Тема: Микробиологическая диагностика туберкулёза и микобактериозов.

1. Место проведения: кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии.

2. Продолжительность: 135 мин из них самостоятельная аудиторная работа 80 мин.

3. Цель занятия: ознакомление с биологией возбудителей туберкулеза и микобактериозов, основами патогенеза и клиники, методами микробиологической диагностики этих заболеваний.

4. Мотивационная характеристика занятия: туберкулез, наряду с ВИЧ-инфекцией относится к глобальным проблемам современного здравоохранения. Ежегодно в мире от туберкулеза погибают 3 млн. человек и регистрируется 8-10 млн. новых случаев. Проблема усугубляется появлением и циркуляцией мультирезистентных штаммов микобактерий. Нетуберкулезные микобактерии в 30-50% случаев являются причиной вторичных инфекций у больных СПИДом. Все вышеизложенное диктует необходимость изучения возбудителей туберкулеза и микобактериозов и методов диагностик этих заболеваний.

5. В результате занятия

   1. Студент должен знать: таксономию, номенклатуру и биологию возбудителей туберкулеза и микобактериозов, основы патогенеза туберкулеза и основные клинические формы заболевания, методы микробиологической диагностики туберкулеза и микобактериозов, включая правила забора материала, его транспортировки и особенностей бактериологического исследования.

1. Студент должен уметь: выбрать материал для исследования; оценивать результаты различных микробиологических методов диагностики.

2. Студент должен ознакомиться с методическими рекомендациями и таблицами по теме, бак. препаратами.

6. Таблицы по данной теме:

• Дифференциация микобактерий;

• Морфология M. tuberculosis;

• Схема бактериологического исследования мокроты при подозрении на туберкулез.

Учебные элементы по данной схеме:

• Таксономическое положение, номенклатура и биологические свойства возбудителей туберкулеза и микобактериозов;

• Основы патогенеза и основные клинические формы туберкулеза;

• Методы микробиологи ческой диагностики туберкулеза и микобактериозов;

7. Контрольные вопросы для подготовки к занятию:

1. Таксономическое положение и биология возбудителей туберкулеза.

2. Патогенез, клинические формы туберкулеза.

3. Бактериоскопический метод: окраска мокроты по Цилю-Нильсену и люминесцентная микроскопия.

4. Культуральный метод (бактериологическое исследование).

5. Туберкулинодиагностика.

6. ПЦР-диагностика.

7. Серодиагностика.

8. Мультирезистентные штаммы M. tuberculosis.

9. Роль нетуберкулезных микобактерий в патологии человека.

8. Содержание самостоятельной работы студентов:

Виды самостоятельной работы:

• Выполнение тестового задания и решение ситуационных задач по теме

• Решение задачи – задания с оформлением протокола бактериологического исследования мокроты больного при подозрении на туберкулез легких.

• Ознакомление с направлением и материалом на исследование.

• Провести иммерсионную микроскопию готового мазка из мокроты и из колонии с окраской по Цилю-Нильсену.

• Просмотр демонстрационных посевов мокроты на среде Левенштейна-Йенсена с описанием колоний по схеме.

• Учесть биохимические свойства выделенной культуры

• Ознакомление с бак. препаратами для специфической профилактики туберкулеза.

Алгоритм целевой деятельности студентов по выполнению заданий:

Для исследования на туберкулез используется разнообразный материал. Т.к. наиболее частой формой туберкулезного поражения является туберкулез органов дыхания, основным материалом для бактериологического исследования является мокрота и другие виды отделяемого трахеобронхиального дерева. При нелегочных формах заболеваний на исследование могут поступать: кровь, смж, моча, каловые массы и др.

При исследовании мокроты первым этапом является микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену и люминесцентными красителями.

Туберкулезные микобактерии в силу строения клеточной стенки с трудом окрашиваются по Граму, обладая кислотоустойчивостью, поэтому для обнаружения микобактерий в материале используют окраску по Цилю-Нильсену. (см. зан.№2 по общей бактериологии)

Микобактерии туберкулеза окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микроорганизмы и клеточные элементы - в голубой. Данный метод микроскопии позволяет обнаружить микобактерии при содержании их не менее 5000-10000 микробных тел в 1 мл материала. Такое количество микобактерий в мокроте присутствует только при далеко зашедших прогрессирующих формах туберкулеза, тогда как на начальной стадии заболевания количество выделяемых больными микобактерий ниже предела обнаружения этим методом. Чувствительность метода можно повысить при троекратном исследовании материала (мокроты, мочи). Второй мазок из мокроты окрашивают люминесцентными красителями: аурамин О или родамин С с последующей люминесцентной микроскопией.

Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от сопутствующей гоноиродной и гнилостной микрофлоры. Микобактерии очень требовательны к питательным средам, для их роста обязательно нужны глицерин и аминокислоты. Наиболее часто используется яично-глицериновая среда Левенштейна-Йенсена, хотя могут использоваться и картофельно-глицериновые, а также синтетические среды, содержащие все необходимые компоненты. Кроме того, оптимальным условием роста микобактерий туберкулеза является большое количество кислорода. Даже в оптимальных условиях они растут очень медленно: на твердых средах M. tuberculosis - через 28 дней, M.bovis, M.africanum через 35 дней, в жидких средах видимый рост появляется через 14-16 дней. При этом возбудители туберкулеза растут только при 37^оС. Колонии различной величины и вида, морщинистые, сухие, с неровными краями, с шероховатой поверхностью, изолированные, желтоватого, или слегка кремового оттенка. Медленный рост обусловлен медленным размножением микобактерий туберкулеза – их период генерации составляет 18-24 часа, а у типичных бактерий 15-30 минут. Одной из причин столь медленного деления является их выраженная гидрофобность, связанная с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Это затрудняет поступление питательных веществ, снижая метаболическую активность клеток. Скорость роста является одним из основных дифференциально-диагностических свойств отличия возбудителей туберкулеза от быстрорастущих микобактерий. В связи с необходимостью длительного культивирования для устранения возможности роста сопутствующей микрофлоры в питательные среды добавляют анилиновые красители (бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый, метиленовый синий), к которым микобактерии проявляют устойчивость.

Во всех случаях получения роста необходимо контролировать чистоту выросшей культуры с помощью микроскопии.

Первичная идентификация микобактерий комплекса M. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам:

• Скорость роста (более 3 недель):

• Пигментообразование (колонии цвета слоновой кости);

• Выраженная кислотоустойчивая окраска.

Для дифференциации микобактерий комплекса M. tuberculosis, к которому относятся: - M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M.microti – от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять следующие основные биохимические тесты:

• Ниациновый тест. Отличительная особенность M. tuberculosis – способность к синтезу значительного количества никотиновой кислоты (ниацин), что используют для дифференциальной диагностики с другими микобактериями.

• Тест на наличие нитраредуктазы. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой от микобактерий бычьего и птичьего видов.

• Тест на наличие термостабильной каталазы. При прогревании бактерий при 68˚С в течение 20 минут микобактерий комплекса M. tuberculosis, не имеющие термостабильной каталазы, дают отрицательный результат.

• Тест на наличие способности расти на среде с салициловокислым натрием (1мг/мл). Микобактерии комплекса M. tuberculosis не обладают способностью утилизировать салициловокислый натрий, который оказывает на их рост угнетающее действие. Микобактерии комплекса не дают роста на среде с салициловокислым натрием.

Для дифференциации M. tuberculosis и M. bovis следует учитывать результаты следующих проб:

• Тест на наличие пиразинамидазы. Этот тест основан на способности M. tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. Тест применяется для дифференциации M. tuberculosis от M. bovis не проявляет пирамидазной активности.

• Рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразина тиофен-2карбоксиловой кислоты (ТСН). Тест с гидразидом тиофен-2-карбоксиловой кислотой (ТСН) используется для дифференциации M. bovis и M. tuberculosis и других медленнорастущих микобактерий. Только M. bovis чувствительны к низким концентрациям ТСН (от 1 до 5 мкг/мл) M. tuberculosis и другие микобактерии устойчивы к действию этого соединения.

Характеристика комплекса M. tuberculosis:

• Медленная скорость роста (более 3 недель);

• Температура роста в пределах 35-37˚С;

• Отсутствие пигментообразования (колонии цвета слоновой кости);

• Выраженная кислотоустойчивая окраска;

• Положительный ниациновый тест;

• Положительный нитратредуктазный тест;

• Отсутствие термостабильной каталазы(68˚С);

• Рост в присутствие 1-5 мкг/мл ТСН;

• Отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащий 1000мкг/мл салициловокислого натрия.

В настоящее время кроме классических методов культивирования M. tuberculosis сертифицированы и нашли применение следующие системы культуральной диагностики и определения лекарственной устойчивости:

• Bactec 460-TB - автоматизированная радиометрическая система. Наличие роста микобактерий может быть зафиксировано начиная с 4-5 суток от момента посева.

• BB4-mgit – система с индикацией роста по флюоресценции в ультрафиолетовом свете. Для обнаружения лекарственной устойчивости требуется от 3-х до 14 дней.

• MB/Bact.

• Bact/Alert MP Prise.