Тема 1. Техника культивирования растительного материала на искусственных питательных средах

Работа 1. ОРГАНИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Объяснение. Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы. Для удобства проведения дезинфекции полы и стены в помещениях должны иметь кафельное покрытие, а потолок должен быть побелен. Оборудование моечной комнаты: мойки с горячей и холодной водой; дис-тиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды – до 100–130оС, для инструментов – до 170оС; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хра-нения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4 98 % + K2CrO7). Оборудование комнаты для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и ви-таминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надле-жащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА). Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1–2 атмосферы и температура 120оС; стеллажи для штативов с пита-тельными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное по-мещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава. Оборудование комнаты для инокуляции растительных эксплантов на пита-тельные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования. Оборудование культуральных комнат: световое отделение – источники ос-вещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кон-диционер для регуляции температуры (25+ – 2оС) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха. Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологиче-ской лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные па-лочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хи-рургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтро-вальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.

Материалы и оборудование. Химические стаканы (50, 100, 250 мл), штативы с пробирками, инструменты (пинцеты, скальпели, препарировальные иглы), моющие средства (стиральный порошок), хромпик.

Ход работы. 1. Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории. 2. Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава, сушильных шкафов, дистиллятора. 3. Посуду тщательно отмыть в растворах детергентов (стиральный поро-шок), промыть 8–10 раз проточной водой, поместить на 4–6 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем два-жды дистиллированной и бидистиллированной. 4. Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при температуре 100–130оС. 5. Сухую посуду для хранения закрыть ватными пробками, фольгой, целлофаном.

Работа 3. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов. Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5–2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15–20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом. Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1–2 атмосферы и температурой 120оС в течении 20–60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала. Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы. Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170–250оС в течении 1–2 часов.

Материалы и оборудование. Чашки Петри, колбы с дистиллированной во-дой, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, препариро-вальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и цел-лофановая.

Ход работы. 1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при to 170–200oС в течение 2 часов. 2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав. 3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить кон-денсат в течении 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1–0,2 атм. Довести давление в стерилизационной ка-мере до 1 атм., включить автоматический режим. 4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1–1,2 атм. 5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм. 6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

Работа 4. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ

Объяснение. С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду. Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи. Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Nа, сулемой), бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями. Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5–7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5–8 минут. Гипохлорит натрия используется в виде 0,5–5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1–20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2–3 % раствор в течение 10–15 минут, а для сухих семян 3–5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают авто-клавированной дистиллированной водой. Хлорамин применяют в концентрации 1–6 %. Пыльники и молодые зароды-ши обрабатывают в течение 1–3 минут, сухие семена – 30–60 минут, затем про-мывают стерильной дистиллированной водой 2–3 раза. Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хра-нении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерили-зации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1–3 минут, для корне- и клубнеплодов – до 10–20 минут. Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их не-посредственно перед работой. Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, се-мян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте. Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, ин-фицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10–80 мг/л, ампициллин 200–400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.

Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, колбы с автоклави-рованной дистиллированной водой, флаконы со стерилизующими растворами, зерновки пшеницы и тритикале, ламинар-бокс, флакон с 96 % спиртом, вата, спиртовка, пинцеты, фильтровальная бумага.

Ход работы. 1. Отобрать 30 здоровых зерновок пшеницы или тритикале. 2. В ламинар-боксе поместить семена в чашки Петри со стерилизующими растворами по 5 семян в каждую (6 % хлорамин, 6 % гипохлорит кальция, 96 % спирт, сулема 0,1 %, ампициллин 400 мг/л, вода). Время стерилизации подоб-рать экспериментально. 3. Отмыть семена от стерилизующих растворов дистиллированной автокла-вированной водой. 4. Поместить семена для проращивания в стерильные чашки Петри на сте-рильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистил-лированной воды. Чашки Петри закрыть и перенести в термостат для проращи-вания. 5. Результаты опыта зарисовать через неделю. Сделать выводы об эффек-тивности стерилизующих растворов.

Работа 5. ТЕХНИКА РАБОТЫ В ЛАМИНАРЕ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ СТЕРИЛЬНЫХ ПРОРОСТКОВ.

Объяснение. Для культивирования стерильных проростков необходимо ис-пользовать ламинар-боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питатель-ную среду без заражения микроорганизмами. Все поверхности ламинара обрабатываются 96 % спиртом, простерилизо-ванные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ-излучение. Через 20 минут выключают УФ и вклю-чают биофильтры. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатываю 96 % спиртом. Пинцеты, скальпели и препариро-вальные иглы помещают в стакан с 96 % спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки.

Материалы и оборудование. Ламинар-бокс, пробирки с питательными сре-дами, стерильные препарировальные иглы, пинцеты, скальпели, флакон с 96 % спиртом, спиртовка, вата, 6 % раствор хлорамина, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, чашки Петри, зерновки пшеницы.

Ход работы. 1. Отобрать 10 здоровых зерновок пшеницы, поместить в 6 % раствор хло-рамина на 5 минут, промыть стерильной дистиллированной водой. 2. Зерновку поместить на стол ламинара бороздкой вниз. 3. Одной препарировальной иглой придерживать зерновку, другой – надре-зать оболочку вокруг зародыша. 4. Боковой частью иглы надавить на зародыш (на границе с эндоспермом) и вычленить его из зерновки. 5. Зародыш поместить в чашку Петри со стерильной дистиллированной во-дой. 6. Взять из штатива пробирку с питательной средой, обжечь горлышко над спиртовкой, снять пробку. Пробирку держать открытой частью от себя. 7. Препарировальной иглой перенести зародыш на поверхность питатель-ной среды щитком вниз (не заглублять). 8. Пробирку и горлышко пробирки обжечь на пламени спиртовки, пробирку закрыть. 9. Пробирки с зародышами поставить в штатив и перенести на стеллаж в культуральную комнату. 10. Проростки пшеницы зарисовать через 1–2 недели. Оценить качество по-садки.

Контрольные вопросы к теме 1. 1. Как устроена биотехнологическая лаборатория? 2. Как простерилизовать питательные среды, посуду, дистиллированную воду, инструменты, помещение лаборатории? 3. Какие стерилизующие растворы используются для растительных экс-плантов? 4. Какие вещества входят в состав питательных сред, и какую функцию они выполняют в культуре клеток и тканей in vitro? 5. Как получают стерильные проростки и для чего их используют?