соответствующих разведении почвенной суспензии в пробирки с 9 мл среды. Отсутствие во всех пробирках роста и газо­образования указывает на то, что БГКП нет. Если в посевах обна­руживается рост или рост и газообразование, делают высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розоловым агаром, инкуби­руют 24 ч при 37 °С и проводят дальнейшую идентификацию выде­ленных бактерий.Результат выражают в коли-титре. Определение перфрингенс-титраПерфрингенс-титр почвы - наименьшее весовое количество почвы, выраженное в граммах, в котором обнаруживается жизне­способная клетка С. регГпгпдепз.Определение перфрингенс-титра является важным критерием для санитарной оценки почвы и ее самоочищения, так как в почве, загрязненной фекалиями, уже через 4-5 мес эшерихии исчезают, а С. регп-т§еп5 обнаруживаются в титре 0,01. Перфрингенс-титр дает возможность судить о давности фекального загрязнения.Из приготовленных разведении почвенной суспензии по 1 мл переносят в два параллельных ряда пробирок. Один ряд прогревают при 80 °С 15 мин. Затем во все пробирки наливают по 9-10 мл рас­плавленной и охлажденной до 45 °С среды Вильсона- Блер. Инку­бацию посевов проводят при 43 °С 24 ч, но уже через 2-3 ч при по­ложительном результате можно наблюдать в толще агара образова­ние круглых колоний черного цвета. В мазках, приготовленных из колоний, видны характерные грамположительные палочки.

Определение термофильных бактерий.Учет термофильных бактерий производят на МПА, разлитом в чашки Петри более толстым слоем, чем обычно. Посев делают из разведении 1:10, 1:100, 1:1 000, причем из каждого разведения ре­комендуется засевать по 2-3 параллельные чашки. Термофильные бактерии выращивают при температуре около 60 °С. Результат учи­тывают через 24 ч после посева. Подсчет количества бактерий про­водят на 1 г почвы.Санитар но-микробиологическая оценка почвыЕе производят по комплексу показателей. Для санитарной оцен­ки почвы необходимо пользоваться показателями

Микрофлора воды

Вода является естественной средой обитания разнообразных микроорганизмов. Микрофлора воды делится на две группы: автохтонную и аллохтонную.Автохтонная, или собственная, микрофлора представлена мик­роорганизмами, постоянно живущими и размножающимися в воде. В состав этой группы входят: М1сгососсиз сапшсаш, Багета 1и1еа, Р$еиаотопа5 Пиогезсепз, ВасШиз сегеиз и др.Аллохтонная, или заносная, микрофлора попадает в открытые водоемы из почвы, воздуха, организмов животных и человека и резко изменяет микробный биоценоз и санитарный режим.

Количественный и качественный состав микрофлоры воды зави­сит от состава и концентрации минеральных и органических ве­ществ, температуры, _РН, скорости движения воды, массивности по­ступления ливневых, фекально-бытовых и промышленных сточных вод Количество микробов прямо пропорционально степени загряз­ненности водоемов. Особенно богаты микроорганизмами пруды, ручьи озера густо населенных районов. В закрытых водоемах (озе­ра пруды) наблюдается определенная закономерность в распреде­лении бактерий. Состав микроорганизмов различен на поверхности воды и на дне водоемов. Наиболее обильно заселена микроорганиз­мами вода на глубине 10-100 см. В более глубоких слоях их количе­ство значительно снижается. Ключевые воды и воды артезианских колодцев наиболее чисты.

Хотя вода и является неблагоприятной средой для существова­ния условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, отдельные их представители способны существовать в ней определенное вре­мя, а в некоторых случаях и размножаться. Многие годы в воде мо­гут сохраняться споры возбудителя сибирской язвы, несколько меэнтеровирусы, сальмонеллы, лептоспиры, несколько не­дель - возбудители холеры, дизентерии, бруцеллы.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ

Исследованию подлежат вода централизованного водоснабже­ния, колодцев, открытых водоемов, бассейнов, сточные воды.Определение спор сульфи тред уцирующих бактерий Сульфитредуцирующие клостридии, преимущественно С. рег-Гпгщепз, - спорообразующие анаэробные палочки, редуцирующие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 °С в течение 24 ч.

Определение сульфитредуцирующих клостридии проводят дву­мя методами: методом мембранных фильтров и прямым посевом.

Метод мембранных фильтров. Метод основан на фильтрова­нии воды через мембранные фильтры, выращивании посевов в же­лезосульфитном агаре в анаэробных условиях и подсчете черных ко­лоний.

Результаты анализа выражают числом КОЕ спор сулъфитреду-цируюших клостридии в 20 мл воды.

Метод прямого посева. Производят посев 20 мл воды в про­бирки с железосульфитным агаром (2 объема по 10 мл в 2 пробирки или 4 объема по 5 мл в 4 пробирки), инкубируют при 44 °С 24 ч и подсчитывают черные колонии.

Результаты выражают числом КОЕ в 20 мл воды.

Определение кол и фагов

Колифаги - вирусы, лизирующие кишечную палочку и обра­зующие зоны лизиса (бляшки) на бактериальном газоне.

Определение колифагов проводят прямым и титрационным ме­тодами.

Прямой метод. Исследуемую воду вносят в 5 стерильных чашек по 20 мл, в 6-ю - контрольную - воду не наливают. Затем во все чашки заливают расплавленный и остуженный до 45 °С агар с до­бавлением суточной культуры Е.соН штамма К₂ (1,5 мл смыва Е.соН в концентрации 109 на 150 мл агара). Перемешивают, оставляют для застывания и инкубируют при 37 °С 24 ч.

Учитывают результат подсчетом бляшек в чашках Петри в БОЕ (бляшкообразующих единицах) в 100 мл воды. В контрольной чаш­ке бляшки должны отсутствовать.

Титрационный метод. В основе метода - предварительное под-ращивание колифагов в среде обогащения в присутствии Е.соП и последующее выявление бляшек колифага на газоне Е.соП.Определение бактерий родов сальмонелла и шигелла

Для выявления патогенных энтеробактерий исследуемый объем воды (не менее 2-3 мл) засевают в среды обогащения (Мюллера-Кауфмана, магниевая среда) с последующим высевом на плотные селективные и дифференциально-диагностические среды - Плоски-рева, Эндо, Левина, висмутсульфитньтй агар. Выделенные культуры идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, биохими­ческим и серологическим свойствам.

Оценка воды по микробиологическим показателям

Критерии оценки воды разработаны дифференциально в зависи­мости от ее категории и назначения. Вода плавательных бассейнов по своим качествам должна соответствовать ЕОСТу питьевой воды (табл. 3).

Микрофлора воздуха

Микроорганизмы в воздухе находятся постоянно, несмотря на то, что атмосфера является неблагоприятной средой для их размно­жения, что обусловлено отсутствием питательных веществ и недос­татком влаги. Жизнедеятельность микроорганизмов в воздухе обес­печивают взвешенные частицы воды, слизи, пыли и т.д.

Атмосферный воздух и воздух закрытых помещений значитель­но различаются по количественному и качественному составу мик­рофлоры. Состав микрофлоры атмосферного воздуха зависит от ин-Раздел III

тенсивности солнечной радиации, ветра, метеоосадков, покрова почвы, плотности населения и др. Меньше всего микробов в воздухе над лесами, морями, снегами. Больше их приходится на слои возду­ха, расположенные над промышленными городами. В атмосферном воздухе находятся споры грибов, актиномицетов, бацилл, дрожжи, микрококки, сардины, стафилококки и др.

Обсемененность микроорганизмами воздуха закрытых помеще­ний превышает бактериальную загрязненность атмосферного возду­ха. Особенно велико число микроорганизмов в многолюдных обще­ственных помещениях. Воздух закрытых помещений содержит в ос­новном микрофлору дыхательных путей и кожи человека, многие представители которой способны переживать в воздухе в течение времени, достаточного для инфицирования людей.

Микроорганизмы, находящиеся в воздушной среде, могут явить­ся причиной различных инфекционных заболеваний - гриппа, анги­ны, кори, скарлатины и др.

САНЙТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗДУХА

Микробиологическое исследование атмосферного воздуха, а также воздуха жилых помещений, имеет большое значение при осуществлении его очистки от бактериального загрязнения как мера борьбы с аэрогенными инфекциями.

Объектом санитарно-бактериологического исследования являет­ся воздух лечебно-профилактических и детских учреждений, мест массового скопления людей, промышленных районов (табл. 4). Для оценки работы вентиляции проводят исследование воздуха на раз­личных этажах жилых зданий.

Исследование воздуха включает определение общего числа са­профитных бактерий, стафилококков, стрептококков, которые яв­ляются показателями биологической контаминации воздуха микро­флорой носоглотки человека. При исследование воздуха родильных домов, хирургических клиник определяют условно-патогенные мик­робы, вызывающие внутрибольничные инфекции.Методы отбора проб воздуха можно разделить на седиментаци-онные и аспирационные.

Седиментационный метод. Основан на оседании бактериаль­ных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытых чашек Петри. Их устанавливают в точках отбора на горизонтальной поверхности. Для определения общей микробной обсемененности воздуха чашки Петри с МПА оставляют открытыми на 5-10-15 мин в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Для выявления санитарно-показательных микроорга­низмов экспозиция чашек с элективными средами увеличивается до 30-60 мин. Инкубацию посевов проводят при 37 °С 24 ч, затем чаш­ки Петри оставляют при комнатной температуре на 48 ч для образо­вания пигмента пигментообразующими бактериями.

Для определения микробного числа подсчитывают колонии, вы­росшие па чашках Петри (площадь поверхности агара в чашке равна 75 см") и расчет ведут по правилу В.Л. Омелянского: па поверхность площадью 100 см2 за 5 мин оседает такое количество микробов, ко­торое содержится в 10 л воздуха; А- 100- 100

где X - количество микробов в 1 м"; А - количество колоний на ага­ре в чашке Петри.

Аспирационный метод. Основан на принудительном оседании микроорганизмов на поверхность плотной питательной среды или в улавливающую жидкость. Для этой цели используются аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор ПОВ-1 и др.

Для определения общего числа бактерий забирают две пробы по 100 л каждая. Посевы инкубируют в термостате 24 ч, а затем остав­ляют на 48 ч при комнатной температуре. Подсчитывают количест­во колоний на чашках, вычисляют среднее арифметическое и дела­ют перерасчет на количество микроорганизмов в 1 м'¹ воздуха.

Определение стафилококков

Обнаружение патогенных стафилококков в воздухе закрытых помещений имеет санитарно-показательное значение и свидетельст­вует об эпидемическом неблагополучии (табл. 5), Отбор проб про­водят с помощью аппарата Кротова в количестве 250 л воздуха на 2 чашки Петри с молочно-солевым агаром и на чашку с кровяным агаром. Посевы инкубируют при 37 °С 48 ч. Из подозрительных на стафилококк колоний выделяют чистую культуру на скошенном агаре. После 24 ч инкубации при 37 °С проверяют плазмокоагули-ругощую активность культуры.

При необходимости установления источника возникновения стафилококковой инфекции и путей ее распространения проводят фаготипирование культуры.Подсчитывают количество выросших колоний стафилококка в 1 м воздуха.

Определение стрептококков

Отбор проб воздуха при исследовании на наличие а- и |3-гемолитических стрептококков проводят аппаратом Кротова на чашках Петри с кровяным агаром. Исследуют 250 л воздуха. Посевы выдерживают в термостате 24 ч, а затем еще 48 ч при комнатной температуре. Подсчет количества выросших колоний проводят на 1 м с последующим контрольным микроскопированием и выбороч­ным пересевом колоний на кровяной агар или сахарный бульон.

Микрофлора организма человека

Микрофлору человека составляет совокупность микробных био­ценозов, встречающихся в организме здоровых людей и сформиро­вавшихся в процессе эволюции. Данные биоценозы характеризуют­ся относительным постоянством, однако качественный и количест­венный состав микрофлоры организма человека меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста, питания, климата и др. Кроме того, изменения микробных биоценозов могут быть обусловлены возникновением заболеваний, применением химиотерапевтических и иммунологических средств.

Микроорганизмы заселены в кожные покровы и слизистые обо­лочки многих органов и полостей, сообщающихся с внешней сре­дой. Кровь, лимфа, внутренние органы, головной и спинной мозг, спинномозговая жидкость стерильны.

Микрофлору организма человека можно условно разделить на две группы: облигатную (или резидентную, аутохтонную) и факуль­тативную (или транзиторную). К облигатной микрофлоре относятся микроорганизмы, максимально приспособленные к существованию в организме человека и закономерно встречающиеся в его органах и полостях. Факультативная микрофлора является временной, необязательной и определяется микробной обсемененностью окружаю­щей среды и срстоянием резистентности организма человека. В со­став резидентной и транзиторной микрофлоры входят сапрофитные и условно-патогенные микроорганизмы.

В последнее время все большее значение в патологии человека приобретают внутрибольничные, или госпитальные, инфекции, воз­будителями которых являются условно-патогенные микроорганиз­мы, относящиеся к резидентной микрофлоре человека. Их патоген-ность реализуется при ослаблении резистентности макроорганизма.

Микрофлора отдельных биотопов тела человека различна и тре­бует отдельного рассмотрения.

Микрофлора кожи

Поверхность кожи человека, особенно открытые ее части, обсе­менена различными микроорганизмами, здесь определяется от 25 млн до 1 млрд особей микробов.Собственная микрофлора кожи человека представлена сардина­ми, стафилококками, дифтероидами, некоторыми видами стрепто­кокков, бациллами, грибами и др.Кроме характерной для кожи микрофлоры здесь могут присут­ствовать трапзиторные микроорганизмы, быстро исчезающие под влиянием бактерицидных свойств кожи. Большой способностью к самоочищению обладает чисто вымытая кожа. Бактерицидность ко­жи отражает общую резистентность организма.Неповрежденные кожные покровы для большинства микроорга­низмов, в том числе и патогенных, непроницаемы. При нарушении их целостности и понижении резистентности организма могут воз­никать заболевания кожи.

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОЖИ

Санитарно-бактериологическое исследование кожи проводится двумя методами:

1) посев отпечатков пальцев рук на МПА в чашках Петри с по­следующим макроскопическим и микроскопическим изучением вы­росших колоний;

2) посев смывов с кожи для определения общего микробного числа и кишечной палочки.

Тампоном, смоченным в 10 мл стерильного физиологического раствора, тщательно протирают ладони, подногтевые, межпальценые пространства обеих рук. Тампон прополаскивают в пробирке с физиологическим раствором и исходный смыв исследуют на общее микробное число и наличие кишечной палочки.

Определение общего микробного числа

1 мл смыва помещают в стерильную чашку Петри, наливают 12-15 мл расплавленного и остуженного до 45 ° МПА, перемешивают содержимое чашки, и после застывания агара посевы инкубируют при 37 ^йС 24—48 ч. Подсчет выросших колоний на поверхности и в глубине агара можно производить при помощи лупы.

Определение кишечной палочки Оставшееся количество смыва помещают в пробирку с глкжозо-пептонной средой. Посевы инкубируют при 43 °С 24 ч. При наличии газообразования производят высев на среду Эндо. Рост на этой сре­де красных колоний укажет на наличие в смыве кишечной палочки, свидетельствующей о фекальном загрязнении рук.

Микрофлора полости рта

В ротовой полости имеются благоприятные условия для разви­тия микроорганизмов: наличие питательных веществ, оптимальная температура, влажность, щелочная реакция слюны.

В поддержании качественного и количественного постоянства нормальной микрофлоры полости рта главную роль играет слюна, обладающая антибактериальной активностью за счет содержащихся в ней ферментов (лизоцим, лактоферрин, пероксидаза, нуклеаза) и секреторных иммуноглобулинов.

В ротовой полости новорожденных к концу первой недели обна­руживаются стрептококки, нейссерии, лактобактерии, дрожжепо-добные грибы, актиномицеты. Количественный и видовой состав микробов полости рта зависит от диеты и возраста ребенка. Во вре­мя прорезывания зубов появляются облигатные грамотрицательные анаэробы.

В роговой полости обнаруживается более 100 видов микроорга­низмов, большинство из которых аэробы и факультативные ана­эробы.

Основная масса микроорганизмов полости рта локализуется в зубном налете: в 1 мг сухой массы зубного налета содержится около 250 млн микробных клеток. Большое количество микроорганизмов обнаруживается у шейки зуба, в промежутке между зубами и в дру­гих участках полости рта, малодоступных обмыванию слюной, а также на слизистых глоточных миндалин. Индивидуальные колеба­ния в качественном и количественном составе микрофлоры полости рта зависят также от гигиенических навыков, резистентности слизи­стой оболочки, наличия патологических процессов в зубах и деснах.

Резидентную группу бактерий полости рта составляют стрепто­кокки (Зп-ергососсиз заНуапиз), непатогенные стафилококки, сапро­фитные нейссерии, коринобактерии, лактобациллы, бактероиды, фу-зиформные бактерии, дрожжеподобные грибы, актиномицетьт, ми-коплазмы (М. ош!е), простейшие (Еп1атоеЪа ЬиссаНк).

Среди факультативных микроорганизмов встречаются: энтеро-бактерии (роды ЕзИепстпа, КИеЫеНа, Еп1егоЬас!ег, Рго!еиз), синег-ноиная палочка, спорообразующие бактерии (роды ВасШик, Оозтё-шт), микроорганизмы рода Сатру1оЪас1;ег (С- сопкюш, С. зрШошт).

Для качественного и количественного изучения микрофлоры полости рта используют бактериоскопический и бактериологиче­ский методы исследования.

Бактериоскопический метод. Исследуемым материалом явля­ется зубной налет. Мазок окрашивают по Граму или Бурри и изуча­ют морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов.

Бактериологический метод. Материалом для исследования яв­ляется слизь из зева, которую забирают при помощи стерильного ватного тампона. Делают посев этим же тампоном штрихами на чашку Петри с кровяным агаром. После суточной инкубации при 37 °С из выросших колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и изучают морфологические и тинкториальные свойства выделенной культуры микроорганизмов.

Микрофлора желудочно-кишечного тракта

При нормальном функционировании желудка микрофлора в нем почти отсутствует вследствие кислой реакции желудочного сока и высокой активности гидролитических ферментов. Поэтому в желуд­ке могут быть обнаружены в небольшом количестве кислотоустой­чивые виды - лактобактерии, дрожжи, Загсша уегдтюиН и др. (10^б-10 клеток на 1 мл содержимого).

В двенадцатиперстной и верхних отделах тонкой кишки микро­организмов встречается мало, несмотря на то, что кислая среда же­лудка сменяется щелочной. Это объясняется неблагоприятным воздействием на микробы присутствующих здесь ферментов. Тут обна­руживаются энтерококки, молочнокислые бактерии, грибы, дифте-роиды (10^б клеток на 1 мл содержимого). В нижних отделах тонкой кишки, постепенно обогащаясь, микрофлора сближается с микро­флорой толстой кишки.

Микрофлора толстой кишки наиболее разнообразна по числу видов (более 200) и количеству обнаруживаемых микробов (10⁹-10 ^! клеток на 1 мл содержимого). Микробы составляют 1/3 сухой массы фекалий.

Облигатная микрофлора состоит из анаэробных (бактероиды, бифидумбактерии, вейлонеллы) бактерий (96-99%) и факультатив­ных анаэробов (Е. соП, энтерококки, лактобациллы - 1—4%).

Транзиторная микрофлора представлена такими родами и вида­ми, как протей, клебсиеллы, клостридии, синегнойная палочка, кам-пилобактер, дрожжеподобные грибы рода СапсШа и др. Микроорга­низмы рода Сатру1оЬас!ег (С. йппеШае, С. стаей!, С. НуотТезгшаНз) встречаются в толстом кишечнике человека при иммунодефицитных состояниях различной природы.

Состав микрофлоры кишечника меняется в течение жизни чело­века.

У новорожденных в первые часы после рождения меконий сте­рилен - асептическая фаза. Вторая фаза - фаза возрастающей обсе-мененности (первые три дня жизни ребенка). В этот период в ки­шечнике преобладают эшерихии, стафилококки, энтерококки, дрожжеподобные грибы. Третья фаза - фаза трансформации флоры кишечника (начиная с 4-го дня жизни). Устанавливается молочно­кислая микрофлора, лактобактерии, ацидофильные бактерии.

После окончания грудного вскармливания начинает постепенно формироваться постоянный биоценоз в пищеварительном тракте.

В микрофлоре желудочно-кишечного тракта различают мукоз-ную (М) и просветную (П) микрофлоры, состав которых различен. М-флора тесно ассоциирована со слизистой оболочкой, более ста­бильна и представлена бифидумбактериями и лактобактериями. М-флора препятствует пенетрации слизистой оболочки патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. П-флора наряду с бифи-дум- и лактобактериями включает и других постоянных обитателей кишечника.

Для изучения микрофлоры толстого кишечника исследованию подвергают испражнения, которые забирают стерильной деревянной или стеклянной палочкой и помещают в пробирку с консервантом.

Материал доставляют в лабораторию в течение часа, так как при более длительном хранении значительно нарушаются взаимоотно­шения между видами.Проводят микроскопическое исследование мазков и фекалий, окрашенных по Граму, а также производят посев испражнений на питательные среды: Эндо, кровяной агар, молочно-солевой агар, агар Сабуро. Посев производят с таким расчетом, чтобы можно бы­ло подсчитать количество колоний с различной характеристикой и определить число микробных клеток разных видов микроорганиз­мов в данной пробе. При необходимости проводят биохимическую идентификацию и серологическое типирование видов.

Микрофлора дыхательных путей

В дыхательные пути вместе с воздухом попадают пылевые час­тички и микроорганизмы, большая часть которых задерживается в полости носа, где и погибают через некоторое время вследствие бактерицидного действия лизоцима и муцина, защитной функции эпителия, деятельности фагоцитов. В состав облигатной микрофло­ры носовых ходов входят стафилококки, коринебактерии. Факульта­тивная микрофлора представлена золотистым стафилококком, стрептококками, непатогенными нейссериями. Микрофлора носо­глотки состоит из стрептококков, бактероидов, нейссерий, вейло-нелл, микобактерий,

Слизистая оболочка трахеи и бронхов стерильна. Мелкие брон­хи, альвеолы, паренхима легких человека свободны от микроорга­низмов.

Для микробиологического исследования материал из носа и из носоглотки берут стерильными тампонами. Делают посев на кровя­ной и желточно-солевой агары. Выделенную культуры идентифи­цируют. Материал, оставшийся на тампоне, используют для приго­товления мазков, которые окрашивают по Граму и Нейссеру.

Микрофлора конъюнктивы

В значительном проценте случаев микрофлора конъюнктивы от­сутствует, что обусловлено бактерицидными свойствами слезной жидкости. В отдельных случаях на конъюнктиве глаза могут обна­руживаться стафилококки, коринебактерии (СогупеЬас^егшт хего51з), микоплазмы. При снижении естественной защиты организма, нарушении зрения, гиповитаминозах нормальная микрофлора слизистых оболочек глаз может вызывать различные заболевания: конъюнкти­виты, блефориты и другие нагноительные процессы.

Микрофлора уха

В наружнем слуховом проходе обнаруживаются непатогенные стафилококки, коринебактерии, дрожжеподобные и плесневые гри­бы (Аарег^Шиз), которые в определенных условиях являются возбу­дителями патологических процессов. Во внутреннем и среднем ухе микробы в норме не содержатся.

Микрофлора мочеполовой системы

Почки, мочеточники и моча в мочевом пузыре стерильны. В мо­чеиспускательном канале мужчин обитают стафилококки, дифте-роиды, бактероиды, микобактерий, грамотрицательные непатоген­ные бактерии. Уретра женщин стерильна.

На наружных половых органах мужчин и женщин обнаружива­ются микобактерий смегмы (М. зте^тапз), стафилококки, корине­бактерии, микоплазмы (М. Ьогшшз), сапрофитные трепонемы.

Состав влагалищной микрофлоры разнообразен, непостоянен и зависит от уровня гликогена в клетках эпителия и рН влагалищного секрета, что связано с функцией яичников.

Заселение влагалища лактобактериями происходит сразу после рождения. Затем в микробиоценоз включаются энтерококки, стреп­тококки, стафилококки, коринебактерии. Кокковая флора становит­ся ведущей и характерной для периода детства вплоть до наступле­ния полового созревания. С наступлением половой зрелости в со­ставе микрофлоры преобладают аэробные и анаэробные молочно­кислые бактерии, доминирует группа бактерий Додерлейна.

Различают несколько категорий чистоты влагалища здоровых женщин: 1-я категория - в мазках-препаратах обнаруживаются па­лочки Додерлейна, других видов микроорганизмов почти нет; 2-я категория - кроме молочнокислых бактерий встречается небольшое количество грамположительных диплококков; 3-я категория -уменьшается количество молочнокислых бактерий, увеличивается количество лейкоцитов и другой микрофлоры; 4-я категория -обильное количество лейкоцитов и различной микрофлоры, палочки Додерлейна почти отсутствуют. 1-я и 2-я категория наблюдается у здоровых женщин, 3-я и 4-я - у женщин с воспалительными процес­сами во влагалище.Полость матки у здоровых женщин стерильна.

Значение нормальной микрофлоры организма человека

Эволюционно сложившиеся отношения человека с его микро­флорой играют важную роль в нормальном функционировании ор­ганизма. Положительная роль нормальной микрофлоры связана с витаминизирующим, ферментативным, антагонистическим и други­ми свойствами.

Облигатная микрофлора (кишечная палочка, лактобактерии, би-фидумбактерии, некоторые виды грибов) обладает выраженными антагонистическими свойствами в отношении некоторых возбуди­телей инфекционных заболеваний.

Антагонистические свойства нормальной микрофлоры связаны с образованием антибиотических веществ, бактериоцинов, спиртов, молочной кислоты и других продуктов, ингибирующих размноже­ние патогенных видов микроорганизмов.

Некоторые энтеробактерии (Е. соН) синтезируют витамины группы В, витамин К, пантотеновую и фолиевую кислоты, в кото­рых нуждается макроорганизм. Активными продуцентами витами­нов также являются молочнокислые бактерии.

Велика роль микрофлоры в формировании резистентности орга­низма. При нарушении состава нормальной микрофлоры у гнотоби-онтов (безмикробных животных) наблюдается гипоплазия лимфоид-ной ткани, снижение клеточных и гуморальных факторов иммунитета. Микрофлора желудочно-кишечного тракта оказывает влияние на морфологическую структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность; расщепляя сложные органические ве­щества, эти микроорганизмы способствуют пищеварению. Установ­лено, что такой постоянный обитатель кишечника, как С. регй-]п§еп5, обладает свойством вырабатывать пищеварительные ферменты.

Для нормального функционирования организма человека важ­ным является взаимоотношение макроорганизма и населяющей его микрофлоры. При нарушении сложившихся взаимоотношений, при­чиной которых могут быть переохлаждение, перегревание, ионизи­рующая радиация, психические воздействия и др., микробы из мест своего обычного обитания распространяются, проникая во внутрен­нюю среду и вызывая патологические процессы.

Дисбиоз

Дисбиоз- качественное и количественное нарушение экологи­ческого баланса между микробными популяциями в составе микро­флоры организма человека. Дисбиоз возникает при воздействии дестабилизирующих факторов, таких как нерациональное использо­вание антибиотиков широкого спектра действия, антисептиков, рез­кое снижение резистентности организма, вследствие хронических инфекций, радиации и др.

При дисбиозах происходит угнетение представителей нормаль­ной микрофлоры, регулирующих состав микробного биоценоза и подавляющих размножение условно-патогенных микроорганизмов. Таким путем происходит нарастание и распространение микроорга­низмов из родов Рзеийотопаз, К1еЬз1е11а, Рго1еш, являющихся при­чиной впутрибольничных инфекций, дрожжеподобных грибов Саи-сИо'а аШюапз, вызывающих кандидозы, Е. соП, являющейся возбуди­телем колиэнтеритов, и др.

Для лечения дисбиозов применяются эубиотики, препараты, по­лучаемые из живых микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры организма человека. К этим препаратам относятся ко-либактерин (живые бактерии кишечной палочки, штамм М-17), би-фидумбактерин (взвесь живых В. ЫШшп, штамм п 1), лактобакте-рин (взвесь живых штаммов Ьас1оЬас1;егшт), бификол (комплексный препарат, состоящий из взвеси живых бифидумбактерий и кишеч­ных палочек).

Микрофлора пищевых продуктов

Многие пищевые продукты являются благоприятной средой не только для сохранения, но и для размножения микроорганизмов.

Всю микрофлору пищевых продуктов условно делят на специ­фическую и неспецифическую.

К специфической микрофлоре относят штаммы микроорганиз­мов, применяющихся в процессе технологического производства продуктов питания (молочнокислые продукты, хлебные изделия, пиво, вина и др).

К неспецифической микрофлоре относят случайную микрофло­ру, попадающую в пищевые продукты при их заготовке, доставке, переработке и хранении. Источником этих микробов может быть сырье, воздух, вода, оборудование, животные, человек.

Инфицирование пищевых продуктов микроорганизмами может приводить к возникновению у людей пищевых токсикоинфекций и других заболеваний.

Микробиологические критерии безопасности пищевых продук­тов делят на четыре группы:

1. Санитарно-показательные микроорганизмы: БГКП, при этом учитываются бактерии рода ЕзсЬепсЫа, К1еЬ81е11а, СНгаЪас1:ег, Еп-!егоЪас(ег, Зеггайа.

2. Потенциально-патогенные микроорганизмы: коагулазополо-жительные стафилококки, бактерии рода РгсЛеиз, сульфитредуци-рующие клостридии, В. сегеиз.

3. Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы.

4. Микроорганизмы - показатели микробиологической стабиль­ности продукта (дрожжи, грибы-плесени).

САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Взятие проб

Отбор проб проводят стерильно, стерильными приспособления­ми, в стерильную посуду. Пробы помещают в соответствующую та­ру, пломбируют. Транспортировку осуществляют в сумках-холодильниках в кратчайшие сроки.

Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение общего микробного числа и титра санитарно-показательных микроорганизмов.

Определение общего микробного числа

ОМЧ - общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (см ) продукта. Для его определения используют метод кратных раз-ведений и метод продольных разведении.

Метод кратных разведении. При исследовании плотных суб­стратов навеску измельчают в гомогенизаторе или растирают в ступке с кварцевым песком и готовят исходную взвесь в разведении 1:10. Из полученной взвеси или исходного жидкого материала гото­вят ряд последующих разведении с таким расчетом, чтобы при по­севе двух последних разведении на чашке Петри в агаре выросло от 50 до 300 колоний. Из последних двух разведении по 1 см"¹ вносят в чашку и заливают 10-15 мл расплавленного и остуженного до 45 °С

МПА. Чашки инкубируют при 37 °С 48 ч, подсчитывают количество выросших колоний. ОМЧ определяют с учетом разведения иссле­дуемого материала.

Метод предельных разведении (титр). Из исходного жидкого материала готовят ряд десятикратных разведении до тех пор, пока в последней пробирке можно будет предположить наличие одной бак­териальной клетки. Посев делают в жидкую селективную среду с последующим выделением микроорганизмов на твердой питатель­ной среде и изучением их характеристики.

За титр принимают то наименьшее количество субстрата, в ко­тором обнаружена одна особь искомого микроорганизма.

Определение санитарно-показательных микроорганизмов

Санитарно-показательные микроорганизмы характеризуют про­дукт с точки зрения эпидемической опасности.

Основными санитарно-показательными микроорганизмами счи­тают БГКП и для количественного учета используют методы опре­деления количества и титра. При этом под количеством понимают определение наиболее вероятного числа (НВЧ) БГКП в единице массы или объема продукта.

Определение НВЧ БГКП

Для определения НВЧ из жидкого продукта или исходной взве­си плотного последовательно делают разведения 10"', 10~², КГ¹, из которых по 1 см засевают в три пробирки со средой Кесслера для каждого разведения. Через 24 ч инкубации при 37 °С в пробирках регистрируются изменения цвета среды и газообразование. В зави­симости от количества проросших пробирок определяют НВЧ ко-лиформных бактерий.

Определение титра БГКП Готовят десятикратные разведения анализируемого материала и высевают на среду Кесслера для выявления наименьшего количест­ва продукта, в котором присутствует кишечная палочка. Посевы термостатируют при 43 °С в течение 18-24 ч. Из каждой пробирки производят высев на чашки Петри со средой Эндо так, чтобы полу­чить рост отдельных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С 18-24 ч, после чего из выросших колоний делают мазки, окрашива

ют по Граму. При выявлении в мазках грамотринательных палочек колонии пересевают на среды Гисса с глюкозой. Наличие газообра­зования в пробирках с посевами указывает на присутствие БГКП.

Титр устанавливают по наименьшему количеству продукта, в котором обнаружены БГКП, или по стандартным таблицам.

В оценке пищевых продуктов по микробиологическим показате­лям необходимо учитывать возможность обнаружения патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Продукты питания анализи­руют на наличие сальмонелл, сульфитредуцирующих клостридий, стафилококков, протея. При более широком исследовании продукты изучают на грибковую флору.

Для исследования на сальмонеллы из анализируемых продуктов готовят суспензию и засевают на среды накопления (селенитовый, хлористо-мап-шевый бульоны). После суточной инкубации при 37 °С производят пересев на среды Эндо, Левина, Плоскирева или висмутсульфитный агар. Далее колонии идентифицируют путем учета характеристики роста на средах Гисса, Ресселя, Олькеницкого и в реакции агглютинации с монорецепторными сыворотками.

Для выявления сульфитредуцирующих клостридий проводится посев исследуемого материала в две пробирки со средой Кита - Та-роцци, Вильсона-Блер или казеиново-грибной. Одну пробирку про­гревают при 80 °С для уничтожения сопутствующей микрофлоры. Инкубируют посевы при 37 °С 5 сут. При наличии характерного роста достаточно констатировать в мазках специфическую микро­флору и при необходимости провести проверку токсинообразова-ния в биопробе на белых мышах.

Для выявления стафилококков исследуемый материал засевают на желточно-солевой агар. Посевы инкубируют в термостате 24 ч. Подозрительные на стафилококки колонии окрашивают по Граму, делают их пересев на молочный агар и проводят дальнейшую иден­тификацию выделенной культуры.

Для выявления протея производят посев исследуемого материа­ла на скошенный агар методом Шукевича. После суточной инкуба­ции с верхнего края роста делают мазки и при наличии в них гра-мотрицательных полиморфных бактерий делают заключение о вы­делении протея, при необходимости используют биохимическое и антигенное типирование.

Микрофлора лекарственных растений, лекарственного сырья и готовых лекарств

Микроорганизмы являются постоянными спутниками не только человека и животных, но и в равной степени высших растений, в том числе используемых в качестве лекарственного сырья. Микро­организмы поселяются и ведут активный образ жизни как на по­верхности, так и внутри зеленых частей растений, их корней, семян, плодов. Для приготовления лекарств используются самые разнооб­разные растения, и работники аптечных учреждений, фармацевтиче­ских фабрик и заводов должны обеспечивать защиту лекарственного сырья от микробной порчи.

Все микроорганизмы, населяющие лекарственные растения, можно разделить на две группы:

1) представители нормальной микрофлоры растений;

2) фитопатогенные микроорганизмы - возбудители заболеваний растений.

Нормальная микрофлора растений представлена ризосферными и эпифитными микробами.

Зона почвы, находящаяся в контакте с корневой системой расте­ний, носит название ризосферы, а микроорганизмы, развивающиеся в данной зоне, называются ризосферными. Условно различают два типа ризосферы; ближнюю и отдаленную.

Ближняя располагается непосредственно на поверхности корней и извлекается вместе с ними, отдаленная начинается на расстоянии нескольких миллиметров от корней и распространяется в радиусе 50 см от них. Количество микроорганизмов в ближней и отдаленной ризосферах различно; на поверхности корней их от 50 млн до 10 млрд, на расстоянии 15 см от корней - до 5 млн в 1 г почвы. Число микроорганизмов в ризосфере в 100 раз больше, чем в почве, где растения не произрастают, что связано с выделением корнями рас­тений различных питательных веществ. В свою очередь, почвенные микробы могут оказывать благоприятное воздействие на жизнь рас­тений, что обусловлено:

1) минерализацией органических веществ и растительных ос­татков;

2) образованием витаминов, аминокислот, ферментов и других факторов роста, усиливающих ферментативные процессы в растени­ях и способствующих усилению корневого питания и более энер­гичному обмену веществ растений;

Санитарная микробиология, её задачи

Широкое распространение микробов в окружающей среде имеет огромное и разнообразное значение.

С одной стороны, микробам принадлежит важнейшая роль в процессах, имеющих решающее значение для существования жизни на Земле, с другой - наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в окружающей среде может стать причиной за­ражения человека и животных.

Главной задачей санитарной микробиологии является раннее обнаружение патогенной микрофлоры а окружающей среде.

В связи с этим проводится:

1) изучение качественного и количественного состава микро­флоры объектов окружающей среды;

2) изучение биоценозов, в которых существуют патогенные для человека микроорганизмы;

3) разработка методов микробиологических исследований объ­ектов внешней среды и микробиологических нормативов.

Санитарно-бактериологические исследования лежат в основе практической работы санитарных врачей и эпидемиологов при са­нитарной оценке объектов окружающей среды и играют важную роль в борьбе с инфекционными заболеваниями.

Влияние биологических факторов на микроорганизмы

Микроорганизмы, как и все другие существующие в природе живые существа, представлены не обособленно, а в виде многооб­разных ассоциаций, сообществ или популяций, которые населяют почву, воздух и воду, а также организмы животных, человека и рас­тения. В состав микробных ассоциаций (биоценозов) входит боль­шое количество разнообразных по видовому составу и различных по численности бактерий и грибов. Между ними постоянно осуществ­ляются сложные взаимоотношения, которые выработались в про­цессе эволюции, направлены на выживание вида и основаны на вза­имной или односторонней зависимости организмов.

Совместное существование двух или большего количества орга­низмов называется симбиозом (от греческого 5пттЫо515 - совместная жизнь), а сами организмы, принимающие участие в таких взаимоот­ношениях, - симбионтами.

Симбиоз может выражаться по-разному, поэтому принято выде­лять несколько форм или вариантов взаимодействия между биоло­гическими особями.

Мутуализм ~ взаимовыгодные отношения разных организмов. Классическим примером таких взаимоотношений является сосуще­ствование макрооргапизма и его нормальной микрофлоры. Когда эти отношения нарушаются и микрофлора гибнет, например под влиянием антибиотиков широкого спектра действия, макроорганизм страдает в результате развития дисбактериоза. Примером мутуализ­ма могут служить взаимоотношения одного из видов грибов рода Мукор и дрожжей из рода Родоторула. Оба этих представителя для своего развития нуждаются в витамине В1 (тиамине), однако ни один из этих видов не способен по отдельности синтезировать тиа-мин, так как гриб может синтезировать только один из предшест­венников тиамина - пиримидин, а дрожжи - тиазол. В совместной культуре этих видов синтезируется тиамин и удовлетворяются по­требности того и другого микроорганизма.

Метабиоз - тип взаимодействия организмов, при котором один из участников ассоциации использует для своих потребностей про­дукты жизнедеятельности другого. Метабиоз характерен для поч­венных нитрифицирующих бактерий, которые используют для сво­его метаболизма аммиак - продукт жизнедеятельности аммонифи­цирующих бактерий.

Саттелизм - усиление роста одного микроорганизма под влия­нием другого. При совместном росте нескольких видов бактерий и грибов их физиологические функции могут активизироваться, что приводит к более быстрому воздействию на субстрат. Например, сардины и дрожжи выделяют в питательную среду метаболиты, стимулирующие вокруг их колоний рост других микроорганизмов.

Комменсализм, (от лат. соттешаПз - сотрапезник) ~ это такая форма сосуществования, при которой питание микроорганизмов происходит за счет макроорганизма, который при этом, как прави­ло, не испытывает вреда. Комменсалами являются бактерии - пред­ставители нормальной микрофлоры человека и животных. Они обильно заселяют верхние дыхательные пути, кожные покровы, ки­шечник. Среди бактерий-комменсалов много сапрофитов, но встре­чаются и условно-патогенные микроорганизмы, которые могут стать возбудителями различных, чаще всего гнойно-воспалительных за­болеваний. 128

Сипергизм - такая форма взаимоотношений микроорганизмов в биоценозе, при которой усиливаются биологические функции мик­робов, входящих в ассоциацию. Например, уксуснокислые бактерии в процессе метаболизма вырабатывают органические кислоты, сти­мулирующие размножение дрожжей.

Крайняя форма проявления симбиоза- паразитизм. При этой форме взаимоотношений один из организмов использует другой в ка­честве источника питания и метаболирует за счет этого источника. Пример паразитизма - взаимоотношения бактерий и бактериофагов, клеток макроорганизма и внутриклеточных паразитов: вирусов, хла-мидий и риккетсии, которые могут существовать и репродуцироваться только за счет клетки-хозяина. Частный случай паразитизма - хищни­чество, например амеба, обитающая в толстом кишечнике человека в качестве симбионта, захватывает и переваривает бактерии-сапрофиты, представители нормальной микрофлоры кишечника, которые также являются участниками данного биоценоза или ассоциации.

Одной из форм симбиоза является антагонистический симбиоз, или антагонистические взаимоотношения между микроорганизма­ми. При этом один из партнеров в биоценозе наносит вред другому, приводит к его гибели или повреждению. Микробы-антагонисты широко распространены в окружающей среде. Антагонизм проявля­ется за счет большей скорости размножения, продукции органиче­ских кислот и других веществ, приводящих к изменению величины рН, выработке токсических продуктов. Среди представителей нор­мальной микрофлоры человека множество микроорганизмов - анта­гонистов. Бифидобактерии, кишечная палочка, лактобактерии - ан­тагонисты многих патогенных микроорганизмов, в частности клост-ридий, энтеропатогеиных бактерий, а также грибов рода СапсНёа. Антимикробный потенциал бактерий-антагонистов формируется за счет их способности выделять кислоты, спирты, лизоцим, колицины и другие бактериоцины.

К распространенной форме антагонизма относится способность живых организмов к выделению антибиотиков - специфических ко­нечных продуктов направленного синтеза клетки. Продукцию анти­биотиков могут осуществлять клетки животных и растений, бакте­рии, грибы, актиномицеты, лишайники. Антибиотики ингибируют жизнедеятельность многих бактерий и грибов или уничтожают их.

Генетическая система бактерий

Генетическая система бактерий состоит из ядерных и внеядер-ных структур. Аналог ядра прокариотов значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Он представлен пуклеоидом, лишен­ным оболочки и включающим в себя почти всю ДНК бактерии. Бак­териальная хромосома состоит из одной двупитевой молекулы ДИК кольцевой формы. Молекула ДНК построена из двух полинуклео-тидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основа­ния, сахара дезоксирибозы и фосфатной группы. Азотистые основа­ния представлены пуринами (аденин, гуанин) и пиримидинами (ти-мин, цитозин). Каждый нуклеотид обладает полярностью. У него имеются дезоксирибозный З'-конец и фосфатный З'-конец. Нуклео-тиды соединяются в полинуклеотидную цепочку фосфодиэфирными связями между 5'-концом одного нуклеотида и З'-концом другого. Соединение между двумя цепочками обеспечивается водородными связями комплементарных азотистых оснований: аденина с тими-ном, гуанина с цитозином. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом конце линейной молекулы ДНК расположены 5'-конец од­ной цепи и З'-конец другой цепи.

Наследственная информация у бактерий хранится в форме по­следовательности нуклеотидов ДНК, которая определяет последова­тельность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой геи, то есть дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нук­леотидов. Бактериальная хромосома содержит до 4 000 отдельных генов. Совокупность всех генов называется ееномом. Внешнее про­явление генома называется фенотипом. Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Ргосагуо1ае варьи­руют от З'Ю до2,5'10 Д. Бактериальная клетка гаплоидна, а удвое­ние хромосомы всегда сопровождается ее делением.

Генетическая информация в бактериях может содержаться во внеядерных (внехромосомных) молекулах ДНК, представленных плазмидами, транспозонами и инсерционными (вставочными) по­следовательностями. Они не являются жизненно необходимыми, так как не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в метаболизме бактериальной клетки.

Плазмиды бактерий представляют собой двунитевые молекулы ДНК размером от 10⁶ до 10 Д, несущие от 40 до 50 генов. Количество плазмид в бактериальной клетке может быть от 1 до 200. Выделяют плазмиды, находящиеся в виде отдельной замкнутой молекулы ДНК (эписомы) и встроенные в хромосому бактерии (интегрированные плазмиды). Плазмиды выполняют регуляторные и кодирующие функ­ции. Первые направлены на компенсацию метаболических дефектов, вторые вносят в бактерию информацию о новых признаках. Как со­ставляющая часть генетического материала бактерии плазмиды игра­ют важную роль в ее жизнедеятельности, детерминируя такие харак­теристики, как способность продуцировать экзотоксины, ферменты или бактериоцины, устойчивость к лекарственным препаратам и т.д.

Удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бакте­рий, то есть увеличивает их «плодовитость». Такие плазмиды обо­значают как Р-плсшшды, или Р-факторы (от англ. ГеггЛНу - плодови­тость). Интегрированные Р-плазмиды называют Н/г-плазмиды или Нтг-факторы (от англ. Ы§Ь Ггвциепсу оГ гесотЫпайопз - высокая час­тота рекомбинаций). Нтг-факторы осуществляют перенос части гене­тической информации данной хромосомы в другую клетку.

Плазмиды, детерминирующие устойчивость к лекарственным препаратам, называются К-плазмида.ми, или Я-факторами (от англ. гез1з1апсе - устойчивость). Я-плазмиды содержат гены, детермини­рующие синтез ферментов, которые разрушают антибактериальные препараты. В результате бактериальная клетка становится устойчи­вой к действию целой группы лекарственных веществ. Многие Я-плазмиды являются трансмиссивными и, распространяясь в популя­ции бактерий, переносят резистентность к воздействию антибакте­риальных препаратов.

Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства микроорганизмов, детерминируя синтез факторов патогенности. Так, например, ЕШ-плазмида определяет синтез энтеротоксина. Развитие инфекционного процесса, вызванного возбудителями чумы, сибир­ской язвы, кишечного иерсиниоза, клещевого иксодового боррелио-за, связано с функционированием плазмид патогенности.

Копъюгативпые плазмиды переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов в процессе конъюгации. Чаще всего конъюгативными плазмидами являются Р- или Я-плазмиды. Подобные плазмиды относительно крупные (25-150 млн Д) и часто выявляются у грамотрицателъных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1-2 копии на клетку, и их репликация тесно связана с репликацией бак­териальной хромосомы.

Неконъюгативные плазмиды обычно имеют небольшие размеры и характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у НаеторЬПиз ттТиепгае, Не15зепа §опоггЬоеа,е). Мелкие плазмиды могут присутствовать в больших количествах (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распре­деление в потомстве во время клеточного деления. При наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плаз­мид донор может передавать и неконъюгативные плазмиды за счет связывания генетического материала последних с факторами, обес­печивающими их перенос в процессе конъюгации.

Подвижные генетические элементы входят в состав бактери­ального генома, бактериальной хромосомы и плазмид. К ним отно­сятся вставочные последовательности в ДНК и транспозоны. Вста­вочные, или инсерционные, последовательности (1з-элементы) пред­ставляют собой участки ДНК, способные перемещаться из одного места локализации в другое, и содержат только гены, необходимые для перемещения. Тз-последовательности осуществляют координа­цию взаимодействий плазмид, умеренных фагов, транспозонов и иуклеоида для обеспечения репродукции; регулируют активность генов бактериальной клетки. Они могут инактивировать гены, в ко­торые включились («выключение» гена) или, встраиваясь в хромо­сому, проявлять эффект промотора, включающего или выключаю­щего транскрипцию соответствующих генов.

Трапспозоиы (Тп) - это сегменты ДНК, состоящие из вставочных последовательностей и структурных генов, обеспечивающих синтез молекул со специфическими биологическими свойствами (токсич­ность, устойчивость к антибиотикам и др.). Транспозоны не способ­ны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.

Репликация бактериальной ДНК

Воспроизведение генетического материала бактерий осуществля­ется в процессе репликации, которая у бактерий протекает по полу­консервативному механизму. Это означает, что каждая из двух цепо­чек ДНК хромосомы или плазмиды служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепочки ДНК. В процессе репликации участвует комплекс ферментов. Репликация начинается с момента расплетания двунитевои структуры ДНК, которое осуществляется ферментом ДНК-гидролозой. При этом формируются две репликатив-ные вилки, которые двигаются в противоположных направлениях, пока не встретятся. Формирование новой дочерней цепи осуществля­ется ферментом ДНК-полгшеразой. Особенностью функционирования ДНК-полимеразы является се способность присоединять комплемен­тарные матрице нуклеотиды к свободному З'-коицу растущей цепоч­ки. Поэтому для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепочки ДНК-полимеразе требуется затрав­ка, которая называется прапмером (от англ, рптег - запал). Праймер представляет собой короткую нуклеотидную цепочку, комплементар­ную матричной цепочке со свободным З'-концом. На этом свойстве ДНК-полимеразы основана полимеразная цепная реакция (ПЦР), ши­роко используемая в диагностике инфекционных заболеваний. Две цепи двойной спирали ДНК комплементарны друг другу. На каждой цепи из структурных элементов ДНК - дезоксирибонуклеозидтри-фосфатов - синтезируется новая цепь; при этом с каждым из основа­ний спаривается комплементарное ему основание, так что каждая из двух новых цепей будет комплементарна родительской цепи. Обе но­вые двойные цепи состоят из одной родительской и одной вновь син­тезированной цепей. Такая точная репликация ДНК гарантирует со­хранение генетической информации.

ДНК бактерий, будучи носителем наследственной информации, сама не служит матрицей для синтеза полипептидов. Биосинтез бел­ков происходит на рибосомах, которые непосредственно с ДНК не соприкасаются. Передачу записанной в ДНК информации к местам синтеза белка осуществляет матричная, или информационная, РНК (мРНК). Она состоит из одной цепи и отличается от одиночной цепи ДНК тем, что тимин (Т) в РНК заменен урацилом (II). мРНК синте­зируется на одной из цепей ДНК, причем механизм этого процесса сходен с механизмом репликации ДНК. Образование мРНК начина­ется на 5'-конце, и по последовательности оснований ее цепь ком­плементарна цепи ДНК. Этот процесс называется транскрипцией, а перевод нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот - трансляцией.

Белок

Каждый ген представлен определенным участком молекулы ДНК. Специфическая информация, содержащаяся в гене, определя­ется последовательностью оснований в цепи ДНК. Специфичность ферментных белков, синтез которых контролируют гены, определя­ется последовательностью аминокислот в полипептидных цепях. Эта же последовательность определяет и пространственную структуру белка - копформацию.

Так растет полипептидная цепь по мере продвижения рибосомы вдоль мРНК. Одновременно происходит закручивание этой цепи и свертывание ее в клубок, определяемое последовательностью ами­нокислот и природой их боковых цепей (гидрофобные и гидрофиль­ные группы), и в результате возникает структура, обусловливающая специфические свойства и функцию данного белка. К мРНК обычно прикрепляется несколько рибосом, так что на одной и той же матри­це одновременно синтезируется несколько полипептидных цепей. На конце мРНК находится кодон, от которого зависит отделение сформированной полипептидиой цепи от рибосомы (рис. 29).

Таким образом, нуклеотидная последовательность ДНК пред­ставляет собой закодированную «инструкцию», определяющую структуру специфического белка. Этот универсальный процесс пе­редачи информации при репликации ДНК, транскрипции и трансля­ции применим как к эукариотам, так и к прокариотам.

Регуляция выражения генетической информации у бактерий

Бактериальная клетка способна запустить или прекратить синтез того или иного фермента в зависимости от присутствия соответст­вующего субстрата. Для этого бактериальные гены объединены в группы (кластеры) таким образом, что все ферменты, необходимые для осуществления определенного пути биосинтеза, детерминиру­ются генами, сцепленными друг с другом. Вся группа генов может транскрибироваться в одну полицистронную мРНК, которая после­довательно транслируется рибосомами с образованием каждого из белков. Такая форма организации позволяет координированно регу­лировать выражение всех генов одной единицы транскрипции.

Экспрессия генов у прокариот регулируется главным образом на уровне транскрипции. Роль сигнальных веществ для запуска транс­крипции играют молекулы-эффекторы, представляющие собой низ­комолекулярные соединения, которые являются либо субстратом для фермента, либо продуктом ферментативной деятельности соот­ветственно. Индукция и репрессия представляют собой разные сто­роны одного и того же явления. Малые молекулы, индуцирующие образование ферментов, которые способны метаболизировать их, называются индукторами, те же, которые предотвращают образова­ние ферментов, способных синтезировать их, - корепрессорами.

Молекулы-эффекторы не могут вступать в прямое взаимодейст­вие с ДНК, посредником для них служит специальный регулятор//ьш белок. Регуляторный белок, который связывается с ДНК в отсутст­вие индуктора, называется рспрессором.

За синтез регуляторных белков ответственны регуяяторпые ге­ны. В присутствии белка-репрессора транскрипция блокирована; его удаление обусловливает доступ РНК-полимеразы к генам и запуск транскрипции. Прекращение синтеза фермента при помощи белка-репрессора получило название репрессии. Репрессия позволяет бак­териальной клетке избежать перевода своих ресурсов на ненужную в данный момент синтетическую активность. Если индуктор присутствует в клетке в высокой концентрации, то в результате специфиче­ского присоединения к регуляторному белку он изменяет его кон-формацию и тем самым - его способность связываться с ДНК.

Контроль транскрипции достигается взаимодействием регуля-торного белка с регуляторным сайтом, называемым оператором, который расположен между структурными генами и промотором (участком, распознаваемым ДНК-зависимой РНК-пол имеразой). Промотор служит местом связывания РНК-полимеразы, и от него начинается транскрипция. Совокупность промотора, оператора и структурных генов образует оперон. Оперон является функциональ­ной генетической единицей, регулирующей экспрессию одного или группы генов (рис. 30).

Перенос генетического материала бактерий

Обмен генетическим материалом у бактерий осуществляется пу­тем генетических рекомбинаций. Под генетической рекомбинацией подразумевают взаимодействие между двумя геномами, которое приводит к образованию рекомбинаций ДНК и формированию до­чернего генома, сочетающего гены обоих родителей. Особенности рекомбинаций у бактерий определяются отсутствием истинного по­лового процесса и мейоза у прокариот и гаплоидным набором генов. В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые этот материал воспринимают. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, то есть один или несколько генов. Образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включением фрагментов хромосомы донора.

Рекомбинация может быть гомологичной, при которой в процес­се разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участка­ми ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Встречается также сайт-специфическая рекомбинация, которая происходит только в определенных участках (сайтах) генома и не требует высо­кой степени гомологии ДНК, например включение плазмиды в хро-мпсому бактерии. Передача генетического материала между бакте­риями осуществляется тремя механизмами: конъюгацией, транс­формацией и трансдукцией (рис. 31).

/ енетика микроорганизмов

I. Конъюгации

Передача [-'-фактора от Г'-клегки I) К

II, Трансдукиия Нсспснифичсскаи

руюмиш III. Трансформация

ДНК Бактерия-рсцш'шеи

I: ] - бактериальная хромосома; 2 - Р-фактор; 3 - гены, участвующие в реком­бинации; ЛВС - генотип донора; аЪс- генотип реципиента. II: I - бактериальная хромосома; 2 - гены, участвующие в рекомбинации: А -переносимый фагом ген; ц - генотип реципиента; 3 - фаг.

III: I - бактериальная хромосома; 2 - гены, участвующие в рекомбинации: А -генотип донора; а - генотип реципиента (Микробиология и иммунология, 1999) 138

Конъюгация - это перенос генетического материала путем пря­мого контакта между двумя клетками. Необходимым условием конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды. Трансмиссивные плазмиды кодируют половые пили, об­разующие коиъюгационную трубочку между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которой плазмидная ДНК передается из клетки-донора в клетку-реципиент. В результате такого переноса клетка-реципиент получает донорские свойства. Интегративной трансмиссивной плазмидой является Р-фактор. Клетки-доноры, об­ладающие Р-фактором, обозначаются как Р -клетки, а клетки-реципиенты, не имеющие Р-фактора, - Р~ -клетки. Если Р-фактор встраивается в хромосому клетки-донора и начинает функциониро­вать в виде единого с хромосомой трансмиссивного репликона, то хромосома донора приобретает способность передаваться в клетку-реципиент. Донорские клетки, имеющие встроенный в хромосому Р-фактор, называются НТг-клетксши. Хромосомная ДНК реплицирует-ся, одна цепь копии хромосомы переносится в реципиентную Р" -клетку, тогда как другая остается в Н:Гг⁺-клетке, то есть донор сохра­няет свое генетическое постоянство.

Передача генетического материала при конъюгации начинается с расщепления ДНК в районе локализации Р-фактора. Одна нить до­норской ДНК передается через конъюгационный мостик в клетку-реципиент. Процесс сопровождается достраиванием комплементар­ной нити до образования двунитевой структуры. Переданная в реци­пиентную клетку и достроенная до двунитевой структуры нить ДР1К рекомбинирует с гомологичным участком реципиентной ДНК с об­разованием стабильной генетической структуры. Биологическая зна­чимость конъюгации хорошо видна на примере распространения резистентности бактерий к антибиотикам. Устойчивость к антибио­тикам бактерия может получить в результате мутации, что происхо­дит 1 раз на каждые 10 клеточных делений. Однако, однажды изме­нившись, генетическая информация может быстро распространяться среди сходных бактерий посредством конъюгации, поскольку каж­дая третья из близкородственных бактерий способна именно к этому типу генетического переноса.

Трансформация - передача генетической информации через вы­деленную из клетки-донора ДНК. Процесс трансформации может произвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий,, чаще грамположительных, когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками. Как правило, лю­бая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется рестрикционными эндонуклеазами, но при некоторых усло­виях такая ДНК может быть интегрирована в геном бактерии. По происхождению ДНК может быть плазмидной либо хромосомной и нести гены, трансформирующие реципиента. Подобным путем про­цессы трансформации могут распространять гены, кодирующие фак­торы вирулентности, среди бактериальных популяций, однако в об­мене генетической информацией трансформация играет незначи­тельную роль.

Трансформация служит хорошим инструментом для картирова­ния хромосом, поскольку трансформированные клетки включают различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных характеристик (чем ближе расположе­ны гены, тем более вероятно, что они оба включатся в один и тот же участок ДНК) дает информацию о взаиморасположении соответст­вующих генов в хромосоме. Перенос экстрагированной ДНК являет­ся основным методом генной инженерии, используемым при конст­руировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом.

Траисдукцш - передача бактериальной ДНК посредством бакте­риофага. В процессе репликации фага внутри бактерий фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится вместе с ней в бактерию-реципиент. При этом фаговые частицы, как правило, дефектны, они теряют способность к репродукции. Так как трансдуцируются лишь небольшие фрагменты ДНК, вероятность рекомбинации, затрагивающей какой-то определенный признак, очень мала: она составляет от 10-6 до 10-8. Существует три типа трансдукции: неспецифическая (общая), специфическая и абортивная. Неспецифическая (общая) трапсдукция - перенос бактериофа­гом фрагмента любой части бактериальной хромосомы. В клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов может проникнуть фрагмент бактери­альной ДНК или плазмиды либо вместе с вирусной ДНК, либо вме­сто нее. Этот процесс происходит вследствие того, что бактериаль­ная ДНК фрагментируется после фаговой инфекции и кусочек бак­териальной ДНК того же размера, что и фаговая ДНК, проникает в вирусную частицу с частотой приблизительно 1 на 1 000 фаговых частиц. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены. Феномен неспецифической трансдукции может быть использован для картирования бактериаль­ной хромосомы.

Специфическая трапсдукция наблюдается в том случае, когда фаговая ДНК интегрирует в бактерию с образованием профага. При исключении ДНК фага из бактериальной хромосомы в результате случайного процесса захватывается прилегающий к месту включе­ния фагоаой ДНК фрагмент бактериальной хромосомы. Так как большинство умеренных фагов интегрирует в бактериальную ДНК в специфических участках, для таких бактериофагов характерен пере­нос в клетку-реципиент определенного участка бактериальной ДНК донора. Специфическая трансдукция может служить механизмом переноса вирулентных генов среди бактерий при условии, что эти гены локализованы в непосредственной близости от мест интегра­ции профага.

Наиболее характерным примером служит трансдукция, осущест­вляемая фагом X. Обычно он трансдуцирует определенные гены: §а! (кодирует синтез галактозы) и Ыо (кодирует синтез биотина). При переходе в состояние профага фаг X включается в определенный участок хромосомы бактерии-хозяина - между генами §а! и Ыо. От­деление фаговой ДНК от бактериальной хромосомы может происхо­дить неточно, и какой-то фрагмент ее останется в хромосоме, а близко расположенные гены будут захвачены фаговой ДНК. В слу­чае заражения трансдуцирующим фагом клеток, дефектных по определенному гену, например §а!-, может произойти рекомбина­ция с заменой собственного дефектного гена бактерии интактным трансдуцированным геном с образованием рекомбинанта (транс-дуктанта) §а!+.

Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции внесен­ный фрагмент ДНК донора не встраивается в хромосому реципиен­та, а остается в цитоплазме и там самостоятельно функционирует. Впоследствии он передается одной из дочерних клеток (то есть на­следуется однолинейно) и затем теряется в потомстве.

Генетическая изменчивость бактерий

Изменения бактериального генома могут происходить в резуль­тате мутаций. Мутации - это изменения в последовательности нук-леотидов ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утра­той или изменением какого-либо признака либо группы признаков. В их основе лежат ошибки копирования наследственной информа­ции, возникающие при репликации. Фенотипическим проявлением мутации могут быть: изменение морфологии бактериальной клетки, возникновение потребности в факторах роста (например, в амино­кислотах, витаминах), то есть ауксотрофность; появление устойчи­вости к антибиотикам; изменение чувствительности к температуре;снижение вирулентности (аттенуация). Мутации у бактерий носят ненаправленный характер.

Мутации могут быть спонтанными, то есть возникающими са­мопроизвольно, без воздействия извне, и индуцированными. Спон­танные мутации появляются в результате ошибок репликации ДНК, неправильного формирования комплементарных пар оснований, структурных искажений ДНК и вследствие перемещения подвижных генетических элементов в процессе роста и размножения популяции бактерий. Спонтанные мутации могут обусловливать благоприятные и неблагоприятные генетические изменения. Вероятность возникно­вения определенных мутаций в расчете на одну клетку и на одну генерацию называют частотой мутирования. При высоких скоро­стях роста она постоянна, и ее обычно определяют для клеток в экс­поненциальной фазе роста при оптимальных условиях среды. В фено­типе проявляются не все мутации. Непроявленные мутации называ­ются молчащими. У мутанта может произойти обратная мутация, или реверсия, в результате которой восстановятся свойства дикого штам­ма. Об истинной обратной мутации говорят лишь в тех случаях, когда вторая мутация точно восстанавливает исходный генотип; если же восстанавливается только фенотип, то говорят о вторичной реверсии. или супрессорной мутации. Супрессорные мутации могут происхо­дить как в исходном гене, так и в каких-либо других участках хромо­сомы (иитрагеппые и экстрагенпые супрессорные мутации).

Индуцированные мутации возникают под влиянием внешних факторов, которые называются мутагенамн. Мутагены бывают фи­зическими (УФ-лучи, у-радиация), химическими (аналоги пурино-вых и пиримидиновых оснований, например 2-аминопурин, азоти­стая кислота и ее аналоги, алкилирующие агенты и др.) и биологиче­скими (транспозоны).

По протяженности повреждений мутации бывают точечными, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженными (аберрации). Мутации разделяют на хромосомные, обусловливающие появление нового признака при изменении двух и более участков хромосомы, и генные, обусловленные появлением нового признака при изменении гена. В этом случае могут наблю­даться модификации оснований (изменения отдельных нуклеоти­дов), выпадение нескольких пар нуклеотидов (делецни), перемеще­ние группы нуклеотидов в пределах хромосомы (транспозгщия), разрыв путем вставки посторонней ДНК (шсериия) или добавление нуклеотидных пар (дупликацтля) и деформации спирали ДНК. Для точечных мутаций частота реверсий довольно высока, в то время как для аберраций реверсии нехарактерны.

Первичный эффект мутагенного фактора не обязательно ведет к истинной мутации. Новый фенотип проявляется только тогда, когда измененный ген начнет функционировать. С помощью различных методов удается накапливать и выделять мутантов с разного рода дефектами: с нарушением процессов транспорта или использования субстрата, с дефектами промежуточного обмена, с повышенной чув­ствительностью к температуре и т.д.Теоретически мутации, вызванные радиацией, химическими ве­ществами или другими факторами, могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, однако в любой живой клетке существу­ют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру ДНК. Совокупность фермен­тов, катализирующих реакции коррекции повреждений ДНК, со­ставляют системы репарации, которые принципиально различаются по биохимическим механизмам восстановления генома. Известны три основных механизма коррекции дефектов ДНК:

1) непосредственная реверсия от поврежденной ДНК к исходной структуре;

2)эксцизия («выпадение») повреждений с последующим восста­новлением исходной структуры;

3) активация механизмов, обеспечивающих устойчивость к по­вреждениям.

Реверсия повреждений ДНК. К механизмам прямой реверсии повреждений ДНК относится световая репарация, или фотореак­тивация (исправление деформации ДНК под действием УФ-лучей). Световая репарация осуществляется несколькими ферментами: фо-толиазой (расщепляет тиминовый димер и восстанавливает целост­ность соседних тиминовых оснований), О^б-метилтрансферазой (уда­ляет О -метальную группу из остатков гуанина после действия ме­тилирующих агентов), ДНК-пурин инсертазой (осуществляет встраивание утерянного при мутации основания в апуриновый сайт), ДНК-гликозилазой (удаление дефектных оснований). Все эти про­цессы происходят в один этап под действием конкретного фермента и безошибочно восстанавливают исходную структуру ДНК.

Системы эксшшюнной репарации удаляют неправильно спарен­ные или поврежденные основания из ДНК и синтезируют новую по­следовательность ДНК, замещающую их. Место повреждения распо­знает эндонуклеаза, расщепляющая цепь ДНК вблизи дефекта, фрагмент удаляется, а дефект восполняется при помощи ДНК-полимеразы, которая проникает в брешь и встраивает в нее отсутст­вующие нуклеотиды, используя неповрежденную цепь ДНК в качест­ве матрицы, ДНК-лигаза ковалентно связывает 3'-конец вновь синте­зированного участка ДНК с цепочкой. Поскольку эта система репара­ции основана на ресинтезе нуклеотидной цепи на базе неповрежден­ной матрицы, она также является практически безошибочной.

Репарационные механизмы устойчивости к повреждениям ДНК. Кроме механизмов исправления повреждений, клетки имеют возможность «обойти» вызванную повреждениями блокаду репли­кации ДНК, например путем репарации в процессе рекомбинации.

Фенотипическая изменчивость бактерий

Временные, наследственно не закрепленные изменения называ­ются модификациями. Модификации также контролируются гено-мом бактерий, но (в отличие от мутаций) не сопровождаются изме­нениями кодирующей структуры и быстро утрачиваются. Чаще все­го у бактерий отмечаются морфологические (приводящие к обрати­мым изменениям формы) и биохимические (проявляются индуци-бельным синтезом некоторых продуктов, как правило, ферментов) модификации. Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменения окружающей среды, что позво­ляет им быстро приспосабливаться и сохранять численность попу­ляции на жизнеспособном уровне. После устранения соответствую­щего воздействия, вызвавшего их образование, бактерии возвраща­ются к исходному фенотипу.

Стандартное проявление модификации - разделение однородной популяции на несколько типов. Этот феномен получил название диссоциация микробов. Обычно диссоциации возникают в условиях, неблагоприятных для исходной популяции. Примером диссоциации может служить изменение вида и структуры бактериальных колоний на твердых питательных средах. Для обозначения диссоциирующих колоний используют первые буквы английских названий: ^-колонии (от англ. 81ТЮОТГ1 - гладкий); ^.-колонии (от англ. гои§К - шерохова­тый); М-колоигш (от англ. пнюоМ - слизистый) и ^-ко.^они^{ (от англ. сЫ'агР - карликовый). Диссоциации сопровождаются изменениями биохимических, морфологических, антигенных и патогенных свойств возбудителей.

Изменение фенотипа следует считать модификацией, если вы­полняются три основных условия: 1) определенность (связь измене­ния фенотипа с определенным фактором); 2) общность изменений в популяции; 3) обратимость (восстановление признака после прекра­щения действия фактора).

Методы изучения генетики бактерий

Выявление фенотипической изменчивости (модификации).

При посеве Ргсйеиз пжаЫНз на питательный агар вырастают колонии протея, окруженные зоной «роения». При пересеве колоний петлей на поверхность питательного агара с 1% сухой желчью зоны роения исчезают, а при пересеве на обычный питательный агар все колонии вновь окружаются зоной роения.

Определение Со1-плазмид (колициногенных факторов). Ис­следуемые культуры Е.соН засевают методом укола в питательный агар в чашку Петри (по 7-8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37 °С сутки и на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого бактерии погибают. Затем поверхность агара равномерно заливают 3 мл рас­плавленного и остуженного до 45 °С полужидкого (0,7 %) питатель­ного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры (наиболее чувствительной к данному типу колицина). Ре­зультат учитывают через 18-24 ч инкубации при 37 °С: вокруг посе­вов культур, продуцирующих колицины, появляются зоны подавле­ния роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа. В чашку Петри в питательный агар засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицино-типом и инкубируют при 37 °С сутки, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. По поверхности агара равномерно распределя­ют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешан­ного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры Е.соН неизвестного ко­лицинотипа. Результаты учитывают через 18-24 ч. Если колицино-типы индикаторной культуры и исследуемого штамма совпадут, то зоны подавления роста вокруг эталонного штамма не будет.

Тест перераспределения для выявления спонтанности мута­ций. В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл су­точной культуры Е.соН М17 и распределяют равномерно по поверх­ности питательной среды. Через 6 ч инкубации при 37°С в одной из чашек перераспределяют шпателем выросшие микроколонии. Через 24 ч из каждой чашки культуры пересевают методом отпечатков на поверхность питательного агара с рифампицином. Через 24 ч инку­бации учитывают результат: на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов, а в чашке с перераспределением вы­росли более многочисленные (в десятки - сотни раз) колонии анти-биотикоустойчивых мутантов.

Данный опыт показывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно, до контакта бактерий с селективным агентом -рифампицином. Уже через 6 ч на среде без антибиотика появляются микроколонии антибиотикоустойчивых мутантов. Благодаря пере­распределению бактерий мутанты из этих микроколоний распро­страняются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний соответственно исход­ным микроколониям мутантов.

Индукция мутаций под действием ультрафиолетового облу­чения. В качестве источника УФ-лучей используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от цен­тра облучаемого объекта.

Для получения 1ас-мутантов Е.соН предварительно выращивают на питательном бульоне в течение 14-18 ч. Клетки осаждают цен­трифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль раствора М^5О4 и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15-150 с (предварительно определяют оптимальную мутагенную дозу, рав­ную 0,1-1% от числа выживших бактерий), после чего клетки осаж­дают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульо­не. Пробирку с бульоном инкубируют при 37°С в течение 14-18 ч. Разведения 10"" - 10"" по 0,1 мл высевают на среду Эндо. Параллель­но делают контрольные посевы. 1ас-мутанты Е.соН на среде Эндо образуют бесцветные колонии.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм Е.соН В или К12, который высевают после облучения на ми­нимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Па­раллельно делают контрольные посевы. Клетки Е.соН, выросшие на этой среде, являются антибиотикорезистентными.

Постановка опыта конъюгации. Донор-штамм Е.соН К12 Нтг 1еи+ Згг^ь, Реципиент - штамм Е.соН К12 Р~ 1еи~ 81г^г. Селективная сре­да - минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульон­ной культуры донора и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем смесь разводят до 10"² - 10"³ и высевают по 0,1 мл на селективную среду в чашки Петри, где вырастут только рекомбинанты. В качестве контроля на среду сеют донорский и реципиентныи штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стреп­томицину, а второй - ауксотроф по лейцину. После подсчета вы­росших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Постановка опыта трансформации. Реципиент - штамм ВасП-1из зиЫШз 5гг⁵ (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор - ДНК, выделенная из штамма В. зиЫШз 81г' (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) - питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры В. зиЫШз добавляют 1 мл ДНК до­нора и инкубируют 30 мин при 37 °С. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,! мл смеси высевают на селективную среду. Частоту трансформации оп­ределяют по отношению количества выросших колоний рекомби­нантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Постановка опыта специфической трансдукции. Реципиент -штамм Е.соП \ас~, лишенный |3-галактозидазного оперона, контроли­рующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг - фаг X йда], в геноме которого часть генов замещена (3-галактозидазным оперо-ном Е.соН. Селективная среда - среда Эндо, на которой лактозоот-рицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомби-нантного штамма-ярко-малиновые с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10⁶-10⁷ частиц в 1 мл. Смесь инкубируют 60 мин при 37 °С и готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с 10~⁶ разведением по 0,1 мл культуры высевают в три чашки со средой Эндо и инкубируют в течение суток. Величину трансдукции вычисляют по отношению количества клеток рекомбинантов, обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.

Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний

Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими ме­тодами маркером возбудителя является его геном. Методы индика­ции нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных ин­фекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые

трудно выделить) и для определения точного таксономического по­ложения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микро­организм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.

Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться (гибридизироваться) с ком­плементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами.

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу иссле­дуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий меченый зонд (рис. 32). Создаются условия, благоприятные для образования двой­ных спиралей, одним из них является наличие комплементарное™ между зондом и исследуемой ДНК. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образо­вавшегося комплекса при помощи соответствующей метки.

Отмывка

Проявление

ДНК (или РНК) в исследуемом образце

Рис. 32. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образ­цах ДНК или РНК возбудителя специфическим меченым зондом (Иммунология инфекционного процесса, 1994)

Полимеразная цепная реакция основана на многократном уве­личении числа копий (ампяификации) определенного участка ДНК, катализируемом ферментом ДНК-полимеразой (рис. 33). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результа­та достаточно наличия в материале одной молекулы ДНК.

ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции про­дукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице по­средством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того как из бактерий Тпегтои§ ГпептюрЫНз смогли получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимсразной обладает еще и обрат-но-транскрилтазной активностью, удалось совместить эти две* реак­ции. Данный вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактери­альных и клеточных генов по их РНК.

Для проведения ПЦР требуется пять основных компонентов: 1) фермент ДНК-полимераза; 2) пара олигонуклеотидных праймеров; 3) набор нуклеотидов; 4) копируемая ДНК; 5) ионы М^+2, необхо­димые для функционирования ДНК-подимеразы. Термическая денатурация ДНК

МИНИН, имммит Денатурация I _{и отжиг}

I Синтез комплементарны}:

Для амплификации (то есть синтеза ДНК-матрицы) отбирают наиболее консервативную часть, уникальный ген. Для запуска син­теза на ДНК-матрице используют два праймера (короткие, длимой 20-30 оснований одноцепочечные фрагменты ДНК), комплементар­ные З'-концам ДНК искомого гена. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры, затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связы­ваются с его комплементарными участками (отжиг). Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к З'-концам праймеров, формируется специфический фрагмент (ам-пликон). После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться в два раза. Рассчитано, что за 30-40 циклов из одной матрицы можно получить 10 ампликонов. Реак­цию проводят в специальных приборах - амплификаторах. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом гель-электрофореза и визуализацию в УФ-свете после ок­рашивания этидием бромида. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю можно провести ДНК-гибридизацию.

Инфекция, Факторы инфекционного процесса. Основные формы инфекции

Инфекция - процесс взаимодействия между микроорганизмом и макроорганизмом, протекающий в конкретных условиях внешней и социальной среды.

Инфекционный процесс представляет собой совокупность фи­зиологических и патологических реакций, развивающихся в макро­организме в процессе инфекции.

Инфекционное заболевание есть одна из форм инфекционного процесса.

Развитие инфекции обусловлено такими факторами, как состоя­ние защитных сил организма, свойства возбудителя заболевания и его инфицирующей дозы, условия внешней среды, пути передачи и входные ворота инфекции.

В зависимости от свойств, природы возбудителя, его локализа­ции в макроорганизме, путей распространения, состояния макроор­ганизма различают следующие основные формы инфекции:

• экзогенную - возникает в результате проникновения пато­генного микроорганизма извне: от больных или бактерионосителей, из окружающей среды с водой, пищей, воздухом, почвой.

• эндогенную - вызывается условно-патогенными микроорга­низмами - представителями нормальной микрофлоры организма в результате снижения резистентности макроорганизма (переохлажде­ние, травма, оперативные вмешательства, иммунодефицитные со­стояния).

Инфекции также подразделяют на острые и хронические. Острая инфекция характеризуется внезапным началом и кратковременным течением. Хроническая инфекция протекает длительно, и возбуди­тель может находиться в макроорганизме в течение нескольких ме­сяцев или лет.

По локализации возбудителя в макроорганизме различают оча­говую форму инфекции, при которой микроорганизм локализуется в одном конкретном очаге, и генерализованную, когда возбудитель распространяется по всему макроорганизму лимфогенным и гематогенным путем. В этом случае развивается бактериемия, или вирусемия. При сепсисе в крови больного происходит размножение возбу­дителя. В случае возникновения гнойных очагов во внутренних ор­ганах развивается септикопиемия. Поступление в кровь токсинов микроорганизмов носит название токсииемии.

Существуют понятия: моноинфекция, (микст)-инфекция, реин-фекция, вторичная инфекция, аутоинфекция, В зависимости от ко­личества видов микроорганизмов, вызывающих заболевание, разли­чают моноинфекцию или смешанную (микст)-инфекцию. Моноин­фекция вызывается одним видом микроорганизма, смешанная ин­фекция -двумя или несколькими видами.

Реиифекц-ия - это заболевание, вызванное повторным заражени­ем организма тем же возбудителем,

Суперинфекция - инфицирование макроорганизма тем же возбу­дителем до его полного выздоровления.

Рецидив - возврат клинических симптомов болезни, без повтор­ного заражения микроорганизмами, за счет оставшихся возбудите­лей в макроорганизме.

Вторичная инфекция - к развивающейся первичной инфекции присоединяется другая инфекция, вызываемая новым видом воз­будителя.

Аутоинфекция - развитие инфекционного процесса, вызванного собственной микрофлорой, чаще всего условно-патогенной.

Кроме того, инфекции принято делить на две основные группы:

1) манифестные инфекции - имеют выраженную симптоматику;

2) бессимптомные инфекции - заболевание не имеет выражен­ных симптомов.

Типичная инфекция - при развитии заболевания клинические симптомы характерцы для данной болезни.

Ати яичная инфекция - клинические симптомы болезни стерты, носят невыраженный характер, Такое течение болезни связывают со слабой вирулентностью возбудителя, высокой напряженностью им­мунитета либо эффективным лечением.

Медленные инфекции - характеризуются длительным инкубаци­онным периодом, прогрессирующим течением болезни, слабым им­мунным ответом и тяжелым исходом. Возбудитель сохраняется в организме человека продолжительное время (месяцы, годы) в ла­тентном состоянии и при благоприятных для него условиях начинает активно размножаться, что вызывает тяжелое заболевание.

Персистелтная инфекция - возбудитель, проникая в организм, вызывает заболевание, но под воздействием активного лечения химиопрепаратами и приобретенного специфического иммунитета подвергается Ь-трансформации. Такие формы бактерий не чувстви­тельны ко многим химиопрепаратам, а также к антителам и могут длительное время находиться в организме больного. При определен­ных условиях (снижении резистентности организма, прекращении лечения) возбудитель восстанавливает свои патогенные свойства и вызывает рецидив болезни.

Латентная инфекция- заболевание протекает скрытно, без внешних клинических симптомов.

Бактериоп(жительство ~ после латентной инфекции или пере­несенного инфекционного заболевания организм человека не в со­стоянии освободиться от возбудителя, эта форма инфекции называ­ется бактерионосительством или вирусоносительством. Такое со­стояние формируется при слабой напряженности постинфекционно­го иммунитета. При этом человек после клинического выздоровле­ния становится носителем возбудителя в течение многих месяцев и лет, являясь источником инфекции для окружающих.

Абортивная инфекция - возбудитель проникает в макроорга­низм, но не размножается в нем и в связи с высокой резистентно-стью организма инфекционный процесс не развивается.

Основные источники инфекции. Пути и способы заражения. Ворота инфекции

Основными источниками инфекции могут быть;

1) больной человек, бактериоиоситель, реконвалесцеит;

2) животные.

Заражение человека от больного может происходить в течение всего периода болезни либо отдельной стадии инфекционного забо­левания, в зависимости от вида инфекции. При бактерионосительст-ве выделение возбудителя продолжается после клинического выздо­ровления пациента. Заболевания (холера, брюшной тиф и т.д.), кото­рыми болеет только человек, называются ишпропонозными.

Источником инфекции являются также животные. Человек зара­жается непосредственно от больного животного при контакте с ним или при употреблении в пищу инфицированных продуктов, через укусы кровососущих переносчиков. Заболевания, которыми болеет человек и животные, называются зооаитропопозпымн (бруцеллез, чума, лептоспироз).

Существует несколько путей заражения человека:

1. Воздушно-капельный.

2. Фекально-оральный. Заражение человека происходит при употреблении инфицированных продуктов питания или воды.

3. Трансмиссивный. Возбудитель передается членистоногими, через укусы животных, шприцы.

4. Контактный. Инфицирование происходит от больного челове­ка, бактерионосителя, при непосредственном контакте или через инфицированные предметы обихода.

5. Половой путь.

6. От матери к ребенку. Заражение происходит через плаценту или во время родов.

7. Ятрогенный путь. Использование для лечения и диагностики медицинскими работниками нестерильных шприцев, систем для пе­реливания крови или медицинских инструментов и приборов.

Место проникновения возбудителя в макроорганизм называют входными воротами инфекции. Заражение человека происходит че­рез поврежденную кожу, слизистые оболочки пищеварительного и дыхательного путей, мочеполовую систему. Заражение через непо­врежденную кожу встречается редко (лептоспироз).

В зависимости от вида возбудителя и его свойств дальнейшее распространение по организму будет происходить лимфогенньш, гематогенным или нейрогенным путем. Некоторые микроорганизмы начинают размножаться на месте внедрения, вызывая очаговую ин­фекцию. Распространение возбудителя по всему организму вызывает генерализацию инфекционного процесса.

Отличительной особенностью инфекционного заболевания явля­ется циклическое течение со сменой периодов: инкубации, продро-ма, разгара и развития болезни, спада и угасания, выздоровления.

Инкубационный период - это период времени от момента вне­дрения возбудителя в макроорганизм и до появления первых клини­ческих симптомов болезни. При каждом инфекционном заболевании продолжительность инкубационного периода различна и колеблется в широких пределах - от нескольких часов (грипп) до нескольких месяцев (гепатит В). Длительность инкубационного периода зависит от вида микроорганизма, инфицирующей дозы, его вирулентности, пути проникновения в организм и от состояния макроорганизма. Инкубационный период связан с адгезией и колонизацией клеток макроорганизма возбудителем в воротах инфекции. Признаков забо­левания в данном периоде еще нет, но в организме уже происходят начальные проявления патологического процесса в виде морфологи­ческих изменений, обменных и иммунологических сдвигов и др. Ес­ли макроорганизм не способен обезвредить возбудителя, развивается следующий период заболевания.

Продромальный период - характеризуется появлением первых общих признаков заболевания без четкой характерной симптоматики для данного заболевания. Развиваются неспецифические общие для многих заболеваний признаки в виде лихорадки, недомогания, сни­жения аппетита, общей слабости, головной боли, субфебрильной температуры. Продолжительность продромального периода 1-3 сут, но может увеличиваться до 10 дней и зависит от этиологии инфек­ционного заболевания. Для ряда заболеваний (лептоспироз, грипп) продромальный период не типичен. Отсутствие продромального пе­риода может свидетельствовать о более тяжелой форме инфекцион­ного процесса. В продромальном периоде возбудитель интенсивно размножается в месте его локализации, продуцирует соответствую­щие токсины и инвазируется в ткани.

Период разгара и развития болезни - наряду с общими неспеци­фическими признаками проявляются характерные симптомы для дан­ного заболевания. Наиболее типичные признаки инфекционной бо­лезни: лихорадка, воспаление, явление поражения центральной и ве­гетативной системы, нарушение функций сердечно-сосудистой сис­темы и органов пищеварения. При некоторых заболеваниях появля­ются кожные высыпания, желтуха и другие симптомы. В данный пе­риод возбудитель заболевания активно размножается в организме, происходит накопление токсинов и ферментов, которые поступают в кровь и вызывают синдром интоксикации или токсикосептический шок. В период разгара болезни происходит активная перестройка им-мунологической реактивности организма и выработка специфических антител класса 1§М с последующим синтезом 1&С. Больной в этот пе­риод является наиболее опасным для окружающих вследствие выде­ления возбудителя из организма в окружающую среду.

Длительность периода разгара и развития болезни зависит от ви­да возбудителя, состояния иммунологической реактивности орга­низма, своевременной диагностики, эффективности лечения и дру­гих условий.

Период угасания болезни - выздоровление. При благоприятном течении заболевания период разгара переходит в стадию выздоров­ления. Выздоровление характеризуется постепенным исчезновением клинических симптомов заболевания, восстановлением нарушенных функций организма, нейтрализацией и выведением возбудителя и токсинов из организма.

Выздоровление может быть полным, при котором все нарушен­ные функции восстанавливаются, или неполным, если сохраняются остаточные явления (мышечная атрофия при полиомиелитах, клещевом энцефалите, дефекты кожи при натуральной оспе и т.п.). Клини­ческое выздоровление опережает патоморфологическое восстанов­ление поврежденных органов, а также полное освобождение орга­низма от возбудителя. При большинстве инфекционных заболеваний в период выздоровления организм полностью освобождается от воз­будителя, формируется иммунитет.

В некоторых случаях выздоровление переходит в микробоноси-тельство или после кажущегося выздоровления возникает рецидив.

Понятие о патогенности и вирулентности бактерий.

Токсины

Патогенность - это потенциальная способность микроорганизма вызывать инфекционный процесс. Патогенность представляет собой видовой признак, появившийся в ходе эволюции микроорганизма и приспособления его к паразитированию в организме человека. Для патогенности характерна специфичность, то есть способность вы­зывать патоморфологические и патофизиологические изменения в определенных тканях и органах.

Для количественной оценки степени патогенности микроорга­низма используют термин «вирулентность», которая измеряется в условно принятых единицах - ОЬМ, ОЬзо, ВсЬ, ОЬМ (Ооз13 1е1аП$ гшшта) - минимальная смертельная доза микроорганизмов, которая вызывает гибель 95% восприимчивых лабораторных животных. ВЬэо вызывает гибель 50% зараженных животных, ОсЬ - смертельная доза, вызывающая гибель всех животных.

Степень патогенности микроорганизма зависит от многих фак­торов и обусловлена как наличием ферментных систем, обеспечи­вающих существование возбудителя в макроорганизме, так и его способностью противостоять факторам защиты организма, направ­ленных на уничтожение возбудителя. По степени патогенности раз­личают патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Пато­генные микроорганизмы способны в большинстве случаев вызывать инфекционный процесс, а условно-патогенные часто являются есте­ственными обитателями организма человека, вызывают заболевания только при снижении иммунитета и достаточно большой инфици­рующей дозе. Степень патогенности микроорганизма связана с его способностью к адгезии, колонизации, инвазии, подавлению фаго­цитоза и т. д.

К факторам патогенности относят способность микроорганизмов прикрепляться к клеткам (адгезия), размещаться на их поверхности(колонизация), проникать в клетки (инвазия) и противостоять факто­рам защиты организма (агрессия).

Адгезия является пусковым механизмом инфекционного процес­са. Под адгезией понимают способность микроорганизма адсорби­роваться на чувствительных клетках с последующей колонизацией. Структуры, ответственные за связывание микроорганизма с клеткой, называются адгезинами, они располагаются на его поверхности. Ад-гезины очень разнообразны по строению и обусловливают высокую специфичность - способность одних микроорганизмов прикреплять­ся к клеткам эпителия дыхательных путей, других - кишечного тракта или мочеполовой системы и т.д. На процесс адгезии могут влиять физико-химические механизмы, связанные с гидрофобно-стью микробных клеток, суммой энергии притяжения и отталкива­ния. У грамотрицательных бактерий адгезия происходит за счет пи-лей I и общего типа. У грамположительных бактерий адгезины пред­ставляют собой белки и тейхоевые кислоты клеточной стенки. У дру­гих микроорганизмов эту функцию выполняют различные структуры клеточной системы: поверхностные белки, липополисахариды и др.

Инвазия. Под инвазивностью понимают способность микробов проникать через слизистые, кожу, соединительнотканные барьеры во внутреннюю среду организма и распространяться по его тканям и органам. Проникновение микроорганизма в клетку связывается с продукцией ферментов, а также с факторами, подавляющими кле­точную защиту. Так, фермент гиалуронидаза расщепляет гиалуроно-вую кислоту, входящую в состав межклеточного вещества, и, таким образом, повышает проницаемость слизистых оболочек и соедини­тельной ткани. Нейраминидаза расщепляет нейраминовую кислоту, которая входит в состав поверхностных рецепторов клеток слизистых оболочек, что способствует проникновению возбудителя в ткани.

Агрессия. Под агрессивностью понимают способность возбуди­теля противостоять защитным факторам макроорганизма. К факто­рам агрессии относятся: протеазы - ферменты, разрушающие имму-ноглобулины; коагулаза - фермент, свертывающий плазму крови; фибринолизин - растворяющий сгусток фибрина; лецитиназа - фер­мент, действующий на фосфолипиды мембран мышечных волокон, эритроцитов и других клеток. Патогенность может быть связана и с другими ферментами микроорганизмов, при этом они действуют как местно, так и генерализованно.

Важную роль в развитии инфекционного процесса играют ток­сины. По биологическим свойствам бактериальные токсины делятся на экзотоксины и эндотоксины.

Экзотоксины продуцируют как грамположительные, так и гра-мотрицательные бактерии. По своей химической структуре это бел­ки. По механизму действия экзотоксина на клетку различают не­сколько типов: цитотоксины, мембранотоксины, функциональные б локаторы, эксфолианты и эритрогемины. Механизм действия бел­ковых токсинов сводится к повреждению жизненно важных процес­сов в клетке: повышению проницаемости мембран, блокаде синтеза белка и других биохимических процессов в клетке или нарушению взаимодействия и взаимокоординации между клетками. Экзотокси­ны являются сильными антигенами, которые и продуцируют образо­вание в организме антитоксинов.

По молекулярной организации экзотоксины делятся на две группы:

1) экзотоксины, состоящие из двух фрагментов;

2) экзотоксины, составляющие единую полипептидную цепь. По степени связи с бактериальной клеткой экзотоксины делятся условно на три класса:

• класс А - токсины, секретируемые во внешнюю среду;

• класс В - токсины, частично секретируемые и частично свя­занные с микробной клеткой;

• класс С - токсины, связанные и с микробной клеткой и по­падающие в окружающую среду при разрушении клетки.

Экзотоксины обладают высокой токсичностью. Под воздействи­ем формалина и температуры экзотоксины утрачивают свою токсич­ность, но сохраняют иммуногенное свойство. Такие токсины полу­чили название анатоксинов и применяются для профилактики забо­левания столбняка, гангрены, ботулизма, дифтерии, а также исполь­зуются в виде антигенов для иммунизации животных с целью полу­чения анатоксических сывороток.

Эндотоксины по своей химической структуре являются липопо-лисахаридами, которые содержатся в клеточной стенке грамотрица­тельных бактерий и выделяются в окружающую среду при лизисе бактерий. Эндотоксины не обладают специфичностью, термоста­бильны, менее токсичны, характеризуются слабой иммуногенно-стью. При поступлении в организм в больших дозах эндотоксины угнетают фагоцитоз, гранулоцитоз, моноцитоз, увеличивают прони­цаемость капилляров, оказывают разрушающее действие на клетки. Микробные липополисахариды разрушают лейкоциты крови, вызы­вают дегрануляцию тучных клеток с выделением вазодилататоров, активируют фактор Хагемана, что приводит к лейкопении, гипертермии, гипотонии, ацидозу, дессиминированной внутрисосудистой коагуляции (ДВК). Эндотоксины стимулируют синтез интерферонов, активируют систему комплемента по классическому пути, об­ладают аллергическими свойствами.

При введении небольших доз эндотоксина повышается рези-стентность организма, усиливается фагоцитоз, стимулируются В-лимфоциты. Сыворотка животного, иммунизированного эндотокси­ном, обладает слабой антитоксической активностью и не нейтрали­зует эндотоксин.

Моделирование инфекционного процесса на лабораторных животных

В медико-биологических исследованиях используется до 250 ви­дов животных. Одни виды постоянно разводят в лабораториях и пи­томниках (лабораторные животные - белые мыши, белые крысы, морские свинки, кролики, хомяки, кошки, собаки, обезьяны, мини-свиньи и др.); других периодически отлавливают для эксперимента (полевки, песчанки, суслики, хорьки, сурки, лемминги и др.). От об­щего числа лабораторных животных на долю белых мышей прихо­дится около 70% , белых крыс - 15%, морских свинок - 9%, кроли­ков - 2%. Эти животные чаще всего используются в целях диагно­стики заболевания, моделирования различных патологических со­стояний, изучения вопросов иммунологии, изготовления лечебно-профилактических препаратов, производства биологических препа­ратов - диагностических сывороток, вакцин, культур тканей и др. Лабораторные животные служат также донорами, от которых можно систематически брать кровь для приготовления кровяных питатель­ных сред и проведения специальных исследований, связанных с ис­пользованием крови и ее ингредиентов; сыворотки, плазмы, эритро­цитов, гранулоцитов, агранулоцитов и т.д. Кроме того, животные используются как доноры клеточных элементов, выпотевающих в серозные полости.

К выполнению экспериментальных исследований на животных допускаются лица, имеющие высшее медицинское, медико-биологическое, фармацевтическое, ветеринарное, зоотехническое или биологическое образование, после того как они освоили правила обращения с лабораторными животными и приобрели практические навыки.

В настоящее время усилиями исследователей многих стран мира методом тесного инбридинга (внутриродственного скрещивания) удалось вывести более 200 линий мышей, свыше 20 линий крыс, 7 линий морских свинок, несколько линий кроликов. Среди диких жи­вотных чистых линий не существует. На выведение линий затрачивается не мене 8-10 лет тщательно выполняемой работы. Каждой линии присущи свои передающиеся по наследству особенности и свойства (повышенная или пониженная чувствительность к возбуди­телям инфекционных заболеваний, опухолям и т.д.). Линейные (ин-бредные) животные подобно однояйцевым близнецам гомозиготны. Они ценны тем, что являются генетически однородными и отлича­ются от нелинейных животных постоянными реакциями на воздей­ствие физиологических, химических и патогенных факторов.

Линейных животных получают методом непрерывного тесного инбридинга, то есть при спаривании близких родственников. С це­лью выведения определенной линии лабораторных мышей, крыс или других животных осуществляют братско-сестринское скрещивание на протяжении более 20 последовательных поколений и лишь тогда достигают 100% гомозиготности. Такие линейные животные явля­ются генетически контролируемыми.

По рекомендации Международного комитета по стандартизации генетической номенклатуры названия линий пишутся заглавными латинскими буквами. В заглавии линии заложено ее происхождение, год создания какой-либо особенности животных данной линии. Так, среди белых мышеи наиболее распространены А, СВА, ВАЬВ, В А.).!, С57ВЦС57ВЯ, С58, СЗН.

Линейные лабораторные животные очень чувствительны к не­благоприятным факторам окружающей среды, поэтому условия со­держания их должны быть лучше, чем нелинейных животных.

Потомство линейных животных, у которых в силу различных причин прекращено разведение методом инбридинга, теряет линию, так как у них накапливаются мутации, а гомозиготность понижается. Уменьшение гомозиготности при этом прогрессирует от поколения к поколению, а признаки, специфические для данной линии, могут быть потеряны, ослаблены или извращены.

Как линейные, так и нелинейные животные являются носителя­ми возбудителей многих вирусных, бактериальных, грибковых забо­леваний, которые затрудняют выполнение точных исследований. В процессе эксперимента, особенно длительного, присутствующие в организме животного возбудители могут активироваться и извратить характер реакции на испытуемый агент. В связи с этим возникла по­требность получения лабораторных животных, лишенных микроор­ганизмов или имеющих в организме контролируемую микрофлору. Современная технология позволяет получать, выращивать и содер­жать в стерильных условиях в течение всей их жизни лабораторных животных, совершенно лишенных микроорганизмов, называемых гнотобиотами. Их получают от беременных самок, которым прово­дят кесарево сечение в определенный период перед родами. Ново­рожденных помещают на утепленные подстилки в клетки. Корм, воду, подстилку и другие материалы, необходимые для обеспечения жизнедеятельности безмикробных животных, подвергают стерили­зации в автоклавах. В настоящее время в стерильных условиях в гнотобиотических изоляторах получены безмикробные мыши, кры­сы, морские свинки, хомячки, кролики, кошки, собаки, ягнята, коз­лята, поросята, обезьяны.

Подопытных животных следует подбирать однородными по воз­расту, полу, массе и генетическим характеристикам. Отобранных жи­вотных необходимо тщательно осмотреть, выбраковать подозритель­ных или больных. Выбор вида, линии, возраста и пола животных дик­туется целями исследований. Существует целый ряд маркировки ла­бораторных животных, основными из которых являются следующие: 1. Татуировка ушей у животных, имеющих большие непигментиро­ванные ушные раковины (кролики, свинки, крысы, мыши). Для татуи­ровки применяют тушь и специальные татуировочные щипцы. 2. Ме-чение мышей и крыс нанесением краски, лучшими из которых счита­ются насыщенный раствор пикриновой кислоты, 0,5% раствор генци-аывиолета, фуксин, эозин, 3. Можно метить лабораторных животных, в том числе и новорожденных, с помощью колец, жетонов из мягкой белой жести, которые закрепляют на ушах или лапках

Фиксация животных

Кролики отличаются от других лабораторных животных своим спокойствием и относительно слабым сопротивлением при фикса­ции. Привязывают их к специальным станкам или столам таким же образом, как и других животных. Следует иметь в виду, что при сильном запрокидывании головы у них легко наступает смерть от удушья. Помощник может зафиксировать кролика двумя руками: левой рукой за кожу спины в области затылка, правой - за кожу в области крестца. Кролика можно пеленать куском прочной материи. Удобен также способ фиксации с помощью индивидуального иммо-билизационного станка, ящика с круглой прорезью в передней стенке.

Фиксация морских свинок не представляет затруднений. Левой рукой животное удерживают за спину и грудь так, чтобы большой и указательный пальцы охватывали шею, а другие пальцы передней руки обездвиживали передние конечности и ограничивали движения головы, правой рукой снизу удерживают заднюю часть тела и обез-движивают животом вверх.

Белую лабораторную крысу берут за кожу спины или хвост. По­мощник левой рукой берет крысу за кожу в области затылка и фиксирует этим голову и передние конечности, а правой рукой удержи­вает задние конечности и хвост. После этого животному придают нужное положение. Для фиксации крыс предложен ряд приспособ­лений - сетки, цилиндры, гильзы.

У белой мыши захватывают кожу спины на затылке большим и указательным пальцами левой руки, а остальными пальцами этой же руки удерживают задние конечности и хвост. Эти же манипуляции можно выполнять раздельно двумя руками. Фиксированное живот­ное располагают в нужном положении.

Методы заражения лабораторных животных

Наиболее широко лабораторные животные используются в бак­териологической и вирусологической практике, как в целях диагно­стики, так и для воспроизведения экспериментальных инфекций. Применяют следующие методы заражения животных: накожный, внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутрибрюшной (брюшная полость, грудная, передняя камера гла­за), внутриорганный (мозг, легкие), введение микроорганизмов в пищеварительный или дыхательный тракт.

Участок кожи, где происходит та или иная манипуляция, непо­средственно перед ее выполнением или заранее обрабатывают в та­кой последовательности: а) выщипывают или выстригают (выбри­вают) шерсть; б) удаляют остатки шерсти депилятором; в) дезинфи­цируют участок одним из способов (спиртом, спиртом в смеси с эфиром 1:1, 10% настойкой йода).

Накожный метод. На кожу спины или живота, освобожденную от шерсти, наносят царапины скарификационной иглой. Материал берут стеклянной палочкой и втирают досуха.

Внутрикожный метод. Местом введения обычно выбирают ко­жу спины или живота. Шерсть на этом месте за два дня до опыта удаляют депилятором, сухой порошок которого разводят водой, на­кладывают образовавшуюся кашицу на кожу на время, указанное в инструкции к его применению. Используют очень тонкие и острые иглы с пологим скосом. Иглу вводят в кожу под очень острым углом скосом вверх. Инъецируют до 0,1 мл раствора. Образовавшееся вздутие не исчезает 3-5 мин.

Подкожный метод. Иглу шприца вводят в основание кожной складки предполагаемого места инъекции. После прокола кожи на­правление иглы меняют и медленно вводят жидкость: мышам не более 1,0 мл, морским свинкам и крысам - 1,5 мл, кроликам - 3,0 мл. Следят затем, чтобы введенный материал не вытекал наружу.

Внутримышечный метод. Лучшим местом введения считается участок с развитым мышечным слоем в области верхней трети зад­ней лапы животного, острие иглы направляют почти перпендику­лярно участку.

Внутривенный метод. Инъекцию производят в краевую вену уха кроликов, яремную вену морских свинок, хвостовую вену крыс или мышей. Обрабатывают кожу над веной. Для лучшего наполне­ния вены ее пережимают ниже будущего введения или кожу обогре­вают теплой (55°С) водой. Материал вводят медленно.

Вмутрибрюшинный метод. Инъекцию производят в задней тре­ти живота. Место введения обрабатывают до и после инъекции. Жи­вотное располагают вниз головой или в наклонном положении. Не­сколько отступив от средней линии, брюшную стенку прокалывают, вводят иглу под тупым углом к стенке. Игла должна быть с притуп­ленным концом во избежание повреждения внутренних органов.

Оральный метод. Материал вводят принудительно с помощью тонкого эластичного зонда. Кроликов и морских свинок пеленают и располагают в положении, близком к вертикальному. Перед введе­нием зонда животному вставляют роторасширитель с отверстием и середине; продвигается зонд по пищеводу обычно без затруднений, если его конец смазан вазелином, а у животного вызывают глота­тельные движения закапыванием в рот нескольких капель воды, Че­рез воронку или шприц жидкость вливают в желудок.

Крыс или мышей помощник фиксирует в вертикальном положе­нии. Жидкость можно вводить двумя способами: а) шприцем со спе­циальной изогнутой иглой, конец которой утолщен в виде шарика с боковым отверстием; б) шприцем с обычной иглой, на которую на­сажен тонкий эластичный зонд. Животным открывают рот бранша-ми пинцета. Процесс введения зонда требует навыков. Объем жид­кости зависит от вида и возраста животного.

Интраназальный метод. Животное фиксируют. С помощью эфира или хлороформа вызывают состояние легкого наркоза. Шпри­цем и иглой с насаженным тонким зондом вводят в нос животному маленькими каплями заразный материал. Материал можно капать непосредственно на нос животного, контролируя его попадание в носовые ходы.

Вскрытие трупа лабораторного животного

Животные, которые подвергались в эксперименте воздействиям, поведшим за собой понижение жизнеспособности, подлежат умер-' щвлению гуманным методом (эвтаназии). Эвтаназия не должна вы­полняться в помещении, в котором находятся другие лабораторные животные. Умерщвление часто осуществляется путем декапитации с

использованием специальных гильотин, путем передозировки нар­котических веществ (эфир, хлороформ, барбитураты), электриче­ским током, воздушной эмболией - внутривенным введением возду­ха, полным обескровливанием при использовании различных мето­дов обезболивания.

Между смертью и вскрытием трупа животного должно прохо­дить как можно меньше времени. Более целесообразно умерщвлять животное в агональный период. Труп кролика фиксируют на специ­альной доске за вытянутые лапы. Трупы морских свинок, крыс, мы­шей можно прикалывать старыми инъекционными иглами к парафи­новой пластине в эмалированном лотке. Всю шерсть животного сма­чивают дезинфектаптом {спирт, 5% карболовая кислота, 5% хлора­мин). Кожу разрезают по средней линии живота от симфиза до под­бородка. На уровне передних и задних лап делают боковые разрезы. Кожу отсепаровывают, отворачивают в стороны и прикалывают к пластине. Вскрытие начинают с грудной полости, вырезая грудину. Если в грудной полости есть экссудат, из него делают мазки и посев. Кровь из сердца забирают проколом пастеровской пипеткой с оття­нутым капиллярным концом. Проводят осмотр органов грудной по­лости и при необходимости забирают из них кусочки ткани. Далее вскрывают брюшную полость. При наличии экссудата его засевают в питательную среду. Затем тщательно осматривают и исследуют органы полости. Взятие материала из паренхиматозных органов проводят следующим образом: поверхность органа прижигают на­гретым в пламени спиртовки скальпелем соответствующего размера; прижженный участок органа прокалывают стерильной пастеровской пипеткой с оттянутым концом или стерильной петлей; взятый мате­риал засевают.

Все этапы работы с лабораторными животными должны быть зарегистрированы в соответствующем журнале с графами:

1. Вид лабораторного животного.

2. Цель заражения.

3. Время заражения.

4. Материал, примененный для заражения.

5. Изменение поведенческих реакций животного после заражения.

6. Время гибели (умерщвления) животного.

7. Изменения, обнаруженные при вскрытии.

8. Материал, взятый для посева.

9. Свойства микроорганизма.

10. Вид микроорганизма.

Общая характеристика, виды и формы иммунитета

Иммунитет представляет собой систему биологических меха­низмов, направленных на сохранение постоянства внутренней среды организма, с помощью которых он распознает и уничтожает все ге­нетически чужое независимо от того проникает ли оно извне (мик­роб) или возникает в нем (мутировавшая клетка).

В инфекционной патологии иммунитет- это невосприимчивость макроорганизма к патогенным микробам и токсическим продуктам их жизнедеятельности.

На поверхности кожи и всех слизистых взрослого человека од­номоментно находится 1014-1015 различных микробов нормальной и условно-патогенной флоры. Время от времени к ним присоединя­ются субинфицирующие дозы различных патогенов. Не допустить их проникновение во внутреннюю среду макроорганизма призвана зволюционно сформировавшаяся система клеточных и гуморальных факторов резистентности. Это первая линия защиты организма от микробов, представляющая собой совокупность преиммунных био­логических реакций.

При дефектах и несостоятельности факторов резистентности в естественных условиях возникает инфекционный процесс, в ходе которого формируется вторая линия защиты организма- приобре­тенный иммунитет.

Приобретенным шшупштетом называют совокупность специ­фических факторов, которая формируется в процессе индивидуаль­ного развития организма и направлена против повторного контакта с тем же микробом или его продуктами. При этом наследственно по­лученные (факторы резистентности) и индивидуально приобретен­ные организмом защитные механизмы (факторы иммунитета) дейст­вуют сочетанно.

Приобретенный иммунитет подразделяют на варианты (схема 3).

Приобретенный естественный активный и приобретенный ис­кусственный активный являются активно приобретенными формами иммунитета и создаются самим организмом человека. Приобретен­ный естественный активный иммунитет возникает после перенесен­ного заболевания, скрытой инфекции или многократного бытового инфицирования без возникновения заболевания. Часто его называют постинфекционным и в зависимости от полноты очищения организ­ма от возбудителя подразделяют на стерильный и нестерильный.

Приобретенный искусственный активный иммунитет создается вакцинацией человека, то есть искусственным введением в его орга­низм веществ антигенной природы. Такую форму иммунитета назы­вают поствакцинальной.

Продолжительность активно приобретенных форм иммунитета значительна. Приобретенный естественный активный может сохра­няться годами, десятилетиями и даже в течение всей жизни (брюш­ной тиф, дифтерия, корь). Максимальная продолжительность приоб­ретенного искусственного активного иммунитета- 10 лет, чаще 1-2 года.

Пассивно приобретенный иммунитет возникает естественно, ко­гда антитела матери передаются с кровью плоду (1,, Ь, 1₃, 1₄) и с мо­локом при грудном вскармливании (1§А секреторный). Такой имму­нитет (плацентарный, материнский) обеспечивает невосприимчи­вость новорожденного на протяжении 6-7 мес к возбудителям неко­торых инфекционных заболеваний (корь, дифтерия, скарлатина).

Приобретенный искусственный пассивный иммунитет создается введением выработанных другим организмом (животным- гетеро-166

логичных, человеком - гомологичных) специфических антител. Продолжительность невосприимчивости 2-3 нед.

Ни одна из форм приобретенного иммунитета не передается по­томству. Его напряженность - относительная, и в большинстве слу­чаев, он утрачивается в различные сроки.

Приобретенный противоинфекционный иммунитет объединяет два звена иммунного ответа макроорганизма: гуморальное и клеточ­ное. Напряженность гуморального звена зависит от класса и уровня циркулирующих специфических антител, а клеточного- от функ­циональной активности макрофагов и различных субпопуляций Т-лимфоцитов. Как правило, в механизмах развития защиты против возбудителей инфекционных заболеваний принимают участие оба звена с преобладанием того или другого в разные фазы инфекцион­ного заболевания.

В зависимости от объекта действия приобретенный противоин-фекционный иммунитет подразделяют на антитоксический, антибак­териальный, противовирусный, иммунитет к грибкам, простейшим. Однако деление это достаточно условное и имеет в настоящее время лишь дидактическое значение.

Наряду с приобретенным иммунитетом существует видовой им­мунитет, который представляет собой генетически опосредованную невосприимчивость некоторых видов животных (и человека) к воз­будителям болезней, поражающих другие виды. Так, люди не вос­приимчивы к вирусу чумы собак, чумы рогатого скота (клетки чело­века не имеют рецепторов к вирусу). Животные не восприимчивы к некоторым вирусам (ветряной оспы, гепатита А, гепатита В, кори), некоторым бактериям (гонококки, возбудители сифилиса). Крысы и мыши устойчивы к дифтерийному токсину, а кошки и собаки - к столбнячному.

Видовой иммунитет, как правило, обусловлен отсутствием на клетках рецепторов к патогену (вирус, токсины) или мембранных субстратов, соответствующих ферментам проникновения микроба (гонококк).

Существуют и внутривидовые (расовые, этнические) различия в восприимчивости к инфекционным болезням. У жителей некоторых районов Африки обнаружен ген, вызывающий в организме его носи­телей синтез аномального гемоглобина, так называемого серповид-ноклеточного гемоглобина, или гемоглобина 5 (НЬ-3). Эритроциты, содержащие такой гемоглобин, принимают форму серпа. Люди, ге­терозиготные по данному гену, устойчивы к малярии, вызываемой Р1азтос1шт ШЫрашт. Негры более восприимчивы к возбудителю туберкулеза, чем белые.

Факторы и механизмы неспецифической противоинфекционной защиты

Способность вступать во взаимодействие с микроорганизмом и реагировать на него как на фактор, нарушающий нормальные фи­зиологические функции, характеризует общую физиологическую реактивность организма.

Восприимчивость макроорганизма зависит от места заражения (входные ворота), через которое проникают возбудители.

Попадание в макроорганизм микроорганизма-паразита включает сложную цепь защитно-приспособительпых реакций, направленных в конечном итоге на устранение возбудителя и восстановление структуры органов и систем организма. Защитные реакции макроор­ганизма, мобилизируемые при развитии инфекционного процесса, обеспечивают химическое постоянство внутренней среды организма, его генетического и антигенного состава (гомеостаз) и являются ча­стным вариантом адаптивной реакции организма на действие любо­го повреждающего фактора.

Сопротивляемость организма зависит от непроницаемости нор­мальных кожных и слизистых покровов для большинства микроор­ганизмов, наличия бактерицидных субстанций в кожных секретах, кислотности содержимого желудка, присутствия в крови и других жидкостях организма (слюна, слеза и др.) таких ферментных систем, как лизоцим, пропердин и др., от количества и активности фагоци­тов крови и тканей.

Все эти факторы являются неспецифическими, формируются в пренатальном периоде онтогенеза, они генетически детерминирова­ны. От момента рождения и до естественной смерти макроорганизма (постнатальный период онтогенеза) их функциональная активность постоянно меняется либо в силу возрастных особенностей, либо вследствие воздействия многообразных внешних факторов (физиче­ских, химических, биологических, психотропных и др.). В каждый конкретный момент жизни человека совокупность этих факторов определяет степень резистентности его организма. Их биологическая роль заключается в том, чтобы в ходе начавшегося инфекционного процесса воспрепятствовать развитию инфекционного заболевания.

Кожа. Важным фактором неспецифической резистентности яв­ляется функция кожи как механического барьера для внедрения па­разита. Отторжение верхних слоев эпидермиса, секреты сальных и потовых желез способствуют их удалению с поверхности кожи. Су­щественную роль в элиминации микробов с поверхности кожи игроют различные микробоцидные субстанции (молочная и жирные кислоты и др.), обеспечивающие ее «самоочищение». Поэтому раз­личные микроорганизмы, не являющиеся ее постоянными обитате­лями, не могут в течение продолжительного времени сохраняться на коже. Бактерицидность кожных секретов зависит от их кислотности.

Для определения бактерицидной активности кожи суточную бульонную культуру кишечной палочки (1:50 000) наносят на внут­реннюю поверхность предплечья и распределяют равномерно шпа­телем. Делают отпечаток на предметное стекло со средой Эндо с одного участка исследуемой кожи, а через 15 мин- со смежного. Инкубируют посевы 18-24 ч при 37°С и подсчитывают колонии на 3 см" поверхности каждой пластины.

Индекс бактерицидноети (ИБ) вычисляют по формуле

^ ~"" -100%, К, где К] - количество колонии сразу после нанесения на кожу; Кт -количество колоний через 15 мин после контакта. У здоровых людей индекс бактерицидное™ равен 90 - 100 %.

Слизистые оболочки. Для большинства микроорганизмов сли­зистые оболочки разных органов являются барьером, препятствую­щим проникновению внутрь организма. Проницаемость слизистых оболочек для микробов зависит от физиологического состояния макроорганизма и биологической активности данного вида или штамма микробов.

На слизистой оболочке патогенные микроорганизмы не имеют оптимальных условий для размножения в связи с бактерицидным действием тканей и секретов, смыванием слюной и др., поэтому в естественных условиях размножение их замедляется.

Лимфатические узлы. Барьером для большинства микроорга­низмов являются лимфатические узлы, а также скопления лимфоид-ных клеток в различных внутренних органах. В лимфоидной ткани благодаря действию клеточных факторов (цитотоксический эффект, фагоцитоз и др.) происходит фиксация и гибель значительной части или всех возбудителей.

Наиболее богаты лимфатическими сосудами кожа и слизистые оболочки пищевого канала и дыхательного аппарата. При поврежде­нии кожи и слизистых оболочек находящиеся на их поверхности микробы проникают в лимфатические сосуды и током лимфы дос­тавляются в лимфатические узлы, которые являются своеобразным биологическим фильтром для возбудителей, переносимых с лимфой.

Фагоцитоз. При воздействии на организм многообразных по­вреждающих факторов физической, химической и биологической природы возникает сложная неспецифическая защитно-приспособительная реакция организма - воспаление. Воспаление -местная реакция кровеносных сосудов, соединительной ткани и нервной системы на повреждение. В процесс воспаления вовлекают­ся лимфатические структуры, сосудистая сеть и локально повреж­даемые ткани. Сначала нарушается обмен жидкости, что еедет к на­рушению циркуляции в капиллярах. Одно из серьезных изменений -повышение проницаемости капилляров.

Итогом воспалительной реакции является локализация микроор­ганизмов (или отграничение вызванного ими очага поражения) с последующей их элиминацией и частичным или полным восстанов­лением нарушенных структур.

Первым звеном воспалительной реакции являются сосудистые изменения, выражающиеся прежде всего в повышении проницаемо­сти стенки сосудов, связанной главным образом с действием биоло­гически активных веществ (гистамин, серотонин, кинины), выде­ляющихся при повреждении клеток, особенно тучных. Повышение сосудистой проницаемости ведет к периваскулярной экссудации плазмы («серозный отек») и обусловливает миграцию клеток-фагоцитов (нейтрофилы, макрофаги) в пораженные участки ткани.

Указывают на роль воспалительного отека (скопление экссудата в воспалительной ткани) как фактора, способного связывать, фикси­ровать бактериальные токсины в очаге воспаления и не допускать их всасывания и распространения в организме. Особенно большое за­щитное значение имеют фагоцитарная и пролиферативная функции клеток- гистиоцитов, макрофагов. Грануляционная ткань, которую они образуют, представляет мощный защитный барьер против ин­фекции.

К главным факторам воспаления могут быть причислены фаго­циты - клетки, обладающие способностью поглощать и перевари­вать различные чужеродные для организма агенты, включая микро­организмы. Защитные свойства фагоцитов связаны с наличием в их цитоплазме большого числа лизосом - органелл, богатых различны­ми гидролитическими ферментами, которые обеспечивают расщеп­ление значительного числа химических связей. Процесс фагоцитоза нередко сопровождается гибелью клетки-фагоцита, однако при этом происходит гибель большого числа микроорганизмов.

Фагоцитоз - общебиологическое неспецифическое явление, ко­торое может быть отнесено филогенетически к высокому уровню распознаваемости чужеродности. Фагоцитирующие клетки мезен­химы приобрели в процессе эволюции определенную специализа­цию и стали поглощать широкий спектр посторонних частиц, таких как микроорганизмы, макромолекулярные комплексы антиген - ан­титело, клетки и их органеллы, вирусы, коллоидальные растворы красок и др. Важнейшее свойство фагоцитов состоит в их способно­сти распознавать «не свое», что ставит эту реакцию на переходную ступень между неспецифической резистентностью и специфическим иммунитетом.

Клетки, обладающие способностью к фагоцитозу и пиноцитозу, подразделяют на две основные категории фагоцитов - мононукле-арные и полинуклеарные («макрофаги» и «микрофаги», по И.И. Мечникову).

Процесс фагоцитоза протекает в несколько ступеней. На первой стадии распознавания основную роль играет клеточная мембрана, которая благодаря своим рецепторам (Рс-рецепторы) обеспечивает контакт с объектом фагоцитоза. Погружение чужеродной частицы внутрь макрофага связано со сложными изменениями физико-химических свойств его цитоплазмы. Вначале актиноподобный бе­лок макрофага полимеризуется, а затем полимеры сокращаются под действием миозина с кофактором. В итоге образуются псевдоподии, захватывающие фагоцитируемую частицу. Фагоцитирующая ваку­оль (фагоцитируемый агент, окруженный плазматической мембра­ной фагоцита и погруженный внутрь цитоплазмы) соприкасается с лизосомальными гранулами фагоцита. При слиянии вакуоли с лизо-сомами образуется фаголизосомальная (пищеварительная) вакуоль. Через непродолжительное время в вакуоли может наступить гибель захваченной частицы (например, бактерии). Этому способствуют метаболиты фагоцита и лизосомальные ферменты (завершенный фагоцитоз).

Микробоцидную деятельность осуществляет молочная кислота, образующаяся в результате гликолиза и понижающая внутриваку-ольный рН до 4,0, затем перекись водорода, являющаяся результа­том окисления никотиндиамид-адениннуклеотида в редуцированном фосфорилированном состоянии. Лизосомы содержат в себе более 30 различных ферментов, способных гидролизировать большую часть захваченных объектов. В гранулах лейкоцитов найдены и дру­гие микробоцидные вещества, например катионные белки, лакто-феррин, различные пероксидазьт, активные также в отношении и ви­русов. Однако не во всех случаях происходит гибель, а ряд возбудителей может даже размножаться в фагоците и погубить его (неза­вершенный фагоцитоз).

доступность клеток для определения фагоцитарной активности микрофагального (нейтрофилы) или макрофагального (моноциты) фагоцитоза представлена на схеме 4.

Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов перифериче­ской крови к цитратной крови, взятой из пальца, в объеме 0,2 мл до­бавляют 0,25 мл взвеси микробной культуры с концентрацией 2 млрд микробов в \ мл. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, центри­фугируют при 1500 об/мин в течение 5-6 мин, удаляют надосадоч-ную жидкость. Осторожно отсасывают тонкий серебристый слой лейкоцитов, готовят мазки, сушат, фиксируют, красят по Романов­скому - Гимза. Препараты сушат и микроскопируют.

Подсчет поглощенных микробов ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитов). Интенсивность реакции оценивают по следующим

показателям:

Г) фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность)- про­цент фагоцитов из числа сосчитанных клеток;

2) фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) - среднее число микробов, поглощенное одним активным фагоцитом. Для определения переваривающей способности лейкоцитов пе­риферической крови готовят смесь взятой крови и суспензии микро­организма и выдерживают в термостате при 37°С 2 ч. Приготовле­ние мазков аналогично. При микроскопии препарата жизнеспособ­ные микробные клетки увеличены в размерах, переваренные же ме­нее интенсивно окрашены, меньших размеров. Для оценки перева­ривающей функции используют показатель завершенности фагоци­тоза - отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов, выраженное в процентах.

Для оценки активности фагоцитоза используют также тест вос­становления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя (нитросинего тетразолия) в нерастворимый диформазан. НСТ-тест интегрально характеризует кислородзависимые антиин­фекционные системы фагоцита.

В две пробирки, содержащие по 0,05 мл раствора гепарина, вно­сят по 0,1 мл крови и после перемешивания в одну из них добавляют 0,05 мл суспензии зимозана, а в другую - 0,05 мл раствора Рингера, затем в обе пробирки вносят по 0,05 мл раствора нитросинего тетра­золия и инкубируют в водяной бане при 37 °С 30 мин, встряхивая каждые 10 мин. После инкубации содержимое перемешивают, дела­ют мазки, фиксируют, окрашивают красителем для НСТ-теста, нано­ся на стекла 5-7 кап. красителя на 1,5 мин, добавляют такое же ко­личество дистиллированной воды. Выдерживают в течение 30 мин, промывают.

При микроскопии препаратов в каждом случае подсчитывают 100 нейтрофилов (25 моноцитов), среди которых выделяют процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ-позитивные), далее подсчитывают индекс активности нейтрофилов (моноцитов) по формуле

тдло/ттл^ А.О + В.1 + С.2 + Д.З ИАН (НАМ) = —————————^—»

100(25)

где А - количество клеток, не содержащих диформазановых отло­жений или содержащих их в виде пылевидных немногочисленных включений; В - количество клеток, в которых площадь отложения диформазана не превышает 1/3 площади ядра; С -количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины площади ядра; Д - количество клеток с диформазановыми включе­ниями, по площади превосходящими площадь ядра.

Иммунология инфекционного процесса

Активность фагоцитоза обусловлена не только набором его ли-зосомальных ферментов и синтезируемых ими веществ, но и состоя­нием проницаемости лизосомной мембраны. Устойчивость к фаго­цитозу определяется поверхностными свойствами микробной клет­ка, наличием факторов типа леЙкотоксинов и антифагинов, инакти­вацией биоксидантов и пр. (табл. 9)

Нормальные антитела. В сыворотке людей и животных выяв­ляются нормальные антитела против различных микробных антиге­нов. Они обладают агглютинирующим, комплементсвязывающим, литическим, нейтрализующим влиянием на микробные антигены. Вопрос о природе так называемых неспецифических иммуноглобу-линов сыворотки до сих пор не решен. Между тем сыворотка крови может содержать иммуноглобулины даже по отношению к антиге­нам, о которых заведомо известно, что они никогда не поступали в данный организм. Такие антитела получили название естественных, или «нормальных». Они обычно определяются в низких титрах, од­нако их иммунологическая роль довольно выражена, особенно по отношению к инфекционным агентам.

Считается, что нормальные антитела появляются в результате так называемой неприметной иммунизации возбудителями или ан­тигенами, поступающими с пищей, однако нельзя отрицать и спон­танный (генетически обусловленный) механизм их образования.

Реакции антител по отношению к антигенам, о которых заведомо известно, что они не проникали в данный организм, могут расцени­ваться и как перекрестные, отсюда и их более низкие титры. Нор­мальные антитела могут поступать трансплацентарно или с молоком матери. Их титр определяется серологическими реакциями (РИГА, РСК и др.) и обычно равен 1:5-1:20.

р-лизины. Многие сыворотки проявляют бактерицидное дейст­вие по отношению к грамположительным, главным образом споро-образующим бактериям и микрококкам. Эта активность не связана с||| 0ЦШ"| "''"'"•-"••"^•"*

комплементом и сохраняется после прогревания сыворотки при 60-65 °С в течение 30 мин. Характерно, что р-лизины обнаруживаются в сыворотке после образования свернутого сгустка дельной крови и не обнаруживаются в плазме. Считается, что р-лизины выделяются в процессе свертывания крови тромбоцитами.

Бактерицидное действие р-лизинов, по-видимому, обусловлено их влиянием на цитоплазматическую мембрану, в результате чего наступает аутолиз клеточной стенки ферментами цитоплазматиче-ской мембраны. р-лизины активны только в присутствии ионов СаЛ

Для определения р-лизинов в нормальной сыворотке человека необходима спорообразующая культура сенной палочки. 'Готовят микробную взвесь, добавляют к 0,4 мл взвеси 0,2 мл исследуемой сыворотки. В контроле к 0,4 мл взвеси добавляют 0,2 мл физиологи­ческого раствора. Замеряют оптическую плотность опытной и кон­трольной пробирок, помещают в термостат при 37 °С на 2 ч. Вновь замеряют оптическую плотность. Расчет активности р-лизинов про­водят по формуле

Процент лизиса ~ —'——~- • 100,

где Д] и Д₂ - оптическая плотность в опыте до и после инкубации.

Для определения титра р-лизинов готовят разведения исследуе­мой сыворотки в мясопептонном бульоне. Затем во все пробирки добавляют взвесь суточной культуры сенной палочки, инкубируют в термостате 24 ч. Определяют титр р-лизинов- наибольшее разведе­ние сыворотки, давшее полный лизис тест-культуры.

Комплемент. Комплемент представляет собой систему сыворо­точных белков. Известно не менее 18 белков, составляющих систему комплемента. Восемь из них являются индивидуальными белками, а один представляет комплекс: 4 белка системы пропердина, один -ингибитор фермента активатора. Согласно номенклатуре, принятой ВОЗ, система комплемента обозначается символом С, а ее индиви­дуальные компоненты - символами С1, С2 и т. д.

Каждая белковая фракция обладает определенными свойствами. Комплемент находится в сыворотке крови различных животных и человека, но наибольшее его количество обнаружено в сыворотке крови морских свинок, поэтому в практике препарат «комплемент» отождествляется с сывороткой морской свинки. В норме фракции комплемента находятся в неактивном состоянии. Они становятся активными в процессе многоступенчатых превращений, разделяе­мых на классический и альтернативный пути активации. При клас­сическом пути начальным активатором комплемента является коммлеке антиген- антитело. Активируют систему комплемента 1§М и большинство подклассов 1§О (Т^СН, 1&СЗ) в большей степени, 1§С2 -и меньшей. При альтернативном пути активаторами являются поли-сахариды, в том числе зимозан и инулин, липополисахариды (эндо­токсины), агрегаты - 1^А. Дальнейший ход активации аналогичен классическому пути (схема 5).

В активном состоянии комплемент участвует в иммунных реак­циях: организма, при бактериолизе, ускоряет специфическую агглю­тинацию, преципитацию, усиливает фагоцитоз, участвует в реакциях

нейтрализации.

Активированные компоненты комплемента действуют в опреде­ленном порядке - в виде каскада ферментов, при этом продукт предшествующей реакции служит катализатором для включения в последующую реакцию компонента и субкомпонента. Комплемент является важным фактором гомеостаза и регулируется механизмами

последнего.

Комплемент отличается от иммуноглобулинов тем, что его концен­трация в сыворотке крови не повышается в результате иммунизации.

Содержание и уровень комплемента в крови можно использовать как тест, характеризующий состояние естественной резистентности макроорганизма: высокое содержание комплемента в крови считает­ся благоприятным признаком; снижение уровня комплемента явля­ется отрицательным прогностическим показателем.

Для определения титра комплемента исследуемую сыворотку разводят и добавляют гемолитическую систему (смесь равных объе­мов эритроцитов барана и гемолитической сыворотки).

Пробирки инкубируют при 37 °С 30 мин, встряхивая каждые 10 мин (табл. 10). Для контроля готовят разведения эритроцитов и дистиллированной воды: 0,1 мл + 2,9 мл (соответствует 20 % гемо­лизу); 0,25 мл + 2,75 мл (соответствует 50% гемолизу); 0,35 мл + 2,65 мл (соответствует 70 % гемолизу).

ПУТИ АКТИВАЦИИ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕМЕНТА

После инкубации содержимое пробирки центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин и определяют пробирку, соответствующую 50% гемолизу. Количество комплемента, внесенное в эту пробирку, делят на исходное разведение и узнают, какое количество неразведенной сыворотки дает этот феномен. Полученная величина будет соответ­ствовать 1 единице СН₅о. Вычисляют, сколько таких единиц будет в 1 мл неразведенной сыворотки.

Пропердин. В 1954 г. Л. Пилломер обнаружил сывороточный фактор, который, как тогда считалось, активирует СЗ и является центральным звеном альтернативного пути активации комплемента. Он был назван пропердином. Вскоре были обнаружены еще два до-

Яш/;'» ология инфекционного процесса

полнительных сывороточных белка- В и О. Вместе с компонентами комплемента С5 - С9 они были объединены в пропердиновую сис­тему. Действительная роль пропердина (Р) в альтернативном пути активации оказалась иной. Он является стабилизатором комплекса

СЗвВ (схема 6).

Схема 6

РОЛЬ ПРОПЕРДИНА В АЛЬТЕРНАТИВНОМ ПУТИ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА

лпс

Первичный СЗв

С3в +

СЗа

1* - стабилизатор комплекса СЗвВ О - фермент-активатор

комплекса СЗвВ,

Образуется СЗвВ в,

являющийся кониертазоЙ

для С 5

Усиление образования СЗв за счет расщепления СЗ

Фактор В - протеиназа, Мм 95 к Д, Фактор О - гликопротеин, Мм 25 к Д, Фактор Р-у-глобулин, Мм 220 к Д

Тем не менее содержание пропердина в сыворотке крови в опре­деленной степени коррелирует с уровнем ее бактерицидной актив­ности. В силу этого определение содержания пропердина в сыворот­ке крови больных продолжает использоваться в практике.

О количестве пропердина в испытуемой сыворотке судят по сте­пени сорбции комплемента на комплексе зимозан -пропердин. Чем больше в сыворотке пропердина, тем интенсивнее будет связываться этим комплексом комплемент.

Методика. Опыт ставится в двух пробирках. Опытная содержит испытуемую сыворотку, зимозан и комплемент, контроль­ная - только испытуемую сыворотку и комплемент. Пробирки инку­бируют при 37 °С 60 мин. Далее в обеих пробирках по общеприня­той методике титруют комплемент. Титр комплемента в контроль­ной пробирке показывает, какое количество комплемента было в опытной пробирке до образования комплекса пропердин -зимозан. Титрование же комплемента в опытной пробирке показывает, какое количество осталось несвязанным после образования этого комплек­са. По разнице полученных единиц можно судить о количестве ком­племента, связанного комплексом пропердин - зимозан, За 1 едини­цу пропердина принимается его количество, которое полностью свя­зывает весь комплемент в 1 мл сыворотки.

Лизоцим. По химической структуре лизоцим относится к поли-пептидам, содержащим в молекуле около 130- 160 аминокислотных остатков. Он растворим в слабокислой среде, устойчив к непродол­жительному кипячению, к трипсину.

Лизоцим (мурамидаза) способен расщеплять основное вещество клеточной стенки бактерии муреин путем разрушения связи между первым углеродным атомом п-ацетилмурамовой кислоты и четвер­тым углеродным атомом п-ацетилглюкозамина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. В результате этого изменяется ее про­ницаемость.

Лизоцим является мощным защитным фактором слизистой оболоч­ки полости рта, глаза, содержится в слезах, слюне, крови, материнском молоке, тканях различных внутренних органов. Высокая концентрация лизоцима выявляется в околоплодных оболочках к водах плода.

Основная масса лизоцима синтезируется, по-видимому, ткане­выми макрофагами и нейтрофилами.

Лизоцим выполняет в организме важные биологические функ­ции: бактерицидное, противовоспалительное действие, активацию фагоцитоза, нейтрализацию некоторых микробных токсинов.

Наибольший литический эффект лизоцим оказывает на культуру микрококка (т упго). Действие лизоцима можно оценить фотометри­чески по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка.

Методика. Готовят исходный раствор кристаллического лизоцима 100 мг/мл, а из него 9 различных разведении. Все разведе­ния как лизоцима, так и бактерий делают на 1/15 М фосфатном бу­фере, рН=б,2 (табл. 11).

Для приготовления взвеси бактерий смывают буферным раствором со скошенного агара суточную культуру микрококка и стандартизуют его на ФЭК-М по левому барабану до оптической плотности 0,66.

В каждую пробирку с приготовленными разведениями лизоцима вносят по 2 мл взвеси микрококка и выдерживают при 37 °С 30 мин в термостате. Замеряют оптическую плотность на ФЭК-М по право­му барабану в кювете № 2 с зеленым светофильтром. На основе по­лученных данных строят калибровочную кривую.

Для определения количества лизоцима исследуемый материал в объеме 0,1 мл добавляют к 0,4 мл буфера и к полученной смеси при­ливают 2 мл стандартизованной смеси микрококка. Контролем явля­ется пробирка, не содержащая исследуемого материала. Инкубируют в термостате 30 мин при 37 °С и на ФЭК-М определяют оптическую плотность в опытной и контрольной пробирках. По калибровочной кривой устанавливают концентрацию лизоцима в исследуемом ма­териале.

Бактерицидная активность сыворотки. Показано, что челове­ческая сыворотка способна убивать многие микроорганизмы. Это связано с наличием в сыворотке антител, лизоцима, комплемента, пропердина и других антибактериальных агентов (табл. 12). Более чувствительны к бактерицидному действию сыворотки грамотрица-тельные бактерии. Для оценки общей бактерицидной активности в пробирку с 2,5 мл мясопептонного бульона добавляют 0,5 мл иссле­дуемой сыворотки и 0,1 мл суточной бульонной культуры соответ­ствующего микроба. Контролем служит пробирка без сыворотки. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и берут 1,5 мл для измерения оптической плотности (Д) на ФЭК-М с зеленым фильт­ром. Контролем служит кювета с мясопептонным бульоном. Про­бирки помещают в термостат при 37°С на 3 ч. После инкубации вновь определяют оптическую плотность и рассчитывают бактери­цидную активность:

Бактерицидная активность = Д опыта через 3 ч-Допыта до инкубации

Д контроля через 3 ч - Д контроля до инкубации

100%.

Интерферон. Интерферонами называют группу белков с проти­вовирусным действием, вырабатываемых эукариотическими клетка­ми в ответ на внедрение в них ряда биологических агентов - ин-терфероногенов. 180

Различают а-, (3-, у- интерфероны (ШМ-а, 1"Ж-р, 1РМ-у). По хи­мической природе они относятся к гликопротеидам. Мм у 1РМ-а и 1РМ-р варьирует от 17 до 45 кД, а у 1ГМ-у - от 20 до 80 кД. Интерфе­роны осуществляют ингибицию репродукции многих вирусов и не только против индуцировавших его образование вирусов, но и про­тив ряда других не родственных с индуктором вирусов. Возможные механизмы антивирусного действия интерферонов представлены на схеме 7.

Схема 7

МЕХАНИЗМ АНТИВИРУСНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРФЕРОНА (БУКРИНСКАЯ А.Г., 1986)

Интерферон не влияет на прикрепление или проникновение ви­руса в клетку или на выделение его из клетки; он ограничивает или ингибирует лишь синтез вируса. Он циркулирует в организме чело­века кратковременно - около двух недель, что следует учитывать при применении интерферона как профилактического или терапев­тического средства.

Антигены

Антигенами называют чужеродные для организма вещества кол­лоидной структуры, которые при попадании в его внутреннюю среду способны вызывать ответную специфическую иммунологическую реакцию, проявляющуюся, в частности, в образовании специфиче­ских антител, сенсибилизированных лимфоцитов, или в возникнове­нии состояния толерантности к этому веществу.

Вещества, являющиеся антигенами, должны быть чужеродны для организма, макромолекулярны, находиться в коллоидном со­стоянии, поступать в организм парентерально, то есть минуя желу­дочно-кишечный тракт, в котором обычно происходит расщепление вещества и потеря его чужеродности. Под чужеродностью антигенов следует понимать определенную степень химического различия ме­жду антигеном и макромолекулами организма, во внутреннюю среду которого он попадает.

Простые элементы (железо, медь, сера и др.), простые и сложные неорганические соединения (кислоты, соли и др.), а также простые органические молекулы (моносахара, дисахара, аминокислоты) не являются антигенами. Биосинтез этих молекул заканчивается по­строением химически однотипных молекул независимо от того, в животной, растительной или микробной клетке он осуществляется, то есть эти вещества специфичностью не обладают, специфичность проявляется на более высоком уровне организации биологических макромолекул. Так, аминокислоты, соединенные в полимерную цепь, приобретают антигенность, если в эту цепь входит более 8 аминокислот. Термином «антигенность» обычно обозначают не только способность чужеродного вещества индуцировать образо­вание антител в организме, но и вступать с ними в специфиче­скую связь.

Антигенные свойства связаны с величиной молекулярной массы макромолекулы- она должна быть не менее 10 тыс. Д. Чем выше молекулярная масса вещества, тем выше его антигенность. Вместе с тем неверно считать, что высокая молекулярная масса является обя­зательным свойством антигена. Так, глюкогон (гормон поджелудоч­ной железы, Мм 3800), вазопрессин - ангиотензин (Мм 1000) также обладают антигенными свойствами.

Принято различать полноценные антигены, неполноценные ан­тигены (гаптены) и полугаптены. Полноцепными антигенами назы­ваются такие, которые вызывают образование антител или сенсиби­лизацию лимфоцитов и способны реагировать с ними как в организ­ме, так и в лабораторных реакциях. Свойствами полноценных антигенов обладают белки, полисахариды, высокомолекулярные нуклеи­новые кислоты и комплексные соединения этих веществ.

Неполноценные антигены, или гаптвны, сами по себе не способ­ны вызывать образование антител или сенсибилизацию лимфоцитов. Это свойство появляется лишь при добавлении к ним полноценных антигенов («проводников»), а среди образующихся антител или сен­сибилизированных лимфоцитов часть специфична к «проводнику», а часть - к гаптену, с которым они и могут реагировать как т у!уо, так и т уНго.

Полугаптеналш называются сравнительно простые вещества, ко­торые при поступлении во внутреннюю среду организма могут хи­мически соединяться с белками этого организма и придавать им свойства антигенов. К этим веществам могут принадлежать и неко­торые лекарственные препараты (йод, бром, антипирин и др.).

Молекула антигена состоит из двух неравных частей. Активная (малая часть) с молекулярной массой около 350-1000 Д носит назва­ние антигенной детерминанты (эпитоп) и определяет антигенную специфичность, Антигенные детерминанты расположены в тех мес­тах молекулы антигена, которые находятся в наибольшей связи с микроокружением. В белковой молекуле, например, они могут рас­полагаться не только на концах полипептидной цепи, но и в других ее частях. Антигенные детерминанты содержат в своем составе по крайней мере три аминокислоты с жесткой структурой (тирозин, триптофан, фенилаланин). Специфичность антигена связана также с порядком чередования аминокислот полипептидной цепи и комби­нацией их положений по отношению друг к другу. Примерно на ка­ждые 5000 Д относительной молекулярной массы молекулы антиге­на приходится одна антигенная детерминанта (эпитоп). Количество антигенных детерминант у молекулы антигена определяет его ва­лентность. Она тем выше, чем больше относительная молекулярная масса молекулы антигена. Так, у дифтерийного токсина 8 валентно­стей, у гемоцианина - 231 и т.д.

Остальная (неактивная) часть молекулы антигена, как полагают, играет роль носителя детерминанты и способствует проникновению антигена во внутреннюю среду организма, его пиноцитозу или фа­гоцитозу, клеточной реакции на проникновение антигена, образова­нию медиаторов межклеточного взаимодействия в иммунном ответе (Т-лимфоциты имеют рецепторы к носителю, В-лимфоциты- к ан­тигенной детерминанте). Антигенные детерминанты некоторых ан­тигенов получены искусственным путем. Их введение в организм животных без носителя, против ожидания, приводит к низкому иммунному ответу. В настоящее время ведутся разработки поь созданию синтетических носителей для синтетических антигенных детерминант.

Для проявления антигенности большое значение имеют путь введения антигена в организм и его доза. Для большинства антиге­нов бактерий и вирусов наиболее результативно внутрикожное и подкожное введение их. Оба пути значительно эффективнее внутри­мышечного или внутривенного, Энтеральный путь поступления для многих антигенов малоэффективен. Передозировка медленно выво­дящихся антигенов может вызвать иммунологический паралич. Вве­дение антигена в эмбрион приводит к возникновению толерантности после рождения животного. В зависимости от пути поступления на­блюдается преимущественное накопление антигена в том или ином органе: при внутривенном - в селезенке, костном мозге, печени; при подкожном - в регионарных лимфатических узлах. В клетку анти­гены поступают в результате фаго- или пиноцитоза. Сохранение ан­тигена в организме зависит при прочих равных условий, от размеров и химической структуры его молекул. Наиболее длительное пребы­вание его в организме (несколько сот дней) наблюдается при соеди­нении антигена с веществом, имеющим большой период полураспа­да. Выделяется антиген из организма в основном с мочой и (меньше)

с фекалиями.

Белки и углеводы крови и внутренних органов обычно не анти-генны для организма, в котором они синтезируются, и в то же время антигенны для других особей того же вида (изоантигены). Эта зако­номерность не распространяется на так называемые забарьерные органы, то есть органы, отделенные от кровотока особым барьером (гематоэнцефалический, гематотестикулярный и др.), белки которых в норме не поступают в кровь и являются антигенами для собствен­ного организма. В число таких органов входят мозг, хрусталик гла­за, паращитовидные железы, семенник.

Различные микробы в связи со сложностью их структуры и хими­ческого состава содержат разные антигены: белки (полноценные ан­тигены), углеводы, липоидные соединения (гаптены) и их комплексы.

Соответственно анатомическим структурам бактериальной клет­ки различают Н-антигены (жгутиковые, если бактерия их имеет), К-антигены (поверхностные, антигены клеточной стенки- полисаха­риды, липополисахариды, белки), О-антигены (соматический, внут­риклеточные- белки, нуклеопротеины, ферменты бактерий), анти­гены, экскретируемые бактериями в окружающую их среду (белки-экзотоксины, полисахариды капсул). 184

Среди многочисленных антигенов микробной клетки различают такие, которые присущи только данному типу микробов (типовые антигены), данному виду (видовые антигены), а также общие для группы (семейства) микроорганизмов (групповые антигены). Такие антигены извлекают из дезинтегрированных микробов, иммунизи­руют ими животных и получают соответственно типовые, видовые, групповые антисыворотки. Эти сыворотки применяют с целью иден­тификации выделенных из организма больного (или окружающей среды) неизвестных бактерий, определяя не только вид, но и серотип внутри вида.

Таким образом, бактериальная клетка (как и микроорганизмы других царств микробов- вирусы, простейшие, грибки) представля­ет собой сложный комплекс многочисленных антигенов. При ее по­падании во внутреннюю среду макроорганизма на многие из этих антигенов будут образовываться свои специфические антитела. Одни антигены индуцируют образование едва заметного количества анти­тел (титр), другие - быстрое и значительное антителообразование. Соответственно этому различают «слабые» и «сильные» антигены.

Не все антигены бактериальной клетки в равной степени участ­вуют в индукции невосприимчивости (иммунитета) к повторному попаданию в макроорганизм патогенных микробов того же вида. Способность антигена индуцировать иммунитет называют гшмуно-генностыо, а такой антиген - иммупогеном. Установлено также, что определенные антигены некоторых микроорганизмов могут вызы­вать развитие различных типов гиперчувствительности (аллергии). Такие антигены называют аллергенами.

Антигены бактериальных клеток получают двумя путями: пре-паративным - выделением клеточных структур после дезинтеграции микробов (физический метод) или извлечением антигенных фракций химическими веществами (химический метод).

Методы дезинтеграции микробов

1. Разрушение микробных клеток в механическом дезинтеграто­ре. В специальные нейлоновые стаканы помещают взвесь клеток (1 млрд/мл), на каждый миллилитр которой добавляют 1 г бус диамет­ром 0,15 мм, изготовленных из пирекс-стекла. Стакан вращается приводом электродвигателя со скоростью 3000 об/мин. Разрушение клеточных стенок бактерий наступает через 10-20 мин. Разница в экспозиции зависит от вида бактерий.

2. Разрушение клеток в прессах высокого давления. Продавли­вают замороженную при 30-70°С микробную массу через узкую щель под давлением в 2000 атм. При переходе бактерий из зоны вы­сокого давления пресс-аппарата в зону атмосферного давления их клеточная стенка разрушается. Процедуру повторяют 3-4 раза. Ме­тод является более щадящим, чем встряхивание с бусами.

3. Ультразвуковой метод дезинтеграции. Применяют генераторы, излучающие волны частотой не более 10-20 кГц и мощностью 60-100 Вт. Экспозиция озвучивания зависит от вида и формы микроб­ной клетки и колеблется от 10 до 60 мин.

4. Разрушение бактериальной клетки детергентами (лаурилсуль-фат натрия, дезоксихолат натрия). На 1 мл взвеси бактерий добав­ляют 1-1,5% детергента. Экспозиция зависит от вида бактерий и подбирается опытным путем.

После дезинтеграции бактериальных клеток одним из методов из взвеси выделяют жгутики, капсульное вещество, клеточные стенки, мембраны, цитоплазматические компоненты.

Методы выделения клеточных компонентов

1. Схема выделения жгутиков: целые микробные клетки со жгу­тиками — встряхивание с бусами в течение 5 мин - центрифугирова­ние при 8000 об/мин 30 мин- осадок (целые клетки) удаляют- в надосадочной жидкости находятся жгутики (жгутиковые антигены).

2. Схема выделения капсульной фракции: целые микробные клетки с капсулами - добавляют дистиллированную воду - центри­фугируют при 5000 об/мин 15 мин- осадок ресуспендируют в дис­тиллированной воде и встряхивают без бус при 3 000 колебаний/мин 15 мин- центрифугируют при 10 000 об/мин 20 мин- осадок уда­ляют-в надосадочной жидкости находится капсульная фракция.

3. Схема выделения клеточных стенок: целые микробы — встря­хивание с бусами 15 мин- центрифугирование при 5000 об/мин 20 мин - осадок удаляют (неразрушенные клетки) - в надосадочной жидкости находится фракция стенок бактерий.

4. Извлечение соматических антигенов из микробных клеток осу­ществляется также различным химическими способами: экстрагиро­ванием трихлоруксусной кислотой, кислотным гидролизом или фер­ментативным перевариванием бактерий с последующим осаждением антигена спиртом или сернокислым аммонием и очисткой диализом. Схема получения экзотоксинов: культивирование токсин-продуцирующих бактерий в жидкой питательной среде до максиму­ма продукции токсина- фильтрация для удаления бактериальных тел - перевод токсина в анатоксин путем длительного воздействия на него формалина при температуре 30-40°

Выделенные фракции (субфракции) антигенов из тех или других анатомических структур бактериальных клеток используют для по­лучения специфических сывороток, а они, в свою очередь, приме­няются для сероидентификации и серотипирования культур, выде­ленных от больных или из объектов внешней среды. Многие макро-молекулярные соединения микробных клеток являются антигенами, но только часть из них называют иммуногенами, то есть способны­ми вызвать образование антител - антитоксинов или сенсибилизиро­ванных лимфоцитов, принимающих участие в создании иммунитета. Поверхностные структуры бактерий (жгутики, капсула и клеточные стенки) значительно более антигенны, чем внутриклеточные компо­ненты (цитоплазма, в частности рибосомы, ДНК), Иммуногенные фракции находятся у большинства бактерий в капсуле (микрокапсу­ле) и клеточной стенке. Оказалось, что изолированные физическими способами клеточные структуры более иммуногенны, чем извлечен­ные химическими методами комплексы. В процессе химической экс­тракции более значительно повреждается исходная молекулярная организация биополимера, нарушается его нативная структура, в результате чего изменяются антигенные, в том числе иммуногенные свойства извлеченного комплекса. Внутриклеточные компоненты (цитоплазма, цитомембраны, генофор), где локализованы неспеци­фические антигены, обладают очень низкой иммуногенностыо.

Помимо получения антигенов из отдельных анатомических структур, часто возникает необходимость использования бактерий как комплекса антигенов. Схема получения корпускулярного бакте­риального антигена: посев бактерий на плотную оптимальную пита­тельную среду и культивирование в течение суток - смыв культуры физиологическим раствором - прогревание взвеси бактерии при температуре 60 °С (для неспоровых бактерий) в течение 1 ч- стан­дартизация взвеси по стандартам мутности Государственного инсти­тута стандартизации и контроля медицинских биологических препа­ратов. Стандартизацию проводят оптическим методом, то есть путем сравнения степени мутности взвеси бактерий с готовыми стандарта­ми. Стандарты выпускаются густотой 500 млн, 3-1,5-2 млрд мик­робных тел в 1 мл.

Для определения густоты полученной взвеси 1 мл ее наливают в пустую пробирку, равную по диаметру стандарту. Мерной пипеткой доливают физиологический раствор до тех пор, пока не исчезнет разница между густотой взвеси в этой пробирке и в стандарте на 1 млрд. Густота исходной взвеси бактерий выражается в миллиардах на миллиметр (млрд/мл) и равна общему объему жидкости в рабочей пробирке. Исходную взвесь разводят до нужной концентрации бак­терий. Определение количества бактерий во взвеси проводится так­же и нефелометрическим методом. В его основе лежит определение светорассеяния (мутности), вызываемого суспензией микробов. Ко­личество света, рассеиваемое этой суспензией, пропорционально числу и размерам клеток при данной длине волны. Разность интен­сивности света, падающего на кювету с микробной взвесью и про­шедшего через него, по калибровочной кривой переводится в абсо­лютное количество бактерий. Данный метод может быть использован только для тех микробов, которые в жидких средах дают равномерное помутнение, а сама среда должна быть оптически прозрачной.

Другие виды микроорганизмов (риккетсии, микоплазмы, грибки, простейшие, вирусы) имеют свои особенности антигенного состава, но общая характеристика свойств их антигенов остается той же, что и у бактерий (макромолекулярность, наличие антигенных детерми­нант и т. д.). С целью создания приобретенного искусственного ак­тивного иммунитета (человеку) или с целью получения сывороток (животному) вводят антигены (иммуногены) в очищенном виде в составе убитых или живых микроорганизмов. Это введение редко бывает однократным, а чаще двух- или трех- и многократным по специальным схемам. Для получения сывороток и иммуноглобули-нов от животных применяются схемы введения антигенов, в кото­рых предусмотрены дозы, кратность, интервалы между введениями, метод введения (схемы гипериммунизации), а также возможность использования одного из адъювантов.

Адъюваптами называется группа веществ как антигенной, так и неантигенной природы, относящихся к различным химическим со­единениям и имеющим различное происхождение, которые при вве­дении совместно с антигеном в организм животных и человека ока­зывают неспецифическое стимулирующее действие на формирова­ние иммунного ответа. К ним относят вещества неорганической природы: минеральные коллоиды (гидрат окиси алюминия, фосфат кальция, гидрат окиси железа), растворимые соединения (алюмо-калиевые квасцы, хлористый кальций); вещества органической при­роды: белки (протамины, желатин), липиды (животные, раститель­ные масла и жиры), углеводы (крахмал, танин, пектиновые вещест­ва), сложные вещества (адъювант Фрейнда, комплексы липидов с минеральными сорбентами). Наиболее полно действие адъювантов выявляется при первом соприкосновении организма с антигеном (грундиммунизация), но при последующих инъекциях антигена с адъювантом его стимулирующее действие заметно снижается.

Антитела представляют собой белки глобулиновой природы (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигена и обладающие способностью избирательно связываться с ним. Существует пять разновидностей молекул (классов) иммуног­лобулинов с молекулярной массой от 150 до 900 тыс. Д: г§М, 1§О, 1§А, 1§Е, 1дВ. Молекулы иммуноглобулинов состоят из двух легких (Ь) и двух тяжелых (Н) полипептидных цепей, соединенных между собой дисульфидиыми связями (рис. 34). Оба типа цепей, соединен­ных между собой, обладают антигенностью. У тяжелых цепей она специфична для каждого класса иммуноглобулинов и соответствен­но классам Н-цепи обозначаются ц, у, а, е, а. Легкие цепи в анти­генном отношении делят на две разновидности — К и К, одинаковые для разных классов. Антигенные различия тяжелых цепей исполь­зуют для получения антисывороток, позволяющих выявить наличие в исследуемом материале иммуноглобулинов того или иного класса. Легкие цепи 1§О состоят из двух участков (доменов): вариабельных (УЬ) и константных (СХ). Тяжелые цепи включают в себя один ва-риабельный (УН) и 3 константных участка (СН\, СН₂, СНз). Вариа-бельные участки легких и тяжелых цепей формируют активные цен­тры антител (УЬ -УН). Участок СЬ- СН, определяет небольшие различия в последовательности расположения аминокислот у инди­видуумов одного и того же вида (аллоантигенные различия молекул 1§М). Область СН2~СН₂ участвует в фиксации и активации компле­мента, а область СНз-СНз - в фиксации антитела к клеткам (лимфо­циты, макрофаги, тучные клетки). Данный тип строения молекулы характерен и для всех остальных классов иммуноглобулинов, разли­чия заключаются в дополнительной организации этой основной еди­ницы. Так, Н-цепь 1§М состоит не из 4, а из 5 доменов, а вся молеку­ла 1§М представляет собой пентамер молекулы 1§О, соединенный дополнительными полипептидными ,1-цепями. 1§А может быть в форме мономеров, димеров и секреторного 1§А. Последние две фор­мы имеют дополнительные (димеры) } или Д и 8 цепи (секреторный). Другие свойства антител представлены в

Молекула антитела связывается с детерминантой антигена не целиком, а лишь определенной своей частью, называемой активным центром. Активный центр представляет собой полость или щель, соответствующую пространственной конфигурации детерминантной группы антигена. Один из активных центров по разным причинам может быть функционально инертным. Такие антитела называются неполными. Их появлению обычно предшествует образование пол­ных, то есть антител с двумя (1@С) активными центрами. Неполные антитела встречаются у разных классов иммуноглобулинов.

Основная масса антител образуется в клетках плазмоцитарного ряда (плазмобласт, проплазмоцит, плазмоцит). Каждая из них про­дуцирует антитела только одной специфичности, то есть к одной антигенной детерминанте. Территориально эти клетки располагаются в селезенке, лимфоузлах, костном мозге, лимфоидных образованиях слизистых оболочек.

При первичном контакте организма с антигеном в антителообра-зовании различают индуктивную и продуктивную фазы. Продолжи­тельность первой фазы составляет около 2 сут. В этот период проис­ходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток, раз­витие плазмобластической реакции. Вслед за индуктивной наступает продуктивная фаза. В сыворотке крови антитела начинают опреде­ляться с 3-го дня после контакта с антигеном. Эти антитела отно­сятся к классу 1§М. С 5-7-го дня происходит постепенная смена синтеза 1§М на синтез 1§С той же специфичности. Обычно к 12-15-му дню кривая антителообразования достигает максимума, далее уровень антител начинает снижаться, но определенное их количе­ство можно обнаружить и через много месяцев, а иногда и лет. При повторном контакте организма с тем же антигеном индуктивная фаза занимает лишь несколько часов. Продуктивная фаза протекает быстрее и интенсивнее, осуществляется синтез преимущественно ТеО.

Для выделения и очистки молекул иммуноглобулинов применя­ют хроматографический и электрофоретический методы с предше­ствующим первичным фракционированием исходной многокомпо­нентной смеси (сыворотки крови человека, иммунизированного жи­вотного) путем избирательного осаждения молекул одного или не­скольких видов.

Фракционирование осаждением основано на различной раство­римости биополимеров (глобулинов) в водных растворах, которая определяется наличием и соотношением гидрофобных и гидрофиль­ных группировок в их структуре. Белки, несущие на поверхности значительное количество гидрофобных аминокислотных остатков, например глобулины, плохо растворимы в водной среде с низкой ионной силой, а белки, характеризующиеся низкой гидрофобностью (альбумины), обладают высокой растворимостью в воде. С увеличе­нием ионной силы раствора, в котором находятся глобулины, их растворимость повышается, однако по достижении определенного предела концентрации они начинают агрегировать и выпадать в оса­док. Происходит солевое осаждение молекул - высаливание. Так как глобулины разных классов отличаются друг от друга по характеру растворимости при высоких концентрациях соли, то постепенно увеличивая ионную силу раствора, в котором находятся различные молекулы, можно последовательно перевести их в нерастворимое состояние, то есть высолить. Эффективными солями для осаждения иммуноглобулинов являются сульфаты и фосфаты, цитраты натрия, калия и аммония. Из органических растворителей для фракциониро­вания иммуноглобулинов больших размеров чаще всего используют этанол и риванол. В последние годы для осаждения сывороточных белков используют водорастворимые полимеры - полиэтиленгли-коль и сульфат декстрана. Так, для осаждения 1§М применяют 6% концентрацию полиэтиленгликоля, для осаждения 1§О - 12% и для осаждения 1§А - 14%.

Отдельные глобулины, перешедшие под воздействием различ­ных реагентов в нерастворимое состояние, представляют собой дос­таточно крупные агрегаты, которые можно отделить от раствора фильтрованием. В современных биологических исследованиях ши­роко используют фильтры из стекловолокна, асбеста, нитроцеллю­лозы, ацетатцеллюлозы, целлюлозы, тефлона, нейлона, капрона, по-ливинилхлорида и др.

Полученные фракции иммуноглобулинов обычно подвергают более тонкой очистке хроматографией или электрофорезом. К на­стоящему времени разработаны различные виды хроматографии среди которых наиболее распространены гель-фильтрация, ионооб­менная и аффинная. Существует множество приемов применения каждого из видов хроматографии - колоночная, в тонких слоях и т. д. Гранулами набухшего в каком-либо растворителе геля с пористой структурой наполняют колонки, наслаивают сверху на столб геля осажденную фракцию иммуноглобулинов с разными молекулярны­ми массами и пропускают их через гель. Поскольку гранулы геля имеют пористую структуру, то часть молекул, размеры которых меньше величины пор, проникают в гранулы и мигрируют опреде­ленное время в их сетчатой структуре. Молекулы, размеры которых больше величины пор, не проникают в гранулы, а, огибая их, про­двигаются быстрее. В результате молекулы глобулинов элюируются из хроматографической колонки поочередно - в порядке уменьше­ния их молекулярных масс. Субфракции глобулинов с разной моле­кулярной массой собирают раздельно. Для гельфильтрации приме­няют три вида гранулированных гелей: декстрановые, агарозы (се-фарозы), полиакриламидные (биогели, акрилексы).

В основе метода ионообменной хроматографии лежит примене­ние носителей, состоящих из нерастворимой основы (гели декстра-на, агарозы, полиакриламида) с фиксированными на ней функцио­нальными группами (сульфометильные, сульфоэтильные, сульфо-пропильные, карбоксиметильные или карбоксиэтильные и другие катионы). При пропускании через ионообменник с положительно заряженными функциональными группами (катионообменник) сме­си глобулинов, имеющих отрицательный заряд, последние свяжутся с ними. Связавшиеся глобулины отличаются между собой изоэлек-трическими точками, и их можно затем в определенной последова­тельности элюировать из ионообменника.

Принцип иммуноаффинной хроматографии заключается в том, что на носителе (агароза, целлюлоза, гели сефадекса или полиакри-ламида, бентонит и др.) сорбируют функционально активные моле­кулы антигенов. При пропускании через такой иммуносорбент фракций иммуноглобулинов произойдет образование комплекса но­ситель - антиген - иммуноглобулин. В последующем комплекс дис­социируют для получения чистой фракции иммуноглобулина. Им­муносорбент используют многократно.

Разделение классов глобулинов проводят также с использовани­ем метода электрофореза, поскольку их электрофоретическая под­вижность различна.

Генетический контроль биосинтеза антител

Типичная молекула иммуноглобулина состоит из 2Н и 2Ь цепей (обе X 70% или обе К 30%). Полипептидные цепи синтезируются на рибосомах В-лимфоцитов, собираются в молекулу (глобулу) и транспортируются либо на клеточную поверхность, где они выпол­няют роль В-клеточных рецепторов, либо в кровь, где они выполня­ют функции антител.

Синтез полипептидных цепей контролируется тремя генными локусами, расположенными на разных хромосомах. Локусы имеют различные комбинации, в зависимости от контроля той или иной цепи и могут содержать следующие участки:

1) Ь- кодирует лидерный пептид, необходимый для секреции антител на поверхность клетки;

2) V - гены вариабельной части антитела;

3) С - гены константной части;

4) 1 - гены соединительной области полипептида;

5) О - гены дополнительной вариабельности.

Функциональная организация генов, контролирующих синтез различных цепей, представлена на схеме (цифрами указано число вариантов):

40 6 Синтез К-цепи: Ь -- V - 3 — С

100 4 Синтез Н-цепи :Ь-У-О-]-С-С-С-С-С-С-С-С-С

200 20 4 ц о 7з 71 74 72 ^р- ^а! 0-2

Таким образом, в каждой В-клетке, синтезирующей только один класс (подкласс) антител, функционирует один из локусов генетиче­ского контроля синтеза легких цепей (один из многочисленных ва­риантов V и I или 1-С) и локус контроля синтеза Н-цепи (один из вариантов V, О, I, С).

Многообразие вариантов генов в одной В-клетке обеспечивает общее количество потенциальных вариантов образования антител всеми В-клетками организма до 10 , а при учете сплайсинга (неточно­сти считывания информации с ДНК этих локусов В-лимфоцита) ва­риабельность образования специфических антител возрастает до 10 . Клеточная кооперация в иммунном ответе

На коротком плече С$ хромосомы человека расположено не­сколько генетических локусов, которые контролируют синтез неко­торых белков, играющих важную роль в иммунном ответе и прежде всего в клеточных взаимодействиях. Совокупность этих локусов (ге­нов) получила название главного комплекса гистосовместимости (ГКГС; синоним МНС - та]ог Ы51осотраиЪШгу сотр!ех; НЬА - Ьи-тап 1еисосу1:е апп'^епз). Локусы подразделены на три класса:

Класс I содержит три наиболее изученных

.__, -_„..„„,. локуса А, В, С, каж­дый из которых может быть представлен вариантами одного и того же гена (аллелями):

Вероятно, вариан-А локус включает 41 вариант, В - 71, С -тов много больше.

Функции продуктов Е, Р, О, Н локусов, также относящихся к классу I, остаются неясными, Локусы (гены) класса I контролируют синтез гликопротеидов, выполняющих роль клеточных рецепторов. Структура рецепторов класса I представлена на рис. 35.

Тяжелая цепь димера гликопротеида (45 кД) состоит из гидро­фильного цитоплазматического домена (участка), гидрофобного транс мембранного, константного внеклеточного (а-3) и двух вне­клеточных вариантных (а-2, а-1). Домен а-1 имеет короткую угле­водную цепочку (УЦ). Легкая цепь димера представлена р₂-микрогл обул ином (12 кД), который входит в состав ее константной части. Она не имеет вариантов, кодируется одним из генов 15-й хро­мосомы, не относящимся к ГКГС. Щель между а,-а_э и р₂М является активным центром связывания и презентации антигена (антигенных детерминант) Т-цитотоксическим лимфоцитам. Рецепторы класса I имеются на поверхности любых ядросодержащих клеток организма, что лежит в основе его индивидуальной антигенной специфичности. Они обеспечивают «узнавание» собственных клеток макроорганиз­ма, межклеточную кооперацию, презентацию антигена. Класс II локусов включает несколько генов:

Три из них (ОР, ВО, ОК.) изучены лучше, роль других (и контро­лируемых ими продуктов) неясна. Локусы (гены) ЙР, ОО, ОН кон­тролируют синтез а- и р- цепей клеточных рецепторов и могут иметь аллели (альтернативные варианты генов), число которых представлено на схеме. Структура рецепторов класса II изображена на рис. 36. 196

Рис. 36. Структура рецепторов ГКГС класса II

Рецептор ГКГС класса II представляет собой гликолротеид, со­стоящий из двух цепей. Цепь А представлена вариабельным внекле­точным доменом а-1(34 кД), константным внеклеточным доменом а-2 (34 кД), гидрофобным трансмембранным и гидрофильным цито-плазматическими доменами. Домены а-1и а-2 имеют по одной ко­роткой углеводной цепочке. Цепь В также имеет четыре домена: ва-риабельный внеклеточный (3- 1 (28 кД) с одной углеводной цепоч­кой, константный внеклеточный (3-2 (28 кД), гидрофобный транс­мембранный и гидрофильный цитоплазматический. Щель между а-1и (3-1 представляет собой активный центр рецептора. Рецепторы ГКГС класса Я имеются только на макрофагах, В-лимфоцитах и не­которых активированных Т-лимфоцитах,

Класс III локусов ГКГС содержит гены, контролирующие син­тез некоторых компонентов, участвующих в активации С₃ компо­нента комплемента.

Контролируемые этими генами компоненты системы компле­мента (С/}, фактор В, С₂) секретируются в кровь, циркулируют вме­сте с ней, но на мембранах клеток организма они не фиксируются.

Процессинги презентация антигена

Всякая микробная клетка представляет собой сложный антиген­ный комплекс, в состав которого входят десятки антигенов, каждый из которых индуцирует «свой» иммунный ответ. Таким образом, иммунный ответ на микроб является суммарным эффектом ответа на большинство антигенов, входящих в его структурные и функцио­нальные компоненты. Расщепление микробной клетки до отдельных антигенов осуществляется вспомогательными клетками, прежде все­го макрофагами, и носит название процессинга. Роль рецепторов ГКГС состоит в транспортировке пептидов (антигенов) на клеточ­ную поверхность и представлении их (презентации) другим клеткам, участвующим в клеточной кооперации при иммунном ответе.

При поражении соматических клеток макроорганизма микроба­ми, для которых характерно внутриклеточное паразитирование (ви­русы, риккетсии, хламидии, микоплазмы, микобактерии и др.), про-цессинг антигена осуществляется в протеосомах, а затем пептиды (антигены) транспортируются рецепторами ГКГС- I на поверхность этих клеток. Комплекс ГКГС- I- пептид является сигналом для СВ8 - цитолитическои клетки, инициирующей процесс лизиса по­раженной клетки вместе с патогеном (рис. 37).

Другая ситуация возникает при заболеваниях, для возбудителей которых внутриклеточное паразитирование не является обязатель­ным (сальмонеллез, шигеллез и др.). Процессинг антигена выполня­ется после фагоцитоза возбудителя или эндоцитоза его компонентов макрофагами на территории их эндосом. Пептиды (антигены) транс­портируются молекулами ГКГС-П на поверхность макрофага и пре-зентируются другим иммунокомпетентным клеткам для последую­щей продукции антител

Т-клеточныЙ рецептор состоит из двух цепей а-цепь представлена четырьмя доменами: вариабельным внеклеточным, константным внеклеточным, гидрофобным внутримшбранным и гидрофильным цитоплазматическим (Мм 50 кД). р-цепь имеет аналогичные домены (Мм 45 кД).

Корецепторы межклеточных взаимодействий На поверхности клеток, принимающих участие в иммунном от­вете, расположены белковые молекулы (молекулярные комплексы) выполняющие роль корецепторов межклеточных взаимодействий. Известно более 200 корецепторов, и они обозначаются номерами соответственно принятой классификации таких комплексов (с!ш1ег оГ ёезщгапоп) - СО1 ...СО100 и т.д. СО-рецепторы могут быть представлены на Т-, В-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах, грану-лоцитах и др. Функция некоторых корецепторов сводится к распо­знаванию «своей» антигенпредставляющей клетки. Например, Т-лимфоцит, имеющий СО4 (Т-хелпер) или СВ8 (цитолитическии Т-лимфоцит), распознают «свою» антигенпредставляющую клетку через «узнавание» рецепторов ГКГС-11 или ГКГС-1. Дополнительно макрофага

Гуморальный (антительный) тип иммунного ответа

При развитии гуморального ответа В-лимфоцит может получить микробный пептид разными путями:

1. Получение растворимого антигена из окружающей микросфе­ры. Пептид не требует дополнительной обработки, так как это уже сделано другой клеткой. Происходит селекция антигеном В-лимфоцита (В-лимфоцитов), имеющего предсуществующие у-глобулиновые рецепторы на своей поверхности, наиболее специфи­ческие к данному антигену.

2. Получение растворимого антигена с помощью у-глобулинового рецептора, его дальнейший процессинг на террито­рии В-лимфоцита и представление на мембране В-лимфоцита в ком­плексе с ГКГС-П.

3. Получение антигена с поверхности макрофага. Селекция В-лимфоцитов по у-рецепторам. Процессинг антигена в В-лимфоцитах и его представление Т-лимфоцитам.

ГКГС-П макрофага презентирует антиген Т-хелперу (С^4). Под влиянием ИЛ-4, продуцируемого нейтрофилами, тучными клетками, базофилами, эозинофилами Тп трансформируется в ТЬ2, индуци­рующих гуморальный тип иммунного ответа. Важнейшими из ин-терлейкинов, продуцируемых этими лимфоцитами, являются ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, резко стимулирующие пролиферацию избран­ных в результате селекции В-лимфоцитов. Синтезируемые транс­формированными В-лимфоцитами (плазмоцитами) антитела специ­фичны к данному антигену. Гуморальный тип ответа наиболее важен в отношении внеклеточно расположенных микробов. Антитела усиливают их поглощение и переваривание фагоцитами.

Особенности иммунитета при бактериальных,

грибковых и протозойных инфекциях

Антибактериальный иммунитет

Формирование механизмов саногенеза (выздоровления) при раз­личных бактериальных инфекциях лежит в основе некоторых осо­бенностей иммунитета, возникающего в течение таких заболеваний.

Так, при бактериальных инфекциях, возбудители которых про­дуцируют экзотоксин (дифтерия, столбняк, ботулизм, газовая ган­грена и др.), ведущую роль в формировании иммунитета играют об­разующиеся в организме антитела (антитоксины). Взаимодействие молекулы антитоксина и молекулы токсина может приводить к раз­ным результатам:

1) к блокаде рецепторного участка молекулы токсина и вследствие этого к ограничению фиксации токсина на рецепторах клеток-мишеней;

2) к прямой нейтрализации каталитического (энзиматического, токсического) участка молекулы токсина;

3) к образованию иммунного комплекса с нейтрализацией токси­ческого, рецепторного и (или) транслокационного участков (субъе­диниц) токсина. Такие комплексы фагоцитируются и утилизируются клетками макроорганизма. Однако антитоксические антитела не блокируют адгезию бактерий на поверхности клеток-мишеней и их колонизацию. Вследствие этого искусственный антитоксический иммунитет не создает полной защиты макроорганизма и не предот­вращает фиксацию бактерий на поверхности клеток-мишеней, коло­низацию клеток и ткани, размножение бактерий.

При другой группе бактериальных инфекций (менингококковая инфекция, коклюш, легионеллез и др.) решающая роль принадлежит иммунному лизису и фагоцитозу бактерий. Образующиеся при этих заболеваниях 1§С инициируют целый ряд антителоопосредованных биологических реакций: а) при фиксации АТ на поверхности бакте­рий происходит активация комплемента по классическому варианту с образованием мембраноатакующего комплекса и последующим лизисом обнаженных участков мембран бактерий; б) опсонизация бактерий антителами с последующим взаимодействием Рс - фраг­ментов антител с Рс-рецепторами макрофагов, что приводит к уси­лению поглотительной и периваривающей активности фагоцита; в) образующийся комплекс «бактериальный АГ-АТ-С 1,4,2,3В» фик­сируется на рецепторах макрофагов к СЗВ, что также ведет к усиле­нию поглотительной активности таких комплексов фагоцита­ми; г) нейтрализация антителами антифагинов, выделяемых бакте­риями наружу (фактор, препятствующий образованию фагоцитами псевдоподий; фактор, препятствующий миграции макрофагов) или входящих в состав их анатомических структур (М-протеин стрепто­кокков, капсульные вещества пневмококков и др.).

Таким образом, формирующийся при этих заболеваниях имму­нитет зависит от уровня циркулирующих 1§О, содержания и актив­ности компонентов комплемента, а также от функционального со­стояния фагоцитов.

К следующей группе бактериальных инфекций, со своими осо­бенностями формирования иммунитета, относятся такие, возбудите­ли которых являются внутриклеточными паразитами, способными длительно существовать внутри фагоцитов и даже размножаться в них (туберкулез, туляремия, бруцеллез, листериоз и др.).Основными механизмами, позволяющими бактериям осуществ­лять внутриклеточный паразитизм, являются:

1) блокада фаголизосомального слияния (микобактерии тубер­кулеза);

2) резистентность бактерий к действию лизосомальных фермен­тов (гонококки, стафилококки);

3) способность бактерий быстро покидать фагосомы после по­глощения и длительно пребывать в цитоплазме (листерии).

Для заболеваний с длительным внутриклеточным пребыванием и размножением возбудителя (персистенция) характерно образование Гранулем в пораженной ткани. Такие бактерии становятся недоступ-^ыми для действия антител и гуморальных антибактериальных фак-торов. Механизм саногенеза и формирования иммунитета при таких заболеваниях связан прежде всего с образованием цитотоксических ^-лимфоцитов, оказывающих киллинг-эффект на клетки-мигиени, содержание в них паразитирующих бактерий и маркированных ре­цепторами ГКГС-1, презентирующих АГ этих бактерий.

Особенности иммунитета при грибковых заболеваниях

Особенности противогрибкового иммунитета обусловлены мор­фологическими свойствами грибков (размеры клеток, форма), слож-(-юсти их антигенного состава, изменчивостью в зависимости от ус-^овий существования, формой и стадией микоза.

Большинство грибков относятся к свободноживущим организ­уем и только некоторые из них способны вызывать заболевания. -|5олее того, для возникновения заболевания у человека необходимым условием является наличие у него иммунодефицита по полиморфно-ядерным лейкоцитам, Т-лимфоцитам, СЗ компоненту комплемента, функциональными дефектами лейкоцитов являются их неспособ-.{ость образовывать псевдоподии (синдром «ленивых лейкоцитов»), неспособность формировать фаголизосомы (синдром Чсдиака- Хи-,-аси), нарушение способности к продукции активных форм кисло-рода, обеспечивающих переваривание микроба. Дефицит по СЗ так-^е ведет к снижению активности фагоцитов. И, наконец, наиболее ^асто микозы у человека возникают при низкой продукции ^-лимфоцитов (Тс, ТЬ).

Формирование иммунитета связывают с восстановлением функ-иональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов и усилен-Й продукцией Т-лимфоцитов.

Специфические антитела образуются лишь при некоторых фор-глубоких микозов. Считают, что они не принимают участия в механизмах защиты, являясь свидетелями иммунной перестройки .,рганизма.

Особенности иммунитета при протозойных заболеваниях

Особенности обусловлены внутриклеточной локализацией возбудителей, изменчивостью их поверхностных антигенов, наличием ^тигенов, общих с антигенами клеток человека, иммуносупрессив-свойствами паразитов.

При протозойных заболеваниях могут образовываться 1§М и 1§С, но специфичность этих иммуноглобулинов крайне низка вслед­ствие их образования в результате поликлональной активации В-лимфоцитов и антигенной изменчивости паразитов.

Выздоровление наступает при активации Т-лимфоцитов (Тс, ТЬ). Полноценный постинфекционный иммунитет формируется очень редко.

Серологические методы исследования

Серологические реакции применяют в двух направлениях:

1. Выявление с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого при наличии набора известных антигенов. В качестве антигенов применяют взвеси микроорганизмов, инактиви-рованные химическими или физическими методами, или используют диагноетикумы, представляющие фракции микроорганизма.

Как правило, результаты серологической диагностики получают при исследовании парных сывороток крови больных, взятых в пер­вые дни болезни и через определенные промежутки времени от на­чала заболевания.

2. Определение родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизма или его антигенов к известным иммунным сыво­роткам. Иммунные сыворотки должны содержать антитела в высо­ком титре и быть строго специфичными.

В лабораторной практике применяют серологические реакции, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агг­лютинация, преципитация) и опосредованные реакции (реакция не­прямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента), а так­же реакции с использованием меченых антител или антигенов (им-муноферментный, радиоиммунный анализ, метод флюоресцирую­щих антител).

Реакция агглютинации (РА)

Реакция агглютинации применяется в лабораторной практике для идентификации выделенных микроорганизмов или для обнару­жения специфических антител в сыворотке крови.

Механизм реакции основан на взаимодействии детерминантных групп антигена с активными центрами иммуноглобулина в электро­литной среде. Реакции протекают в две фазы- соединение антигена с антителом и выделение в осадок образовавшегося комплекса АГ+АТ. Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевый осадок, безжгутиковые и бескапсу-лярные - мелкозернистый, капсульыые - тяжистый

Существует два метода постановки реакции агглютинации: пла­стинчатый и пробирочный. Пластинчатый метод является качест­венной реакцией и служит для предварительного определения вида микроба, пробирочный используется для определения количествен­ного содержания антител, при этом в пробирках ставится разверну­тая реакция агглютинации.

Рис. 43. Реакция агглютинации: / - микробная клетка; 2 - антиген; 3 - антитело

При положительной реакции на дне пробирки образуется осадок (агглютинат). За титр антител принимают последнее разведение, в котором наблюдается четкая агглютинация. Интенсивность оценива­ется по 4-крестной системе. Постановка РА должна сопровождаться контролем сыворотки и антигена. Учет реакции агглютинации на стекле производится через 5-10 мин, пробирочной - через 18-20 ч.

Реакция преципитации (РП)

Феномен преципитации заключается во взаимодействии мелко­дисперсных антигенов (преципитиногенов) с соответствующими антителами (преципитинами) и образованием преципитата (рис. 44). Постановку РП осуществляют двумя методами; в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации или в плотной среде в агаре (геле). РП применяют в двух целях: выявления антигенов по известной иммунной преципитирующей сыворотке или антител с использованием известных антигенов. Существует много вариантов постановок реакции, но чаще всего используют следующие методи­ки: реакцию преципитации в геле по Оухтерлони, радиальную им-мунодиффузию но Манчини, реакцию иммуноэлектрофореза, реак­ции флокуляции,кольцепреципитации.

Для постановки реакции преципитации в геле по Оухтерлони используют 1% агар Дифко, который разливают расплавленным на предметные стекла или чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. В за­стывшем агаре вырезают лунки диаметром 5 мм специальным при­способлением. В одну лунку помещают взвесь, содержащую иссле­дуемый антиген, в другую - иммунную сыворотку. Антиген и анти­тела диффундируют в питательную среду, вступают в иммунную реакцию и образуют полосы преципитации. Учет реакции проводят предварительно через 4 ч, окончательно - через 24^-8 ч. Реакцию Оухтерлони можно использовать для определения токсичности бак­терий, титра антител, активности стандартных диагностикумов или иммунных специфических сывороток

Реакция кольцепреципитации

Данную реакцию применяют для выявления антигенов с помо­щью иммунной преци цитирующей сыворотки, содержащей специ­фические антитела. Это качественный метод исследования. Реакцию проводят путем наслаивания на иммунную сыворотку среды, содер­жащей определенный антиген. Реакцию ставят в узких пробирках объемом 0,1-0,5 мл. В случае соответствия антигена и антитела на границе между ними через 3-5 мин образуется кольцо преципитации (см. рис. 45). Необходимым условием образования нерастворимого иммунного комплекса является эквивалентное соотношение антиге­нов и антител.

Радиальная иммунодиффузия по Манчини

Радиальная иммунодиффузия по Манчини позволяет использовать моноспецифические антисыворотки и эталон с известным содержанием антигена. Тест-антиген и разведения растворов, исследуемых на нали­чие данного антигена, помещают в лунки, вырезанные рядами в пла­стине геля, куда предварительно внесена соответствующая моноспеци­фическая аптисыворотка. Антиген диффундирует в гель и, соединив­шись со специфическими антителами, формирует кольца преципита­ции, диаметры которых зависят от концентрации антигена в лунках. Полученные результаты используют для построения калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметров преципитантов от кон­центрации антигена в исследуемых растворах (рис. 46).

Принцип радиальной диффузии положен в основу метода, при­меняемого для изучения токсигенности бактериальных культур и отбора из бактериальной популяции клонов с высокой степенью ток­сичности. В этом случае исследуемые культуры засевают в чашки с агаром, содержащим антитоксическую сыворотку. Вокруг отдельных колоний образуются кольца преципитации, диаметр которых прямо пропорционален степени токсичности штамма

Реакция иммуноэлектрофореза (ИЭФ)

В основе реакции лежит принцип преципитации. ИЭФ, как пра­вило, используется для исследования антигенной структуры микро­организмов. Реакцию осуществляют в два этапа. Вначале проводят электрофоретическое разделение антигена в забуференном агаровом геле. Антигенный комплекс помещают в лунку, которая находится в центре геля, залитого на стеклянную пластинку. Затем через гель пропускают электрический ток, в результате происходит перемеще­ние антигенов на неодинаковые расстояния соответственно их элек-трофоретической подвижности. После этого в канавку, которая рас­положена по краю пластинки, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте их соприкосно­вения образуются дугообразные линии преципитации. С помощью ИЭФ анализируются состав и количество белков сыворотки крови, спинномозговой жидкости, микробных протеинов (рис. 47).

Реакция связывания комплемента (РСК)

РСК используется для лабораторной диагностики венерических заболеваний, риккетсиозов, вирусных инфекций (грипп, корь, кле­щевой энцефалит и др.) и основывается на способности комплемента связываться с комплексом АГ+АТ. Комплемент адсорбируется на Рс-фрагменте иммуноглобулинов О и М. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза- взаимодействие антигена и антитела. В качестве материала, содержащего антитела, используется исследуемая сыво­ротка, к которой добавляется известный антиген. К этой системе до­бавляют стандартный комплемент и инкубируют при 37 °С в тече­ние одного часа.

Рис. 48. Реакция связывания комплемента:

А -лизис сенсибилизированных эритроцитов в присутствии комплемента; Б~ отсутствие гемолиза вследствие фиксации комплемента комплексом АГ+АТ; В - лизис эритроцитов в результате отсутствия комплекса АГ+АТ

Вторая фаза - выявление результатов реакции при помощи ин­дикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемоли-тическая сыворотка кролика, содержащая гемолизины к эритроци­там барана). К смеси антиген + антитело + комплемент (первая фаза) добавляют индикаторную систему и вновь инкубируют при 37 °С в течение 30-60 мин, после чего оценивают результаты реакции. Раз­рушение эритроцитов происходит в случае присоединения к гемоли­тической системе комплемента. Если комплемент адсорбировался ранее на комплексе АГ+АТ, то гемолиз эритроцитов не наступает. Гемолиз происходит в том случае, когда в исследуемой сыворотке со­держатся специфические антитела к диагностическому антигену. При отсутствии в исследуемой сыворотке специфических антител комплекс АГ+АТ не образуется и комплемент остается несвязанным. При добав­лении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и происходит гемолиз эритроцитов. Интенсивность РСК оценивают по 4-крестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и нали­чия осадка эритроцитов. Все компоненты РСК, за исключением иссле­дуемой сыворотки, должны быть оттитрованы (рис. 48).

Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА)

РИГА применяют в двух вариантах: с известными антигеном для обнаружения антител или с известными антителами для выявления антигена. Эта реакция специфична и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для постановки РИГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах антигенов или антител, в зависи­мости от цели исследования (рис. 49).

Рис. 49. Реакция непрямой (пассив­ной) гемагглютинации: 1 ~ эритроциты; 2 - антиген эритро­цита; 3 - конъюгированный антиген; 4 ~ антитело

В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имею­щую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), которая покрывает дно пробирки. Наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принима­ют предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два полюса.

Реакция гемагглютинации (РГА) и реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

В основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амнио-тическую жидкости, суспензию хорион-аллантоисных оболочек ку­риных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов жи­вотных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведе­ния антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции исполь­зуются эритроциты животных, птиц, человека \ (0) группы крови.

Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло на­носят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материа­ла, тщательно смешивают. При положительном результате через 1-2 мин макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглю­тинации эритроцитов.

Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистероло-вых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения иссле­дуемого материала на физиологическом растворе в объёме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25-1% взвеси эритроцитов. Ре­зультаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контро­ле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию определяют по характеру осадка эритроцитов.

В положительных случаях степень агглютинации отмечают плю­сами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, при которой образу­ется тонкая пленка из склеившихся эритроцитов, покрывающая дно пробирки (зонтик); реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами; хлопьевид­ный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютини­рованных эритроцитов, соответствует одному плюсу. Резко очер­ченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведе­ние исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.

При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками.

РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принад­лежности выделенного вируса и титрования антител в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом рас­творе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус, и по одной капле 1% взвеси эритроцитов.

При использовании РТГА для определения типа вируса исполь­зуют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения антигена. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу.

РГА и РТГА широко применяются для диагностики вирусных инфекций (клещевой энцефалит, грипп и др.) с целью обнаружения специфических антител и для идентификации многих вирусов по их антигенам.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфическими антителами, меченными флюоресци­рующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотиоцианат, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), кото­рые имеют реакционно-способные группы (сульфохлорид, изотио-цианат и др.). Эти группы соединяются со свободными аминогруп­пами молекул антител, которые не теряют при обработке флуоро-хромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ+АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микроскопом (рис. 50). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количе­ства бактериальных и вирусных антигенов. РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой методы.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антителом, непрямой - на поэтапном выявлении комплекса АГ+АТ с помощью флуоресцентных красителей. Первый этап заклю­чается в образовании иммунных комплексов определенного антигена со специфическими антителами, второй - в выявлении этого ком­плекса путем обработки его меченым антигаммагл обул ином.

Преимуа1,ество РИФ - простота, высокая чувствительность, ско­рость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляре­мии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования использу­ется люминесцентный микроскоп.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

РИА - один из самых чувствительных методов иммунодиагности­ки. Его применяют для выявления антигена вируса гепатита В у боль­ных вирусным гепатитом. Для этого к исследуемой сыворотке добав­ляют рефсренс-сыворотку (сыворотку, содержащую антитела к вирусу гепатита В). Смесь инкубируют 1-2 сут при температуре 40 °С, затем добавляют референс-антиген (антиген, меченный изотопом ^12>1) и про­должают инкубацию еще 24 ч. К образовавшемуся комплексу антиген -антитело добавляют лреципитирующие антииммуноглобулины против белков референс-сыворотки, что приводит к образованию преципитата (рис. 51). Результат учитывают по наличию и числу импульсов в пре­ципитате, зарегистрированных счетчиком. При наличии в исследуемой сыворотке антигена, связавшегося со специфическими антителами, по­следние не вступают в связь с меченым антигеном, поэтому он не обна­руживается в преципитате. Таким образом, в основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого антигена и из­вестного количества меченого антигена с активными центрами антител.

Иммунофсрментный метод (ИФА)

Метод используется для выявления антигенов с помощью соот­ветствующих им антител, конъюшрованных с ферментом-меткой (пероксидаза хрена, |3-галактоза или щелочная фосфатаза). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат и хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, а его продукты деградации вызывают химическую мо­дификацию хромогена. При этом хромоген меняет свой цвет- ин­тенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связав­шихся молекул антигена и антител.

Иммуноферментный анализ, выявление антигена прямым и непрямым методами твердо фазного ИФА

Наиболее распространен твердофазный ИФА, при котором один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбиро­ван на твердом носителе. В качестве твердого носителя используют­ся микропанели из полистирола, При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больных, антиглобулиновую сыворотку, меченную фермен­том, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Каж­дый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При поло­жительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только ан­тигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антите­лами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем- смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

ИФА применяют для диагностики заболеваний, вызванных ви­русными и бактериальными возбудителями.

Иммунологи чески и статус больных инфекционными заболеваниями

При остропротекающих инфекционных заболеваниях (дизенте­рия, салмонеллез, холера, псевдотуберкулез и др.) основной задачей лечащего врача является своевременная постановка диагноза и про­ведение мероприятий, направленных на элиминацию возбудителей и их токсинов, назначение патогенетического и этиотропного лечения. При хронических же заболеваниях (бруцеллез, туберкулез, сифилис и др.), когда диагноз уже установлен, проблемой врача становится определение показателей иммунитета (иммунологического статуса) с целью выявления его возможных нарушений у больного и соответ­ствующей иммунокоррекции.

Для оценки иммунологического статуса при инфекционных за­болеваниях применяется большое количество методов, часть из ко­торых может быть выполнена в условиях клинической лаборатории многопрофильной больницы, а другие - только на базе специализи­рованных иммунологических лабораторий. Условно все методы де­лят на ряд групп (уровней):

1) общая оценка состояния 1'- и В-систем иммунитета (число Т-и В-лимфоцитов, их субпопуляции, рецепторный аппарат и др.);

2) оценка дополнительных факторов иммунитета (функциональ­ное состояние (и количество) макрофагов, нейтрофилов, компонен­тов комплемента, у-интерферона);

3) изучение особенностей специфического иммунитета клеточ­ного (Т-лимфоциты, сенсибилизированные к антигенам возбудителя, их субпопуляции, синтез ими интерлейкинов - ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9, ИЛ-10) и гуморального (В-лимфоциты, сенсибилизиро­ванные к антигенам возбудителя, синтез ими иммуноглобулинов, образование иммунных комплексов) звеньев.

В зависимости от географической зоны пребывания, климата, преобладающего типа питания, местных особенностей региональные нормы показателей иммунологического статуса практически здоро­вых людей будут разными (табл. 14). Тем более эти показатели будут отличаться при различных хронически протекающих инфекци­онных заболеваниях у разных людей (особенности иммунопатоло-гии при данном заболевании, пол, возраст пациента, сопутствующие заболевания и т.д.). Коррекция работы звеньев иммунной системы возможна с помощью иммуномодуляторов, количество которых воз­растает с каждым годом

Иммунотерапия инфекционных болезней

Иммунотерапия может входить в состав этиотропного (исполь­зование иммунных сывороток, иммуноглобулинов, в некоторых слу­чаях вакцин) и патогенетического (введение крови и кровезамените­лей, плазмы, неспецифических стимуляторов различного происхож­дения) лечения. При этом некоторые иммунопрепараты обладают одновременно антимикробным и иммуностимулирующим действием (специфические иммуноглобулины, стимуляторы растительного происхождения).

Применение иммунотерапии оправдано широким использовани­ем в медицине препаратов, угнетающих иммунный статус организма (антибиотики, гормонотерапия) либо вызывающих аллергизацию организма, что меняет характер течения инфекционных заболеваний и замедляет освобождение организма от возбудителя.

По способу получения иммунотерапевтические средства можно разделить на следующие группы:

а) получаемые из крови и различных органов человека (плазма, сыворотки, гамма-глобулины, химозин, лимфокины, интерферон);

б) получаемые из растений (стимуляторы ЦНС растительного происхождения, витамины);

в) стимуляторы микробного происхождения (пирогенал, проди-гиозан);

г) синтетические препараты (левамизол, индометацин).

По характеру терапевтического действия различают иммунопре­параты специфические (иммунные сыворотки, иммуноглобулины, вакцины) и неспецифические стимуляторы иммунитета (кровь, плазма, пирогенал).

Показаниями к применению иммунотерапии являются:

- элиминация возбудителя (этиотропная серотерапия);

- хронические инфекции, сопровождающиеся нарушением раз­личных звеньев иммунитета (туберкулез, лепра, сифилис, лейшма-ниоз, вирусные инфекции);

- вялое затяжное течение инфекционного процесса;

- иммунопрофилактика инфекций у людей с врожденными им-мунодефицитами;

- опасность развития вторичной инфекции;

- инфекционная бронхиальная астма и другие аллергические проявления;

- развитие системных поражений аутоиммунной природы, пер­вично индуцированных инфекционным антигеном (ревматизм, хро­нический гепатит и др.);

- применение с лечебной целью препаратов, обладающих им-мунодепрессивньши свойствами (антибиотики, кортикостероиды).

"Иммунотерапию назначают в комплексе с другими лекарствен­ными препаратами (антибиотики, су ль фан и л амиды). При этом необ­ходимо прогнозировать возможность побочного действия иммуно-препаратов (лихорадка, тошнота, головная боль, аллергические про­явления, лейкопения и др.).

Антимикробная терапия инфекционных заболеваний

Под химиотерапией и химиопрофилактикой инфекционных за­болеваний понимают лечение и профилактику бактериальных, ви­русных, грибковых или протозойных инфекций химиотерапевтиче-скими средствами, действующими избирательно на возбудителя за­болевания.

Химиотерапевтические препараты должны обладать специфич­ностью действия, максимальной терапевтической эффективностью и минимальной токсичностью для организма. Безвредность данных препаратов устанавливается с помощью химиотерапевтического ин­декса, который представляет собой отношение минимальной тера­певтической дозы к максимально переносимой. При индексе мень­ше единицы препарат может быть использован для лечения соответ­ствующей инфекции, поскольку его терапевтическая доза будет меньше переносимой:

Минимальная терапевтическая доза {РС -Ро^5_сига11уа) Максимально переносимая доза (ОТ - Оозгз Ыегапйа) Специфичность действия химиотерапевтических препаратов оп­ределяется антимикробным спектром. Одни из них преимуществен­но действуют на грамположительные бактерии, другие — на грамот-рицательные, третьи - на простейшие, четвертые - на грибы и т.д. Химиотерапевтические препараты могут оказывать б актер и о стати­ческое или бактерицидное действие на инфекционные агенты. В первом случае идет полное или частичное подавление роста и раз­множения бактерий, во втором - их гибель. Но в конечном итоге бактериостатическое действие также приводит к гибели бактерий. Механизмы антимикробного действия данной группы препаратов различны и, как правило, связаны с подавлением жизненно важных метаболических реакций, протекающих в микробных клетках. Для лечения инфекционных заболеваний применяют следующие химио-препараты:

1) производные мышьяка (новарсенол, миарсенол, аминарсон, осарсол и др.) - для лечения сифилиса, возвратного тифа, трипано­сомоза, амебиаза, балантидиаза, сибирской язвы и др.;

2) препараты висмута (основной нитрат висмута, ксероформ, ос­новной салицилат висмута, бисмоверол, битиурол, пентабисмол и др.) - при энтероколитах, сифилисе;

3) соединения сурьмы (винносурьмянокалиевая соль, стибенил, еуръмин, солюсурьмин и др.) - для лечения лейшманиоза, венери­ческого лимфогранулематоза;

4) соединения сурьмы (салициловая ртуть, двухйодистая ртуть, ртутная серая мазь и др.) - для лечения сифилиса, при гноеродных заболеваниях;

5) препараты акридина (риванол, трипафлавин, флавицид, акри-цид и др.) - при гноеродных заболеваниях, воспалительном процес­се зева и носоглотки;

6) противомалярийные средства (хинин, акрихин, плазмоцид, хиноцид, сульфадиамин и др.);

7) алкалоидные препараты (эмитин и др.) - для лечения больных амебиазом;

8) сульфаниламидные препараты (стрептоцид, этазол, норсуль­фазол, сульфадимезин, уросульфан, сульгин и др.) - для лечения гноеродных заболеваний, ангин, скарлатины, рожи, пневмоний, тра­хомы и др.;

9) препараты иитрофурапового ряда (фуразолидон, фурадонин, фурагинид) - для лечения больных кишечными инфекциями;

10) синтетические препараты (ПАСК, тибон, фтивазид, циклосе-рип и др.) - для лечения туберкулеза;

11) противовирусные препараты (бензамидазол, гуанидин, ти-мидин, ремантадин, азидотимидин, дидеоксинозин и др.);

12) антибластомные препараты (циклофосфан, новоэмбихин, экдоксан, дегранол, хлорметин и др.) - для лечения злокачествен­ных опухолей.

Антибиотики

Антибиотики представляют собой разновидность химиотерапев-тических препаратов, содержащих специфические вещества, кото­рые образуются клеткой в процессе жизнедеятельности, а также их производные и синтетические аналоги, обладающие способностью избирательно воздействовать на микроорганизмы. Антибиотики являются продуктами метаболизма многих микроорганизмов, высших растений и клеток животных.

Антибиотики получают специальными методами, применяемы­ми в медицинской промышленности. Для производства природных антибиотиков используют штаммы бактерий, актином и цетов, гри­бов, которые засевают в питательный субстрат. Через определенное время антибиотики экстрагируют, очищают, концентрируют, прове­ряют на безвредность и активность.

Биологическая активность антибиотиков выражается в междуна­родных единицах (ЕД). За единицу активности принимается то ми­нимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стан­дартного штамма определенного вида микроорганизма в строго оп­ределенных условиях. Так, за единицу действия пенициллина при­нимают наименьшее количество препарата, подавляющего рост эта­лонного штамма стафилококка. Она соответствует 0,6 мкг стандарт­ного бепзилпенициллииа.

Антибиотики классифицируют по источникам выделения, хими­ческому составу, механизму действия на микробные клетки, анти­микробному спектру.

По источникам выделения антибиотики де­лят на следующие группы:

1) выделенные из грибов (пенициллин);

2) выделенные из бактерий (грамицидин, полимиксин и др.);

3) выделенные из тканей животных (лизоцим, экмолин);

4) полученные из растений -фитонциды (аллицин, новоиманин). По химическому составу различают:

1) беталактамные антибиотики, или бетал актами ды (пеницил-

лины, цефалоспорины);

2) тетрациклин и его полусинтетические производные (окси-тетрациклин, хлортетрациклин, метациклин, диоксициклин);

3) аминогликозиды (группа стрептомицина, неомицин, кана-

мицин, пентамицин);

4) макролиды (эритромицин, олеандомицин);

5) левомицетин;

6) рифампицин;

7) полиеновые антибиотики (нистатин, леворин).

По механизму антимикробного дей­ствия различают антибиотики:

1) ингибирующие синтез клеточной стенки (пенициллины, цефа-лоспорины, циклосерин);

2) нарушающие функции цитоплазматической мембраны (полиеновые антибиотики, полимиксины);

3) ингибирующие синтез белков на рибосомах (аминогликозиды, тетрациклины, левомицетин, макролиды);

4) угнетающие синтез нуклеиновх кислот (рифампицин).

По антимикробному спектру различают антибиотики:

1) узкого спектра действия (бензилпенициллин, нистатин, лево-рин и др.);

2) широкого спектра действия (цефалоспорины, тетрациклины, левомицетин, аминогликозиды, рифампицин).

Большинство антибиотиков обладают бактерицидным действием (бензилпенициллин, цефалоспорины, рифампицины), а некоторые -бактериостатическим (левомицетин, тетрациклин и др.).

Для успешного проведения лечения антибиотиками необходимо предварительно определить степень чувствительности к ним мик­робов, вызвавших заболевание. С этой целью предложен ряд мето­дов. Наибольшее распространение получили:

1. Метод дисков.

На чашку Петри с плотной питательной средой «газоном» засе­вают взвесь изучаемой культуры микроба. На засеянную поверх­ность агара помещают и слегка прижимают бумажные диски, пропи­танные антибиотиками. Диски накладывают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2,5 см от центра чашки. Одну чашку можно использовать для изучения чувствительности микроорганиз­ма к 5-6 антибиотикам. Чашки выдерживают при 37°С 16-18 ч и учитывают результаты опыта путем измерения зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. При зоне диаметром до 10 мм штамм расценивают как устойчивый, 11-15 мм- малоустойчивый, 15-25 мм - чувствительный, 25 мм и выше - высокочувствительный.

2. Метод дорожки.

В чашке Петри стерильным скальпелем вырезают и удаляют до­рожку агара шириной в 1 см. Затем в пробирку с растопленным ага­ром вносят определенную концентрацию антибиотика. Содержимое пробирки перемешивают и выливают в дорожку. После застывания агара перпендикулярно к дорожке засевают петлей культуры нескольких исследуемых микроорганизмов. Посевы помещают в тер­мостат. Чувствительные к антибиотику микроорганизмы начинают расти на некотором расстоянии от дорожки.

3. Метод серийных разведении в жидкой среде. Данным методом определяют минимальную концентрацию ан­тибиотика, ингибирующего рост исследуемой культуры микроба. Вначале готовят основной раствор, содержащий ряд последующих двойных разведении антибиотика в питательной среде, пригодной для роста микробов. После чего к каждому разведению добавляют смыв суточной агаровой культуры испытуемого микроорганизма в концентрации 10 000 микробов в 1 мл. Результаты опыта учитывают после инкубации растворов при 37 °С в течение 18-20 ч. Минималь­ную, подавляющую рост данного микроорганизма, концентрацию антибиотика определяют по последней пробирке с прозрачным бульоном при наличии интенсивного роста в контроле.

Аптимикробная терапия зависит от достаточной концентрации антибиотика в крови, которую определяют методом серийных разве­дении. Используют среду Гисса следующего состава: пептонная во­да, 1% глюкозы, 1% реактива Андреде. Среду Гисса разливают по 1 мл в два ряда пробирок по 10 пробирок в каждом. Один ряд служит для титрования антибиотика, второй - для титрования исследуемой сыворотки. В первую пробирку первого ряда вносят 1 мл антибиоти­ка с концентрацией 4 ЕД/мл, тщательно перемешивают, 1 мл пере­носят во вторую пробирку этого ряда и т.д., таким образом получают двукратные разведения антибиотика от 2 до 0,0037 ЕД/мл. В первую пробирку второго ряда вносят 1 мл исследуемой сыворотки и путем переноса 1 мл из пробирки в пробирку готовят двойные разведения. Из последней пробирки 1 мл выливают.

Суточную бульонную культуру золотистого стафилококка раз­водят в 100 раз. По одной капле этого разведения вносят во все про­бирки обоих рядов, инкубируют при 37 °С 18-24 ч. При росте ста­филококка среда Гисса мутнеет и становится красной, при задержке роста бактерий среда остается прозрачной и бесцветной. Результаты вносят в таблицу. Для определения концентрации антибиотика в 1 мл исследуемой жидкости наибольшее разведение ее, задержи­вающее рост стафилококка, умножают на наименьшую концентра­цию стандарта, дающую задержку роста (табл, 16). 224

Иммунопрофилактика инфекционных заболеваний

Иммунопрофилактика - способ создания невосприимчивости к инфекционным заболеваниям путем создания искусственного спе­цифического иммунитета (иммунизации).

Различают две формы иммунизации:

1) активная - создание активного иммунитета введением в орга­низм микробных антигенов (вакцины, анатоксины);

2) пассивная - введение в организм препаратов, содержащих антитела (иммунные сыворотки, гамма-глобулины).

Прививочные препараты для активной иммунизации (вакцинации)

По природе составляющих их компонентов вакцины разделяют на живые, убитые, химические, анатоксины.

Живые гстеровакцины при введении в организм вызывают легкие формы заболевания, перекрестно защищающие от более тя­желых форм. Например, вакцина против коровьей оспы позволяет создать иммунитет против натуральной оспы.

Живые ослабленные (аттенуированные) вакцины содержат измененные формы возбудителей инфекционных заболеваний (вак­цинные штаммы, которые потеряли вирулентные свойства, но сохра­нили способность индуцировать выработку иммунитета). Снижение вирулентности осуществляется следующими основными методами;

а) культивирование бактерий на средах с измененным составом или температурой (вакцины против туберкулеза, сибирской язвы,

чумы, туляремии);

б) пассаж микроорганизма через организм невосприимчивых или маловосприимчивых животных (антирабическая вакцина);

в) создание в лабораторных условиях штаммов-рекомбинантов. Кроме этих методов, используются выявление и селекция штам­мов возбудителей, потерявших в естественных условиях вирулент­ность для человека. Живые вакцины вызывают субклиническое за­болевание и обеспечивают эффективную защиту. В то же время они могут стать причиной тяжелых персистентных инфекций, вызвать поражение генетического аппарата клеток. Поэтому при иммуниза­ции людей с иммунодефицитными состояниями необходима макси­мальная осторожность.

Убитые корпускулярные вакцины (инактивированные) по­лучают из свежевыделенных вирулентных и иммуногенных штам­мов возбудителей, инактивированных температурой либо с помо­щью химических веществ. В зависимости от применяемого химиче­ского вещества различают формоловые, спиртовые, ацетоновые, мер-тиолятные, хлороформенные вакцины. Убитые вакцины безопаснее живых, но менее эффективны и требуют повторного введения (ревак­цинаций). В настоящее время применяются убитые вакцины против коклюша, холеры, лептоспирозов, клещевого энцефалита и др.

Химические вакцины содержат антигены, извлеченные из мик­роорганизмов с помощью химических веществ или ультразвука. Они включают в себя различные антигенные компоненты бактерий (ан­тигены клеточной стенки, У1-антигены, Н-антигены, рибосомальные антигены) и вирусов (субвирионные, субъединичные вакцины, например из поверхностного антигена вируса гепатита В). Использо­вание очищенных антигенов позволяет повышать иммуногенность препаратов и снижать их недостатки: сенсибилизацию макроорга­низма, большую нагрузку на иммунную систему, реактогенность и токсичность, обусловленную наличием липидов и других химиче­ских соединений. Разновидностью химических вакцин являются анатоксины (токсоиды) - ииактивированные формалином, но сохра­нившие антигенность бактериальные экзотоксины (например, диф­терийный, столбнячный, ботулинический, гангренозный, стафило­кокковый анатоксины). Анатоксины применяются для иммунопро­филактики инфекций, где основным патогенетическим фактором является экзотоксин (токсикоинфекции).

В настоящее время разрабатываются лгтосомные вакцины, кото­рые представляют комплексы, состоящие из антигенов и липофиль-ных носителей. Иммунолипосомы более эффективно стимулируют антителогенез, а также индуцируют пролиферацию Т-лимфоцитов и секрецию ими ИЛ-2.

Синтетические искусственные вакцины конструируются пу­тем создания макромолекулярных комплексов на основе неприрод­ных полиэлектролитов и химически синтезированных главных де­терминантов (эпитопов). При этом синтетические полимеры - поли-электролитьт являются носителем антигенности (шлеппером) и вы­ступают как мощные стимуляторы иммунного ответа, обходя кон­троль со стороны 1г-генов и тимуса. В определенных случаях эффек­тивными могут быть антиидиотипические вакцины,

Генно-инженерные вакцины - ген, ответственный за синтез иммуногенных детерминант, встраивается в генетическую структуру другого, менее вирулентного микроба (например, сальмонеллы или вируса осттовакцины).

Если, допустим, вектором (носителем) этого гена является вирус осповакцины, то он будет индуцировать в организме образование иммунитета не только против оспы, но и против того возбудителя, чей ген встроен в его геном. Например, рекомбинантный вирус ос­повакцины, содержащий в своем геноме ген поверхностного антиге­на вируса гепатита В (НВ$А§), будет создавать иммунитет против гепатита В.

Кассетные, или экспозиционные, вакцины - носителем анти­генности у этих вакцин являются белковые структуры, на поверхно­сти которых экспонируются соответствующие антигенные детерми­нанты. Такая вакцина обладает высокой специфичностью и выра­женной иммуногенностыр.

Ассоциированные вакцины - препараты, в состав которых входят несколько синтетических, сбалансированных между собой антигенов. Преимущество их перед моновакцинами заключается в обеспечении одновременной выработки иммунитета против не­скольких возбудителей инфекций. Это сокращает число инъекций и повышает иммуногенность вакцин. Применяют следующие ассо­циированные вакцины: АКДС, АДС, полианатоксины против газо­вой гангрены, полиомиелитную вакцину и др.

Вакцины выпускаются в жидком и сухом виде. В зависимости от назначения и эффективности их можно вводить накожно (оспенная), внутрикожно (тул ярем и иная), подкожно (клещевого энцефалита), интраназалъно (гриппозная), орально (полиомиелитная).

Для лечения больных с пониженной резистентностыо при хро-, нических, вялотекущих заболеваниях в случае отсутствия эффекта от применения антибиотиков, химиопрепаратов и иммуноглобули-нов в ряде случаев используют аутовакцины. Для приготовления такого препарата используются свежевыделенные культуры из орга­низма больного человека.

Введение в организм вакцин сопровождается комплексом адап­тационных реакций, связанных с иммунологической перестройкой. На месте введения вакцины возможно появление инфильтрата, отеч­ности, некроза. Общие реакции характеризуются повышением тем­пературы тела, недомоганием, головной болью. В редких случаях наблюдаются тяжелые осложнения - аллергическая сыпь, шок, су­дороги. Противопоказаниями к применению вакцин являются ост­рые инфекции, туберкулез, аллергозы, заболевания ЦНС, сердечно­сосудистой системы, болезни печени, почек, иммунодефициты, опу­холевые заболевания, беременность.

Прививочные препараты для пассивной иммунизации

Для выработки активного поствакцинального иммунитета необ­ходим достаточно длительный промежуток времени (2-4 нед). В тех случаях, когда требуется экстренная защита организма от инфекции (лиц, побывавших в контакте с источником возбудителя), применя­ется пассивная иммунизация введением сыворотки крови человека или гипериммунного животного, содержащей специфические анти­тела, либо гамма-глобулин (экстренная профилактика против дифте­рии, столбняка, газовой инфекции, ботулизма, клещевого энцефали­та и др.). В некоторых случаях с этой целью используются вакцины (бешенство, грипп, коклюш.и др.), чаще в сочетании с сывороточ­ными препаратами.

Сыворотки

По направленности все сывороточные препараты делятся на три группы: антитоксические, антибактериальные и антивирусные. Ан­титоксические сыворотки применяют для лечения и профилактики заболеваний, в основе которых лежит действие на организм человека продуктов жизнедеятельности микробов - токсинов (столбняк, диф­терия, газовая инфекция, ботулизм). Поэтому в их состав входят специфические антитела-анатоксины.Антибактериальные сыворотки содержат антибактериальные ан­титела, направлены против определенного вида микроба и применя­ются редко (сибиреязвенный, лептоспирозный иммуноглобулины).

Антивирусные сыворотки используются для профилактики и ле­чения бешенства, клещевого энцефалита, гриппа. Действующим на­чалом в них является наличие вируснейтрализующих антител.

Лечебно-профилактические сыворотки готовятся из крови круп­ных животных (в основном лошадей, волов, мулов) путем гиперим­мунизации соответствующим анатоксином (антитоксические) или антигеном (антимикробпые, антивирусные).

Иммуноглобулины

Иммуноглобулины - это глобулины человека и животных, вы­полняющие функцию антител. Применяются для лечения и экстрен­ной профилактики ряда инфекционных заболеваний. Представляют собой растворы гамма-глобул и но во и фракции сывороточных белков, содержащей 10±1% белка. Гамма-глобулиновая фракция составляет не менее 97% общего белка. Главным компонентом препарата явля­ется 1§С и в небольших концентрациях 1§А и 1§М.

Основным сырьем для изготовления иммуноглобулина (против си­бирской язвы, лсптоспироза, бешенства) служит иммунная сыворотка животных (в основном лошадей), гипериммунизированная соответст­вующим антигеном, а также кровь иммунизированного человека (доно­ра). Для выделения иммуноглобулина из сыворотки крови применяется несколько методов, основанных на фракционировании сывороточных белков (спиртовыи, риванол-спиртовый, риваноловый). Наибольшее распространение в условиях производства получил спиртовыи (этано-ловый) метод осаждения при температуре ниже нуля.

Реакции на введение гетерогенных сывороток

Анафилактические реакции - при введении чужеродной сыво­ротки формируется сенсибилизация организма к гетерогенному бел­ку и повторная инъекция этой же сыворотки может сопровождаться

анафилактической реакцией, вплоть до шокового состояния больно­го. Введение сенсибилизирующей дозы антигена (чужеродного бел­ка) индуцирует образование специфических антител, относящихся к классу 1§Е и 1§О, которые фиксируются на мембране тканевых ба-зофилов (тучных клеток). Попадая повторно в организм, специфиче­ский антиген вступает в иммунную реакцию с антителами, фиксиро­ванными на клетках-мишенях (тучных клетках), следствием чего являются активация протеаз клеток, дегрануляция и высвобождение биологически активных веществ (гистамин, МРС-А, серотонин и др.), вызывающих сокращение гладкомышечной мускулатуры, уве­личение проницаемости сосудов, гиперсекрецию и др. Состояние больного осложняется бронхоспазмом, кожными высыпаниями, оте­ком слизистой оболочки гортани и полости носа, сосудистым кол­лапсом. Нарастание указанных явлений может привести к анафилак­тическому шоку. Анафилактические реакции могут развиваться в течение нескольких минут после введения аллергена, реже через не­сколько часов.

Для предупреждения анафилактических осложнений создается состояние десенсибилизации путем введения в организм небольших разрешающих доз специфического антигена (например, лошадиного белка). А.М. Безредка предложено вводить сначала небольшое коли­чество сыворотки (0,5-1,0 мл) подкожно или несколько более мел­ких, но постепенно возрастающих доз внутривенно с интервалом 15-30 мин (дробное введение), затем большую, оставшуюся дозу

сыворотки.

Сывороточная болезнь развивается при введении чужеродной сыворотки в больших дозах через 7-12 дней даже при первичном введении препарата. В основе ее формирования лежит возникнове­ние нерастворимых иммунных комплексов, образованных антигеном с преципитирующими антителами. Эти комплексы оседают вокруг мелких кровеносных сосудов, повреждают их эндотелий, вызывая местные и общие тромбозы, нарушающие трофику тканей.

Продромальный период характеризуется гиперемией, увеличе­нием лимфатических узлов. В разгаре болезни наблюдаются кож­ные высыпания, лихорадка, острая эмфизема легких, артралгии, отеки слизистых оболочек, альбуминурия, лейкопения, увеличение СОЭ. Симптомы заболевания отмечаются в среднем 6-7 сут. Про­гноз благоприятный. Перенесенное заболевание не приводит к де­сенсибилизации.

Инфекционная аллергия

Аллергия - повышенная реакция организма на чужеродные аген­ты, основным запускающим механизмом которой являются иммун­ные факторы. Аллергические реакции сопровождаются повреждени­ем ткани и воспалением. Патогенез многих инфекционных заболева­ний включает в себя аллергический компонент. Интенсивность ал­лергической реакции зависит от вида возбудителя, реактивности макроорганизма и других факторов.

Инфекционные заболевания могут быть классифицированы в за­висимости от доли участия аллергии в патогенезе развития этих за­болеваний на следующие группы (Беклемишев Н.Д., 1986):

1) заболевания токсико-инфекционного характера (ботулизм, хо­лера, столбняк и др.)> при которых аллергические реакции не появ­ляются вообще;

2) острые инфекционные заболевания, которые сопровождаются аллергией, но она не играет существенной роли в патогенезе этих заболеваний (большинство острых инфекций);

3) острые инфекции (скарлатина, корь), при которых аллергиче­ский компонент участвует в патогенезе заболевания;

4) хронические инфекции с внутриклеточным паразитированием возбудителя (туберкулез, бруцеллез, актиномикоз и др.) с ярко вы­раженной аллергией;

5) инфекционно-аллергические заболевания (инфекционно-аллергическая бронхиальная астма, инфекционно-аллергический ринит и др.), при которых аллергический компонент определяет па­тогенез развития инфекций.

Способностью вызывать аллергию обладают все виды бактерий, вирусы; грибы, простейшие, гельминты. Неразрушенные бактери­альные клетки (живые или убитые) вызывают более выраженную сенсибилизацию по сравнению с растворимыми микробными аллер­генами. Среди микробных фракций особое место занимают белко­вые антигены, хотя аллергию могут вызвать также липополисахари-ды и даже вещества, обладающие свойствами гаптенов.

Возбудители многих инфекций способны вызывать аллергию. Наиболее характерны в этом плане возбудители туберкулеза, токсо-плазмоза, бруцеллеза, лепры. Установлены аллергенные свойства у пневмококков, стафилококков, энтерококков, стрептококков, ки­шечной и синегнойной палочек. Способностью к индукции аллер­гических реакций обладают многие бактериальные токсины (стафи­лококковый, дифтерийный, столбнячный и др.). Некоторые риккет-

сии (возбудитель сыпного тифа) вызывают аллергию, сохраняю­щуюся спустя два месяца после инфекционного заболевания.

Наиболее часто инфекционная аллергия развивается по типу ги­перчувствительности замедленного типа (ГЗТ). ГЗТ - это реакция воспаления, возникающая на месте локализации антигена. В реакции участвуют три типа клеток: макрофаги, Т_гзт-клетки и Т-хелперы. Попавший в макроорганизм антиген поглощается макрофагами и после внутриклеточной обработки выставляется на плазматическую мембрану этих клеток в иммуногенной форме. Т-хелперы обеспечи­вают помощь в созревании Тит-клеток, которые, получив информа­цию об аллергене от макрофагов, становятся сенсибилизированны­ми. Повторное попадание в организм антигена приводит к развитию воспалительного очага в месте его проникновения через 24-48 ч. Распознавание антигена на поверхности макрофагов либо паренхи­матозных клеток приводит к накоплению Т_Гзт-клеток, активно сек-ретирующих различные медиаторы - лимфокины (хемотаксический фактор торможения миграции макрофагов), которые привлекают к месту воспаления моноциты из ближайших кровеносных сосудов, трансформирующихся в воспалительном очаге в макрофаги. Таким образом, за счет моноцитов и лимфоцитов образуется лимфоцитар-но-макрофагальный инфильтрат. Макрофаги способны продуциро­вать медиаторы - монокины, в результате в реакцию включаются другие клеточные элементы - полинуклеары, эозинофильные и ба-зофильные гранулоциты, что приводит к полиморфно-ядерной ин­фильтрации очага воспаления.

Стафилококковый А-белок, бактериальные липополисахариды могут действовать как поликлональные активаторы В-клеток и тем самым индуцировать аллергические реакции немедленного типа(возбудитель коклюша).Развитие гиперчувствительности при инфекционных заболева­ниях позволяет использовать аллергические пробы в их экспресс-диагностике. Для выявления сенсибилизации к микробным антиге­нам при инфекционных болезнях в практике применяют стандарт­ные препараты различных возбудителей: антраксин - белково-нуклеополисахаридный комплекс палочки сибирской язвы, пестин -белково-полисахаридный комплекс возбудителя чумы, бруцеллин -фильтрат бульонной культуры бруцелл, дизентерии - белковые ве­щества дизентерийных бактерий Зонне и Флекснера, РРД (сухой очищенный туберкулин) - белковые вещества микобактерий тубер­кулеза, тулярин, лепромин содержат взвесь убитых бактерий и др. Одним из способов аллергодиагностики инфекционных заболе­ваний является постановка внутрикожной пробы на соответствую­щий аллерген. Для этого кожу внутренней поверхности предплечья протирают 70° спиртом и дают ей высохнуть. Затем, слегка оттянув кожу указательным пальцем левой руки, строго внутрикожно тубер­кулиновым шприцем вводят аллерген в количестве 0,05-0,1 мл. На расстоянии 5 см от испытуемого аллергена вводят контрольный рас­твор (раствор, на котором приготовлен аллерген). Реакцию учиты­вают через 24 ч. Если кожа остается без изменений, реакцию счита­ют отрицательной (-). При слабоположительной реакции (+) в месте введения аллергена появляется эритема. Наличие эритемы и отека оценивают как положительную реакцию (++). При резко положи­тельной реакции (+++) эритема и отек сопровождаются появлением везикул (пузырьков). Высокая степень положительной реакции (++++) выражается в обширном отеке, эритеме, везикуляции и изъ­язвлении.

Ведутся поиски новых методов выявления состояния сенсибили­зации, не сопряженных с необходимостью вводить больным анти-генсодержащие материалы. Они основаны на выявлении сенсибили­зированных клеток организма.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) представ­ляет собой феномен трансформации лимфоцитов в большие деля­щиеся клетки - бласты - под влиянием антигенного стимула, что характеризует сенсибилизацию лимфоцитов к данному аллергену.

Морфологически РБТЛ проявляется увеличением объема ядра и цитоплазмы, количества ядрышек, базофилии цитоплазмы, обуслов­ленной активацией синтеза РНК. Лимфоциты, трансформировав­шиеся в бласты, под действием антигена в первые дни культивиро­вания относятся главным образом к Т-лимфоцитам. При постановке реакции используются цельная кровь, лейкоциты, лимфоциты, от­дельные субпопуляции лимфоцитов. Оценка реакции морфологиче­ская или по включению тимидина, меченного изотопом. Учет реак­ции по стимуляции антигенами проводят на 6-е сут.

Показатель повреждения нейтрофилов (ППН) характеризует наличие сенсибилизированных гранулоцитов. Под действием спе­цифического аллергена происходит изменение функциональных особенностей (активация амебоидной активности) и биохимических (содержание гликогена) свойств нейтрофилов. В опытную пробирку вносят 0,12 мл цитратной крови больного и добавляют 0,02 мл ал­лергена. В контрольной пробирке аллерген заменен физиологиче­ским раствором. После двухчасовой инкубации в термостате при

37 °С делают мазки и красят на гликоген по Шабадашу. Просматри­вают 100 нейтрофилов в опыте и контроле. Учитывают нормальные (округлые) и поврежденные (амебоидные) клетки. Определяют ППН:

Аллергия в своей общебиологической основе - явление защит­ного характера. Аллергические реакции направлены на быстрое вы­ведение антигенов из организма, способствуют действию гумораль­ных и клеточных факторов защиты организма против бактериальных и паразитарных инфекций. В то же время в некоторых случаях ал­лергические реакции чрезмерно интенсивны, неадекватны антиген­ному воздействию и сопровождаются значительным повреждением тканей организма. В связи с этим оценка аллергических реакций с точки зрения их позитивной или негативной роли в реактивности организма неоднозначна и должна проводитъя с учетом конкретных условий их возникновения.

ОСНОВЫ ВИРУСОЛОГИИ

Морфология и методы исследования вирусов

Вирус - неклеточная форма жизни, обладающая геномом (РНК или ДНК), но лишенная собственного синтезирующего аппарата, поэтому способная к воспроизведению лишь в клетках более высо­коорганизованных существ.

По химическому составу и потенциальной патогенности вирусы называют инфекционными нуклеопротеидами. Для вирусов харак­терны две формы существования: внеклеточная (покоящаяся) и внутриклеточная (репродуцирующаяся, вегетативная). Внеклеточная форма называется вирусной частицей, или вирионом. Вирионы со­стоят из нуклеиновой кислоты, окруженной снаружи белковой обо­лочкой - капсидом (от лат. сарза - футляр). Капсид вместе с заклю­ченной в нем нуклеиновой кислотой называют нуклеокапсидом. Морфологическими субъединицами капсида, видимыми в электрон­ный микроскоп, являются капсомеры - белковые субъединицы, со­стоящие из одной или нескольких молекул белка. Существует три типа строения капсидов, основанных на расположении морфологи­ческих субъединиц (рис. 53):

3) вирионы со спиральной симметрией;

2) вирионы с кубической (икосаэдрической) симметрией;

3) вирионы, имеющие смешанный тип симметрии.

У первого типа капсомеры расположены в виде спирали, нук­леиновая кислота (преимущественно РНК) также скручена в виде пружины, располагаясь между витками белковых молекул.

У вирусов с кубической симметрией капсомеры расположены в виде правильного икосаэдра со скрученной в клубок нитью ДНК или РНК. Икосаэдр имеет 20 граней (каждая представляет собой равносторонний треугольник), 12 вершин. Общее количество капсомеров (М) можно определить по формуле

Н=10(п-1)2+2,где п - число капсомеров на одной стороне каждого равносторонне­го треугольника, которое у различных вирусов варьирует от 2 до 6. Так, аденовирус содержит 252, вирус герпеса - 162 капсомера.К третьему типу относится вирус осповакцины. Вирус имеет внешнюю оболочку, состоящую из трех слоев, под оболочкой рас­положены два белковых тела, в центре вириона находится нуклеоид, в состав которого входит ДНК и внутренний белок.Просто устроенные вирусы, такие как пикорна-, парвовирусы, состоят из нуклеокапсида; спожноустроенные вирусы имеют еще дополнительную внешнюю оболочку - суперкапсид, или- пеплос (производное мембранных структур клетки-хозяина). Форма таких вирионов приближается к сферической. Суперкапсидные белки формируют морфологические субъединицы (пепломеры), которые в электронном микроскопе выглядят как шипы (тогавирус, коронави-рус, ортомиксовирус и др.). Капсид и суперкапсид защищают вирио­ны от воздействий окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с определенными клетками, а также ан­тигенные и нммуногенные свойства вирионов (см. рис. 53). Размеры вириона колеблются от 20-30 нм (пикорна-, парвовирусы) до 150-250 нм (герпес-, рабдовирусы) и даже 350-400 нм (поксвирусы).Кроме обычных вирусов, известны и так называемые неканони­ческие вирусы: прионы и вироиды. Прионы ~ это белковые инфек­ционные частицы, имеющие вид фибрилл размером (10-20)-200 нм, они вызывают у животных и человека энцефалопатии в условиях медленной вирусной инфекции (болезнь Крейтцфельда - Якобы, куру и др.). Вироиды - это небольшие молекулы кольцевой, супер-спирализованной РНК, не содержащие белка и вызывающие заболевание растений.

Методы исследования вирусов. Для характеристики вирусных частиц широко применяют физические и физико-химические мето­ды. Пользуясь ими, можно определить размер, форму, коэффициент седиментации, коэффициент диффузии, плотность и молекулярную массу как самой вирусной частицы, так и ее компонентов.

Для определения размеров вирусных частиц используют: фильт­рование вируссодержащего материала через мембраны, ультрацен­трифугирование, электрофорез, электронную микроскопию.

Фильтрование через коллодиевые мембраны. Метод основан на пропускании вируссодержаще­го материала через мембраны с известным размером пор. Размер вирусной частицы в данном случае определяется весьма приблизи­тельно.

А - безоболочечный вирус с икасаэдрическим типом симметрии; Б - оболочеч-ный вирус с икасаэдрическим типом симметрии; В - безоболочечный вирус со спиральным типом симметрии; Г-оболочечный вирус со спиральным типом симметрии {Медицинская микробиология, 1998)

Осаждение при ультрацентрифуги­ровании. Многие способы определения размеров вирионов основаны на анализе скорости их движения в суспендирующей жид­кости. Частицы, взвешенные в жидкости, оседают с разной скоро­стью, благодаря чему компоненты взвеси можно быстро разделить центрифугированием. Скорость осаждения частицы прямо пропор­циональна разности плотности частиц и жидкости, квадрату угловой скорости и квадрату радиуса окружности и обратно пропорциональ­на вязкости жидкости. Скорость осаждения зависит от формы осе­дающих частиц. Сферическая частица радиуса г, находящаяся в жидкости с плотностью й_0з будет седиментировать в гравитацион-

ном поле или поле центробежных сил, если плотность частицы

больше, чем о\,:

г=-У9уп2'с (<!-<!,)>

где г - радиус частицы; v - скорость осаждения частицы; 1] - вяз­кость среды; с - центробежное ускорение; о! - плотность частицы; ёо- плотность жидкости. Это равенство вытекает из формулы Сто-кса и описывает движение сферических частиц в жидкости при иде­альных условиях. Величина 8=у/з называется константой седимен­тации и характеризует поведение данной частицы в данной среде при данной температуре. Константа седиментации выражается в единицах Сведберга. Одна единица Сведберга соответствует скоро­сти седиментации в воде при 20 °С под действием единицы центро­бежной силы. Так как центробежная сила, плотность среды и ее вяз­кость могут быть измерены, то можно определить радиус и массу сферической частицы при условии, если мы сможем измерить ее плотность и скорость осаждения в центрифуге. Вирусы хорошо се-диментируют в скоростных ультрацентрифугах (60000 об/мин и вы­ше). Используя аналитические роторы, в которых луч видимого или ультрафиолетового света проходит через центрифужные ячейки с прозрачными стенками, можно проводить измерения при движении центрифуги. При седиментации однородной популяции светопогло-щающих частиц (вирионов) образуется резкая подвижная граница, положение которой определяют либо непосредственно путем изме­рения поглощения света, либо по положению области, где показа­тель преломления жидкости резко изменяется.

Прямое исследование в электрон­ном микроскопе. Электронная микроскопия - наиболее широко применяемый метод определения размеров вирусных час­тиц. Для этого увеличение на электронных микрофотографиях должно быть откалибровано с помощью внутреннего маркера. С этой целью можно использовать частицы вируса табачной мозаики, имеющие среднюю длину 300 нм и шаг спирали 2,3 нм; сывороточ­ный альбумин - 5 нм; глобулин - 7 нм; гемоцианин - 23 нм. Метод исключительно быстр, прост и позволяет судить не только о размере вирионов, но и отчасти об их форме и характере симметрии.

Методы изучения морфологии вирусных частиц. Детали структуры вируса можно различить только в электронном микро­скопе (рис. 54). Широко используется метод негатив­ного к о н т р а с т и р о в а н и я . Он сводится к смешива­нию суспензий вирусных частиц с раствором соли тяжелого металла, нанесению тонкого слоя полученной суспензии на сетку из вольфрамовой пленки и высушиванию полученного препарата. Соль обра­зует плотный слой, на фоне которого материал выглядит сравни­тельно прозрачным. Обычно соль проникает в различные компонен­ты вирусной частицы неодинаково, благодаря чему возникает доста­точный контраст, способствующий выявлению тончайших деталей структуры вирусной частицы. К числу соединений, наиболее широко применяемых для негативного контрастирования, относятся уксус­нокислый и муравьинокислый уранил, кремневольфрамовокислый натрий и молибдат аммония, натриевая или калиевая соль фосфор-новольфрамовой кислоты (ФВК).

Важные сведения о структуре и морфогенезе вирусов дает также метод тонких срезов, используемый для изучения препаратов вирусов, которые находят в осадке. Для того чтобы уста­новить локализацию специфических белков в вирусной частице, применяют вспомогательные методы, например радиоавтографию, обработку тонких срезов мечеными антителами.

В ряде случаев используется действие на вирионы поверхностно-активных веществ. При этом оцениваются формы, оставшиеся после обработки, и делаются выводы о том, какие компоненты из структу­ры были удалены.

Для изучения вирусных нуклеиновых кислот используют ме­тоды гибридизации нуклеиновых кислот.

Изучение физико-химических свойств вирусов. Электрофорети-ческие методы позволяют определить специфическую физическую характеристику вирусной частицы - относительную электрофоретиче-скую подвижность под влиянием электрического поля. В противопо­ложность коэффициентам седиментации и диффузии эта величина практически не зависит от массы частицы и основывается главным образом на суммарном заряде поверхности частицы. Расчет константы электрофоретической подвижности производится по формуле 1-1 где х - удельная проводимость, О.' • см' ; ^ - поперечное сечение электрофоретической колонки, см; з - путь, пройденный частицей; I - сила тока, А; I - время пробега, с. Подвижность выражается в

см²/В/с. Классический метод электрофо­реза, или метод движущейся границы Тизелиуса, широко ис­пользуемый для анализа белков, применяется для физико-химической характеристики вирусных частиц - определения изо-электрической точки и электрофоретической подвижности.

Фронтальный электрофорез - единст­венный метод, позволяющий определить электрофоретическую под­вижность и изоэлектрическую точку с очень высокой точностью. Кроме того, этот метод широко используется при исследовании го­могенности и степени чистоты вирусных препаратов.

Еще более разрешающий метод -метод зонально­го электрофореза в градиенте плотности и в гелях. Его используют не только для изучения специфической электрофорети­ческой подвижности вирусов, их дифференцировки и идентифика­ции, но и для выделения генетически однородных штаммов и при изучении изменчивости микроорганизмов.

Методы фракционирования вирусов. Эти методы позволяют проводить дезинтегрирование вирусных частиц на отдельные ком­поненты и их фракционирование. Выделенные компоненты & даль­нейшем можно подвергнуть биохимическому анализу с целью изу­чения их тонкой структуры и свойств. Фракционирование компо­нентов вирусной частицы осуществляется при помощи центрифуги­рования в зональном и равновесном градиентах плотности, зональ­ного электрофореза и хроматографии.

Для очистки и фракционирования вирусов применяют три типа хроматографии: адсорбционную, ионообменную и молекулярно-ситовую. Раздел VII

Метод адсорбционной хроматогра-ф и и основан на различной степени адсорбции компонентов смеси при фильтровании через неподвижный твердый адсорбент. Решаю­щее значение имеют поверхностные свойства вирусной частицы и адсорбента, а также состав буфера, в котором суспендирован вирус. При элюировании соответствующим буфером вирусные частицы можно отделить от примесей. В качестве адсорбентов для наполне­ния хроматографических колонок в вирусологической практике ча­ще всего используют фосфат калия и гидроксилапатит.

При ионообменной хроматограф ии виру­сы пропускают через ионообменник. Иопообменниками называют такие соединения, которые содержат фиксированные функциональ­ные группы и подвижные противоионы. Последние могут обратимо обмениваться с другими ионами того же заряда, не изменяя физиче­ских свойств нерастворимой матрицы. Ионообменниками могут быть органические и неорганические соединения. В качестве матри­цы используются алюмосиликаты, синтетические смолы, полисаха-риды, белки и целлюлоза.

Метод молекулярно-ситовой хрома-т о г р а ф и и основан на способности пористых материалов, ра­ботающих по принципу «обратных молекулярных сит», разделять смесь веществ по размеру и молекулярной массе компонентов. В качестве таких пористых материалов применяЕот гранулированные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), полнакриламида (биогели) и пористое порошковое стекло. Метод подобного фракционирования обычно называют молекулярно-ситовой хроматографией, молеку­лярной фильтрацией или гельфильтрацией.

Физиология вирусов

Вирус является облигатным внутриклеточным паразитом, и для размножения ему требуется живая клетка. Различают три типа взаи­модействия вируса с клеткой:

1) продуктивный, или цитоцидный тип, при котором в заражен­ных клетках образуется новое поколение вирионов;

2) абортивный тип, характеризующийся прерыванием инфекци­онного процесса в клетке, поэтому новые вирионы не образуются;

3) интегративный тип, или вирогения, заключающийся в инте­грации, то есть встраивании вирусной ДНК в виде провируса в хро­мосому клетки и их совместном сосуществовании.

Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой осуществ­ляется в результате размножения, то есть репродукции вируса (от англ, гергойисе - воспроизводить). Репродукция вируса происходит в несколько стадий, различающихся у разных вирусов:

1) адсорбция вирионов на клетке;

2) проникновение вирусов в клетку;

3) депротеинизация или «раздевание» вирусов и высвобождение вирусного генома;

4) биосинтез компонентов вируса;

5) формирование вирусной частицы;

6) выход вирионов из клетки.

Вирусное инфицирование клетки начинается с адсорбции вируса на ее поверхности (рис. 55). Адсорбция вируса обеспечивается взаи­модействием его поверхностных белков со специфическими рецеп­торами чувствительных клеток. Соответствие клеточных рецепторов и поверхностных вирусных белков определяет тропизм вируса (греч. {гороз - поворот, направление), то есть способность избирательно поражать определенные клетки. Вирусы, репродуцирующиеся в клетках печени, называются гепатотропными, в клетках нервной системы - нейротроппыми и т.д.

Проникновение вируса в клетку происходит либо путем виро-пексиса (рецепторного эндоцитоза), либо слияния оболочки вируса с клеточной мембраной (при наличии белка слияния), либо в резуль­тате сочетания этих двух механизмов.

В процессе проникновения вириона в клетку при участии кле­точных ферментов происходит его депротеинизация, в результате которой удаляются поверхностные структуры вируса и высвобожда­ется его внутренний компонент (сердцевина, нуклеокапсид, нуклеи­новая кислота).

Биосинтез вирусных компонентов осуществляется в разных час­тях клетки, поэтому называется дизъюнктивным (от лат. сПзщпсйдз -разобщенный). Белки вируса синтезируются в результате транс­крипции, то есть «переписывания» информации с генома вируса на информационную РНК (иРНК) и последующей трансляции (считы­вание иРНК на рибосомах) с образованием белка вируса. Вирусная нуклеиновая кислота кодирует синтез структурных и неструктурных белков вируса. Структурные белки входят в состав вириона, а не­структурные являются ферментами и обеспечивают репродукцию вируса. Одновременно с синтезом белка в клетке происходит и реп­ликация (от лат. герНсагло - повторение), то есть синтез вирусных нуклеиновых кислот. 242