В 1814 член Петербургской АН К.С.Кирхгоф обнаружил, что вытяжка из солода вызывает превращение крахмала в простые сахара. В 50-х 19-го века Пастер пришел к выводу, что сбраживание дрожжами сахара в спирт катализируется “ферментами” (fermentum (лат.) – закваска, en zyme - в дрожжах). Считал, что неотделимы от клеток. В 1897 Бухнер получил сок из растертых дрожжей, который не содержал клеток, но был способен вызывать спиртовое брожение. Таким образом доказано, что ферменты сохраняют способность к катализу и после их выделения из живых клеток.
В 1926 впервые получен очищенный фермент в кристаллическом виде - уреаза из семян канавалии (Самнер). Целиком из белка. Общепризнанной точка зрения, что ферменты - белки - с 30-х годов, когда Нортроп и соавт. получили в кристаллическом виде пепсин и трипсин. К настоящему времени идентифицировано около 3000 ферментов.
Все известные ферменты - белки, причем активность зависит от степени сохранности нативной структуры.
Ферменты (энзимы) - высокоспециализированные белковые катализаторы. Как правило каждый тип ферментов может катализировать только один тип реакций. Значительно превосходят искусственные катализаторы по специфичности, каталитической активности и способности действовать в мягких (физиологических) условиях.
6.1. Субстратная специфичность. Механизм действия
Наиболее характерная черта ферментов как катализаторов – высокая специфичность. Структура активного центра фермента комплементарна структуре его субстрата. Вследствие этого фермент из множества соединений, присутстующих в клетке, связывается только со своим субстратом. Эту особенность называют субстратной специфичностью фермента.
Кроме того, как правило, каждый фермент может катализировать только одно определенное химическое превращение субстрата. Это свойство называют специфичностью пути превращения. Вследствие этих двух свойств ферментативные реакции в условиях смеси огромного числа неучаствующих в реакции посторонних веществ протекают со 100%-м выходом, т.е не сопровождаются образованием побочных продуктов. Этим принципиально отличаются от искусственных катализаторов: образуется один или несколько побочных продуктов (следовательно выход менее 100%), причем на каждом этапе требуется тщательная очистка промежуточного продукта.
Давно высказана гипотеза - структура молекулы субстрата или какая-то ее часть находится в точном геометрическом соответствии со структурой каталитического центра - ключ к замку. Некоторые ферменты - почти абсолютная специфичность и не взаимодействуют с даже с близкородственными молекулами. Аспартаза - обратимое присоединение иона аммония по двойной связи фумарата (водороды находятся в транс-положении)
-OOC-CH=CH-COO- + NH4+ → -OOC-CH2-CHNH2-COO- + H+
фумарат L-аспартат
Не присоединяет аминогруппу ни к одной другой кислоте, в т.ч. к цис-изомеру фумарата – малеату. Не дезаминирует глутамат, различные монокарбоновые аминокислоты, D-аспартат. Действие строго специфично.
Другие ферменты могут иметь относительно широкую специфичность – взаимодействуют со многими веществами со сходной структурой. Например, химотрипсин – гидролиз полипептидов на участках, где карбонильная группа принадлежит остаткам фенилаланина, тирозина или триптофана.
Изучение субстратной специфичности привело к идее о комплементарности субстрата и специфического участка фермента, которые подходят друг к другу как ключ к замку. К этому участку, называемому активным центром присоединяется субстрат.
Субстрат должен обладать двумя структурными особенностями. 1. Содержать специфическую химическую связь, которую бы фермент мог атаковать. 2) Содержать функциональную группу (группы), которая способна связываться с ферментом и располагать молекулу субстрата в активном центре необходимым образом. Химотрипсин: связь – пептидная, связывающая группа – ароматическая. Используя синтетические субстраты, показано, что наряду с пептидными химотрипсин способен разрушать амидные и сложноэфирные связи. В качестве связующей группы может выступать не ароматика, а насыщенные 6-членные кольца. Это означает, что связь субстрата с ферментом происходит только за счет гидрофобного взаимодействия.
Факторы, определяющие каталитическую эффективность фермента:
Сближение и ориентация. Связывает субстрат так, что связь находится не только рядом с каталитической группой, но и правильно ориентирована по отношению к ней. Сильно возрастает вероятность достижения комплексом переходного состояния.
Напряжение и деформация связи вследствие индуцированного соответствия субстрата и фермента. Присоединение субстрата может приводить к конформационным изменениям фермента. Как следствие – напряжение в структуре активного центра и деформация субстрата. В конечном счете – облегчение достижения переходного состояния. При этом возникает т.н. индуцированное соответствие фермента субстрату. Изменение третичной и четвертичной структуры фермента может играть роль механического рычага для субстрата. Иными словами, фермент фиксирует субстрат в конформации, существенно более близкой по своей геометрии к активированному комплексу реакции, чем конформация субстрата, преобладающая у несвязанных молекул.
Общий кислотно-основной катализ. В активном центре могут находиться доноры (-СООН, -N+H3, -SH…) или акцепторы (-COO-, -NH2, -S-…) протонов. Мощные катализаторы в водных растворах.
Ковалентный катализ. Некоторые ферменты реагируют со своими субстратами, образуя ковалентные очень нестабильные фермент-субстратные комплексы.
В пептидах отсутствуют какие-либо группы, способные участвовать в окислительно-восстановительном катализе. В этом случае в качестве кофакторов используются ионы металлов с переменной валентностью или специальные органические молекулы, например, гем или флавиновые коферменты (ФАД и ФМН).
Белок организует работу кофактора наиболее эффективным образом. В зависимости от структуры белка может усиливаться одна из присущих кофактору нескольких функций, в результате в разных комплексах один и тот же кофактор выполняет разные функции, как это обсуждалось при рассмотрении функционирования гема в составе гемоглобина (раздел 2.11).
-
Неферментативная реакция
Ферментативная реакция
RX + H2O → ROH + HX
RX + E-OH → ROH + EX
EX + H2O → E-OH + HX
Химическая реакция протекает тогда, когда некоторая доля молекул А в данный момент времени обладает большей энергией, чем остальная часть молекул, и этой энергии оказывается достаточно для перехода в активированное состояние, в котором появляется возможность разрыва или образования новой химической связи, ведущего к образованию продукта. Энергия активация – количество энергии, которое необходимо для перевода при данной температуре всех молекул одного моля вещества в активированное состояние. Мы не сгораем из-за потенциального барьера.
Во всякой реакции существует переходное состояние, которое характеризуется высокой свободной энергией и определяется как состояние взаимодействующих молекул, соответствующее вершине активационного барьера. Скорость реакции пропорциональна концентрации молекул в переходном состоянии. Повышение температуры – увеличение энергии теплового движения – увеличение числа молекул, способных достичь переходного состояния. Во многих реакциях – на 100С – в 2 раза.
Катализаторы (в т.ч. ферменты) ускоряют реакцию, понижая свободную энергию активации. Связывание субстрата с катализатором приводит к появлению нового переходного состояния, характеризующегося меньшей энергией активации. Образование продукта сопровождается регенерацией свободного катализатора.
В общем случае катализируемая реакция проходит по иному пути с иными промежуточными продуктами по сравнению с некатализируемой. Т.е. в организме одновременно протекают две реакции: ферментативная и неферментативная. Однако вследствие естественного отбора эффективность ферментов так высока, что скорость неферментативной реакции в тысячи или миллионы раз ниже, чем скорость ферментативной.
NO2 + SO2 → NO + SO3
NO + 1\2O2 → NO2